Name: experimental protocol for detecting mitochondrial function in hepatocytes exposed to organochlorine pesticides
Uploaded: 2020-09-16T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Experimental Protocol for Detecting Mitochondrial Function in Hepatocytes Exposed to Organochlorine Pesticides at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (Grant Nr. 81573174, 81570574); Den udestående ungdomsfond i Jiangsu-provinsen (SBK2014010296) det kinesiske undervisningsministeriums forskningsprojekt (213015A) den prioriterede akademiske program udvikling af Jiangsu videregående uddannelsesinstitutioner (PAPD), flagskibet større udvikling af Jiangsu videregående uddannelsesinstitutioner; og det åbne projektprogram for statens nøglelaboratorium for miljøkemi og økotoksikologi (KF2015-01).

Alle eksperimenter og forsøgsprotokollerne blev udført i overensstemmelse med relevante retningslinjer og bestemmelser og godkendt af det lokale etiske udvalg ved Nanjing Medical University.
1. Mitokondriel ultrastruktur af TEM
<ol><li>Indsamling HepG2 celler<ol>
<li>Frø HepG2 celler i 100 mm retter. Opbevares ved 37 °C og 5% CO2.</li>
		<li>Fordøje celler med 0,25% EDTA i 1,5 mLEP rør.</li>
		<li>Centrifuge ved 1000 x g i 3 min. ved stuetemperatur (RT). Kassér sup...

<ol>
	<li>Rantakokko, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent+organic+pollutants+and+non-alcoholic+fatty+liver+disease+in+morbidly+obese+patients:+a+cohort+study.">Persistent organic pollutants and non-alcoholic fatty liver disease in morbidly obese patients: a cohort study.</a> Environ Health. 14, 79 (2015).</li><li>Mrema, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent+organochlorinated+pesticides+and+mechanisms+of+their+toxicity.">Persistent organochlorinated pesticides and mechanisms of their toxicity.</a> Toxicology. 307, 74-88 (2013).</li><li>Dirinck, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity+and+persistent+organic+pollutants:+possible+obesogenic+effect+of+organochlorine+pesticides+and+polychlorinated+biphenyls.">Obesity and persistent organic pollutants: possible obesogenic effect of organochlorine pesticides and polychlorinated biphenyls.</a> Obesity (Silver Spring). 19 (4), 709-714 (2011).</li><li>Genini, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+induced+by+a+SH2+domain-targeting+STAT3+inhibitor+leads+to+metabolic+synthetic+lethality+in+cancer+cells.">Mitochondrial dysfunction induced by a SH2 domain-targeting STAT3 inhibitor leads to metabolic synthetic lethality in cancer cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. , (2017).</li><li>Korovljev, D., Trivic, T., Drid, P., Ostojic, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+hydrogen+affects+body+composition,+metabolic+profiles,+and+mitochondrial+function+in+middle-aged+overweight+women.">Molecular hydrogen affects body composition, metabolic profiles, and mitochondrial function in middle-aged overweight women.</a> Ir J Med Sci. , (2017).</li><li>Gonzalez-Franquesa, A., Patti, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+Resistance+and+Mitochondrial+Dysfunction.">Insulin Resistance and Mitochondrial Dysfunction.</a> Adv Exp Med Biol. 982, 465-520 (2017).</li><li>Cheng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Proton+Leak+Plays+a+Critical+Role+in+Pathogenesis+of+Cardiovascular+Diseases.">Mitochondrial Proton Leak Plays a Critical Role in Pathogenesis of Cardiovascular Diseases.</a> Adv Exp Med Biol. 982, 359-370 (2017).</li><li>Cheville, N. F., Stasko, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+in+electron+microscopy+of+animal+tissue.">Techniques in electron microscopy of animal tissue.</a> Vet Pathol. 51 (1), 28-41 (2014).</li><li>Nazmara, Z., Salehnia, M., HosseinKhani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Distribution+and+ATP+Content+of+Vitrified,+In+vitro+Matured+Mouse+Oocytes.">Mitochondrial Distribution and ATP Content of Vitrified, In vitro Matured Mouse Oocytes.</a> Avicenna J Med Biotechnol. 6 (4), 210-217 (2014).</li><li>Clapier, C. R., Iwasa, J., Cairns, B. R., Peterson, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+action+and+regulation+of+ATP-dependent+chromatin-remodelling+complexes.">Mechanisms of action and regulation of ATP-dependent chromatin-remodelling complexes.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. , (2017).</li><li>Reitman, Z. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer-associated+isocitrate+dehydrogenase+1+(IDH1)+R132H+mutation+and+d-2-hydroxyglutarate+stimulate+glutamine+metabolism+under+hypoxia.">Cancer-associated isocitrate dehydrogenase 1 (IDH1) R132H mutation and d-2-hydroxyglutarate stimulate glutamine metabolism under hypoxia.</a> J Biol Chem. 289 (34), 23318-23328 (2014).</li><li>Nelson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+consumption+rate+v.+rate+of+energy+utilization+of+fishes:+a+comparison+and+brief+history+of+the+two+measurements.">Oxygen consumption rate v. rate of energy utilization of fishes: a comparison and brief history of the two measurements.</a> J Fish Biol. 88 (1), 10-25 (2016).</li><li>Liu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organochloride+pesticides+impaired+mitochondrial+function+in+hepatocytes+and+aggravated+disorders+of+fatty+acid+metabolism.">Organochloride pesticides impaired mitochondrial function in hepatocytes and aggravated disorders of fatty acid metabolism.</a> Sci Rep. 7, 46339 (2017).</li><li>Tien, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+Glucose+Induces+Mitochondrial+Dysfunction+in+Retinal+Muller+Cells:+Implications+for+Diabetic+Retinopathy.">High Glucose Induces Mitochondrial Dysfunction in Retinal Muller Cells: Implications for Diabetic Retinopathy.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 58 (7), 2915-2921 (2017).</li><li>Dussmann, H., Perez-Alvarez, S., Anilkumar, U., Papkovsky, D. B., Prehn, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+time-lapse+imaging+of+intracellular+O2+in+response+to+metabolic+inhibition+and+mitochondrial+cytochrome-c+release.">Single-cell time-lapse imaging of intracellular O2 in response to metabolic inhibition and mitochondrial cytochrome-c release.</a> Cell Death Dis. 8 (6), 2853 (2017).</li><li>Jaiswal, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Riluzole+But+Not+Melatonin+Ameliorates+Acute+Motor+Neuron+Degeneration+and+Moderately+Inhibits+SOD1-Mediated+Excitotoxicity+Induced+Disrupted+Mitochondrial+Ca2++Signaling+in+Amyotrophic+Lateral+Sclerosis.">Riluzole But Not Melatonin Ameliorates Acute Motor Neuron Degeneration and Moderately Inhibits SOD1-Mediated Excitotoxicity Induced Disrupted Mitochondrial Ca2+ Signaling in Amyotrophic Lateral Sclerosis.</a> Front Cell Neurosci. 10, 295 (2016).</li><li>Song, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lenti-siRNA+Hsp60+promote+bax+in+mitochondria+and+induces+apoptosis+during+heat+stress.">Lenti-siRNA Hsp60 promote bax in mitochondria and induces apoptosis during heat stress.</a> Biochem Biophys Res Commun. 481 (1-2), 125-131 (2016).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tea+tree+oil+exhibits+antifungal+activity+against+Botrytis+cinerea+by+affecting+mitochondria.">Tea tree oil exhibits antifungal activity against Botrytis cinerea by affecting mitochondria.</a> Food Chem. 234, 62-67 (2017).</li><li>Grunig, D., Felser, A., Bouitbir, J., Krahenbuhl, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+catechol-O-methyltransferase+inhibitors+tolcapone+and+entacapone+uncouple+and+inhibit+the+mitochondrial+respiratory+chain+in+HepaRG+cells.">The catechol-O-methyltransferase inhibitors tolcapone and entacapone uncouple and inhibit the mitochondrial respiratory chain in HepaRG cells.</a> Toxicol In Vitro. 42, 337-347 (2017).</li><li>Mayor, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G+protein-coupled+receptor+kinase+2+(GRK2)+as+an+integrative+signalling+node+in+the+regulation+of+cardiovascular+function+and+metabolic+homeostasis.">G protein-coupled receptor kinase 2 (GRK2) as an integrative signalling node in the regulation of cardiovascular function and metabolic homeostasis.</a> Cell Signal. , (2017).</li><li>Clark, A., Mach, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Crosstalk+between+the+Gut+Microbiota+and+Mitochondria+during+Exercise.">The Crosstalk between the Gut Microbiota and Mitochondria during Exercise.</a> Front Physiol. 8, 319 (2017).</li><li>Robicsek, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolated+Mitochondria+Transfer+Improves+Neuronal+Differentiation+of+Schizophrenia-Derived+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+and+Rescues+Deficits+in+a+Rat+Model+of+the+Disorder.">Isolated Mitochondria Transfer Improves Neuronal Differentiation of Schizophrenia-Derived Induced Pluripotent Stem Cells and Rescues Deficits in a Rat Model of the Disorder.</a> Schizophr Bull. , (2017).</li><li>Akinrotimi, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shp+deletion+prevents+hepatic+steatosis+and+when+combined+with+Fxr+loss+protects+against+type+2+diabetes.">Shp deletion prevents hepatic steatosis and when combined with Fxr loss protects against type 2 diabetes.</a> Hepatology. , (2017).</li><li>Rosa, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+insights+into+the+antioxidant+role+of+tauroursodeoxycholic+acid+in+experimental+models+of+Parkinson's+disease.">Novel insights into the antioxidant role of tauroursodeoxycholic acid in experimental models of Parkinson's disease.</a> Biochim Biophys Acta. , (2017).</li><li>Matondo, A., Kim, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted-Mitochondria+Antioxidants+Therapeutic+Implications+in+Inflammatory+Bowel+Disease.">Targeted-Mitochondria Antioxidants Therapeutic Implications in Inflammatory Bowel Disease.</a> J Drug Target. , 1-30 (2017).</li></ol>

Afgørende for detektionsprotokollens succes er brugen af en række forsøgsmetoder, der er blevet dækket undersøgelsen fra fænotype til mekanisme. I denne undersøgelse blev HepG2-celler dyrket i DMEM med penicillin og streptomycin og 10% føtalt kvægserum. Når cellerne nåede 40-50% sammenløb, β-HCH (0, 10, 100 ng/ml) blev tilføjet og inkuberet i 24 timer. Vi brugte for det første TEM, som viste de ultrastrukturelle ændringer i hepatocyte forårsaget af de repræsentative OCPs, β-HCH, viser forringelse af mi...

Virkningerne af organiske chlorpesticier (OCP' er) på sundheden,1,2,f.eks. e.g. Metoderne til at opdage cellulære stofskifte og finde ud af mitokondriel dysfunktion har gjort det muligt for forskerne at forstå den rolle, mitokondrielle funktion(dvs., mitokondrielSTAT3 niveauer, laktat, pyruvat, laktat-til-pyruvat ratio, coenzym Q10, mitokondrielle proton lækage, bioenergeti, biogenese, og dynamik) på områder som aldring, fedme, diabetes, hjerte-kar-funktion, kræft, og sikkerhedtoksicitet 4,5,6,7. I dette dokument beskriver vi metoderne til vurdering af mitokondriel dysfunktion forårsaget af OCPs.
Vi eksponerede HepG2-celler for β-hexachlorcyclohexane (β-HCH), en repræsentativ OCPs, i 24 timer ved en dosis svarende til intern eksponering af mennesker. For det første blev TEM anvendt til at observere hepatocytternes ultrastruktur, såsom kerner, mitokondrier og endoplasmatisk reticulum8. Sammenlignet med almindelige mikroskoper gør TEM det muligt at udforske 2D- og 3D-ultrastrukturen af celler og cellekomponenter (cellelinjer eller væv), morfologien, den kemiske sammensætning samt funktionen af naturlige eller kunstige materialer, der spiller en central rolle i moderne videnskab og teknologi. Mitokondriel funktion blev yderligere evalueret ved mitokondriel fluorescensintensitet, adenosin 5'-tripfosfat (ATP) niveauer, iltforbrug (OCR) og mitokondrielle membran potentiale (MMP) i HepG2 celler inkuberet med β-HCH. Mito-tracker grøn er en mitokondrier grøn fluorescerende sonde, der kan bruges til levende celle mitokondrielle-specifikke fluorescerende farvning. Mitokondrierne i hepatocytter blev plettet af mito-tracker grøn opløsning og mitokondrielle fluorescens intensitet, antal og mønster blev observeret med en konfokal mikroskopi9. Mitokondrielle grønne fluorescerende sonde kan bruges til at plette levende celler. Sammenlignet med rhodamin 123 eller JC-1, mitokondrielle grønne fluorescerende sonde afhænger ikke af mitokondrielle membran potentiale for mitokondriel farvning. ATP niveauer blev bestemt af en luciferase-luciferin kit og normaliseret ved proteinkoncentration. ATP assay kit kan bruges til at opdage ATP niveauer i fælles løsninger, celler eller væv. Dette kit er baseret på firefly luciferase katalyseret af fluorescein at generere fluorescens, når ATP er forpligtet til at levere energi. Når firefly luciferase og fluorescein er overdreven, i en vis koncentration rækkevidde, generering af fluorescens er proportional med koncentrationen af ATP. Desuden er dette kit specielt designet til at optimere chemiluminescens af ATP. ATP, som de vigtigste energimolekyler, spiller en vigtig rolle i de forskellige fysiologiske eller patologiske processer i celler. Ændringer i ATP-niveauer kan afspejle fejl i cellefunktionen, især mitokondriel energiproduktion. Normalt under apoptose, nekrose eller i nogle giftige tilstand, cellulære ATP niveauer reduceret 10. MMPs assay kit med JC-1 er et kit, der bruger JC-1 som en fluorescerende sonde til at opdage celler, væv eller renset MMPs hurtigt og følsomt. Det kan bruges til tidlig påvisning af apoptose. Det kationiske farvestof JC-1 er en fluorescerende sonde, der anvendes til at detektere MMP, som kan analyseres under flowcytometri angivet ved ændringer af grønt og rødt fluorescensforhold. Når MMP er høj, er JC-1 aggregeret i matrix af mitokondrier til at danne en polymer (J-aggregater), som producerer rød fluorescens. Når MMP er lav, JC-1 kan ikke akkumulere, og danner monomer, der producerer grøn fluorescens11. Så forholdet mellem rød og grøn fluorescens kan afspejle niveauet af MMP. OCR af celler er en afgørende indikator for normal cellulær funktion12. Det betragtes som et parameter til forskning mitokondrielle funktion. Cell mito stress test kit giver en stabil metode til at analysere centrale parametre for mitokondrielle funktion. Sættet giver kvalitetskontrol og prædiktive reagenser samt en standard metode til at udføre celle mitokondrielle stresstest. Det kan bruges til at detektere alle celletyper, herunder primære celler, cellelinjer, suspenderede celler, og også for holme, nematoder, gær og isolerede mitokondrier.
OCR-måling kan give værdifuld indsigt i cellernes fysiologiske status eller ændringer. Det blev bestemt med en ekstracellulær flux analysator til at opdage vejrtrækning baseline, proton lækage, maksimal respiratorisk, ATP omsætning og reservekapacitet. Kort sagt, efter baseline målinger af OCR, OCR blev påvist efter sekventielt at tilføje til oligomycin (ATP Coupler), FCCP (mitokondriel oxidativ fosforylation uncoupler) og antimycin A/rotenon (en hæmmer af iltforbrug) per brønd.
I et forsøg på at lette udviklingen af mere specifik protokol til påvisning mitokondriel funktion i hepatocytter in vitro, præsenterer vi her eksperimenter med TEM, konfokal mikroskopi, luminometer, flow cytometri og ekstracellulære flux analysator med fremtidig anvendelse i at studere mitokondrier skader relaterede negative resultater.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:756px;" width="755">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td>Transmission electron microscope&#160;</td>
			<td>FEI</td>
			<td>Tecnai G2 Spirit Bio TWIN</td>
			<td>High-contrast, high-resolution imaging, Low-dose observation and imaging, Low-temperature observation, Outstanding analytical performance, Automation for convenience and performance</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:205px;">Mito-Tracker Green</td>
			<td style="width:69px;">Beyotime</td>
			<td style="width:161px;">C1048</td>
			<td style="width:320px;">Mito-Tracker Green is a mitochondrial green fluorescent probe that can be used for live cell mitochondrial-specific fluorescent staining.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="105" style="height:105px;width:205px;">Laser scanning confocal microscope</td>
			<td style="width:69px;">Zeiss</td>
			<td style="width:161px;">700B</td>
			<td style="width:320px;">The design is compact, stable, light path is the shortest, high light precision, creative technology and sophisticated scanning technology together to&#160; produce a perfect 3-dimensional specimen image.</td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:205px;">Enhanced ATP Assay Kit</td>
			<td style="width:69px;">Beyotime</td>
			<td style="width:161px;">S0027</td>
			<td style="width:320px;">Enhanced ATP Assay Kit can be used to detect ATP (adenosine 5&#39;-triphosphate) levels in common solutions, cells or tissues. Cells and tissue samples can be split to complete the sample preparation, detection sensitivity up to 0.1nmol / L, chemiluminescence can be sustained for 30 minutes.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:205px;">Luminometer</td>
			<td style="width:69px;">Berthold</td>
			<td style="width:161px;">Centro LB 960</td>
			<td style="width:320px;">Luminometer is chemiluminescence detector, the test sample itself can be light, do not need to stimulate. Luminometer is the instrument that detects chemiluminescence.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:205px;">BCA Protein Assay Kit</td>
			<td style="width:69px;">Beyotime</td>
			<td style="width:161px;">P0012</td>
			<td style="width:320px;">BCA Protein Assay Kit is one of the most commonly used methods for detecting protein concentrations.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="42" style="height:42px;width:205px;">Multimode reader</td>
			<td style="width:69px;">TECAN</td>
			<td style="width:161px;">InfiniteM200</td>
			<td style="width:320px;">Multimode reader be used to detect protein consentration.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

experimental protocol for detecting mitochondrial function in hepatocytes exposed to organochlorine pesticides

Dette papir præsenterer detaljerede metoder til påvisning af hepatisk mitokondriel funktion for en bedre forståelse af årsagen til metaboliske lidelser forårsaget af miljømæssige organochlorin pesticider (OCPs) i hepatocytter. HepG2-celler blev eksponeret for β-hexachlorcyclohexan (β-HCH) i 24 timer ved en tilsvarende dosis intern eksponering i den almindelige population. Ultrastruktur i hepatocytter blev undersøgt ved transmission elektron mikroskopi (TEM) for at vise skaderne af mitokondrier. Mitokondriel funktion blev yderligere evalueret ved mitokondriel fluorescensintensitet, adenosin 5'-tripfosfat (ATP) niveauer, iltforbrug (OCR) og mitokondrielle membran potentiale (MMP) i HepG2 celler inkuberet med β-HCH. Mitokondrier fluorescens intensitet efter plettet af mitokondrielle grønne fluorescerende sonde blev observeret med en fluorescens mikroskopi. Luciferin-luciferase-reaktionen blev brugt til at bestemme ATP-niveauerne. MMP blev opdaget af det kationiske farvestof JC-1 og analyseret under flow cytometri. OCR blev målt med en ekstracellulær flux analysator. Sammenfattende, disse protokoller blev brugt til at opdage mitokondriel funktion i hepatocytes med at undersøge mitokondrier skader.

Mitokondrier cristae af HepG2 celler udsat for β-HCH blev markant beskadiget. Spredte mitokondrier var mildt til markant udvidet, uregelmæssigt formet, og mitokondrielle højderyg forsvandt med relativt unormal mitokondriel arkitektur (Figur 1).
Den gennemsnitlige mitokondrielle grønne fluorescensintensitet, som repræsenterer mitokondrier, faldt i HepG2-celler, der blev eksponeret for β-HCH (<s...

Watch this Scientific Journal Video about Experimental Protocol for Detecting Mitochondrial Function in Hepatocytes Exposed to Organochlorine Pesticides at JoVE.com

Experimental Protocol for Detecting Mitochondrial Function in Hepatocytes Exposed to Organochlorine Pesticides (Video) | JoVE

Forståelse af indflydelsen af miljømæssige organochlorin pesticider (OCPs) på mitokondriel funktion i hepatocytes er vigtigt at udforske mekanismen af OCPs forårsager metaboliske lidelser. Dette papir præsenterer detaljerede metoder til påvisning af hepatisk mitokondriel funktion.

Eksperimentel protokol til påvisning af mitokondriel funktion i hepatocytter udsat for organochlorpe pesticider

This paper presents detailed methods on detecting hepatic mitochondrial function for a better understanding the cause of metabolic disorders caused by ...

Det er en messer, der kalder besvare et centralt spørgsmål, som du har i også en funktion af området som ATP-niveau og iltforbrug satser. Den nye eller den ene side gamle, denne teknik er, at det er nemt at udføre, og det er en masse for en særlig evaluering af cellulære mitokondrielle funktion. For at starte dette eksperiment, frø 20, 000 HepG2 celler i et glas bund Petriskål.Tilsæt beta-hexachlorcyclohexan eller B-HCH i inkubator ved 37 grader Celsius og fem procent CO2 i 24 timer. Forbered en millimolar mitokondriel grøn fluorescens sonde løsning ved at tilføje vandfri DMSO til DMEM cellekultur medium. Derefter tilsættes en milliliter pr fad af denne opløsning til cellerne i glasbund petriskåle.Og inkubere ved 37 grader Celsius i 45 minutter. Efter inkubation fjernes mitokondrielle grønne lysstofrøropløsning fra cellerne. Tilsæt en milliliter pr fad frisklavet ved 37 grader Celsius DMEM cellekultur medium.For at opdage grøn fluorescens i mitokondrier, observere cellerne under et konfokal mikroskop. At vurdere niveauet af cellulære ATP, frø til 20, 000 HepG2 celler i seks brøndplader. Tilsæt beta-HCH og inkubere ved 37 grader Celsius i 24 timer.Tilføj 200 mikroliter lysis buffer til cellerne i hver brønd. Centrifuge ved 12,000 gange G i fem minutter ved fire grader Celsius, og fortsæt med at indsamle supernatant som beskrevet i tekstprotokollen. Tilføj 100 mikroliters ATP-detektionsbuffer til pladen.Tilføj 100 mikroliter af indsamlet celle supernatant til en 96 brøndplade ved stuetemperatur og fortsatte med at detektere cellulære ATP ved et luminometer som beskrevet i tekstprotokollen. Til vurdering af mitokondriel membran potentiale, vokse HepG2 celler i seks brønd plader med tilsætning af beta-HCH, som tidligere beskrevet. Indsamle cellerne ved at fordøje dem med 0,5 milliliter 0,25% EDTA i et minut ved 37 grader Celsius.Der tilsættes en milliliter DMEM for at stoppe fordøjelsen og overføre de fordøjede celler til 1,5 milliliterrør. Centrifuge rørene ved 1000 gange G i tre minutter, og kassér derefter supernatanten. Cellepellet fortyndes med 0,5 milliliter cellekulturmedium og 0,5 milliliter JC1 mitokondriemembran potentiel farvestof.Og inkubere i 20 minutter ved 37 grader Celsius. Dernæst centrifuge rør på 600 gange G i tre minutter ved fire grader Celsius, og derefter vaske celle pellet i henhold til teksten protokol. Efter centrifugering af vasket pellet, fjerne supernatant.Og re-suspendere pellet i 0,5 milliliter JC1 farvning buffer. Analysér JC1 farvede celler via flow cytometri at opdage grøn og rød fluorescens. Når JC1 monomer detekteres, indstilles excitationslyset til 490 nanometer og emissionslyset til 530 nanometer.Når JC1-polymeren detekteres, indstilles excitationslyset til 525 nanometer og emissionslyset til 590 nanometer. At analysere iltforbrug sats, frø HepG2 celler i en 96 godt celle kultur plade i en tæthed på 4, 500 celler pr 100 mikroliter per brønd. Efter 24 timers inkubation ved 37 grader Celsius, sørg for, at cellerne i hver brønd er dækket med medium.Før OCR-softwaren køres, skal mikropladen med patron og cellekulturpladen indlæses i en ekstracellulær fluxanalysator som beskrevet i tekstprotokollen. Åbn OCR-softwaren, og vælg celle mito stresstestsæt i app-rullemenuen i apps, og klik på startappknappen. Klik derefter på stresstestknappen.Når celle stresstest skærmen vises, skal du indtaste antallet af celler såning per brønd i cellen såning nummer boks og den gennemsnitlige OCR i gennemsnittet på basal celle OCR boks. Den endelige arbejdskoncentration for hvert reagens ind, og injicer derefter reagenserne. Klik på den næste knap.Når skærmbilledet gruppeoplysninger vises, skal du tildele en gruppe til ikke-tildelte brønde ved at vælge en farve og give et navn. Klik derefter på de relevante brønde. Klik på den næste knap og i stresstest injektion layout skærm, der vises, skal du klikke på start for at køre stresstest på analysatoren.Når det er gennemført, skal du følge instruktionerne i softwaren og derefter fjerne patronen og cellepladen. Den gennemsnitlige intensitet af mitokondriel grøn fluorescerende farvning faldt i HepG2-celler, der blev eksponeret for beta-HCH. Dette viser, at der er et fald i mitokondrielt antal og stigning i beskadigede mitokondrier i overensstemmelse med stigningen i pesticidkoncentrationen.Desuden faldt ATP-niveauerne i HepG2-celler med de øgede koncentrationer af beta-HCH-eksponering, hvilket viste den nedsat funktion af mitokondrier i disse celler. Efter JC1 farvning for mitokondrielle membran potentiale, eller MMP, flow cytometer viste høj rød grøn JC1 fluorescens i intakt HepG2 celler. Dette skyldtes tilstedeværelsen af røde fluorescerende JC1 aggregater, som er et tegn på høj MMP.I celler behandlet med beta-HCH faldt den rødgrønne JC1-fluorescens på grund af tilstedeværelsen af grønne fluorescerende JC1 monomerer, et tegn på lav MMP. Endelig faldt iltforbruget også med de øgede koncentrationer af beta-HCH eksponering, hvilket yderligere viser, at dette pesticid svækker korrekt mitokondriel funktion. Åh, ja, forsøg på at denne procedure, er det vigtigt selv, at huske at se, at cellerne som passende at teste det.Efter dens udvikling, dette absolut baner en måde for forsker inden for grundlæggende funktion til at udforske relevante organismer i den medicinske rolle forbundet med det. Efter at have set denne video, bør du have en god forståelse af, hvordan du registrerer en mængde eller kvalitet, kapacitet, nu medlem eller potentiale under tudse ark funktion.

Research

JoVE Journal

Environment

Experimental Protocol for Detecting Mitochondrial Function in Hepatocytes Exposed to Organochlorine Pesticides

Experimental Protocol for Manipulating Plant-induced Soil Heterogeneity

Experimental Protocol for Manipulating Plant-induced Soil Heterogeneity (Video) | JoVE

Eksperimentel protokol til at manipulere Plant-induceret Soil Heterogenitet

Coexistence theory has often treated environmental heterogeneity as being independent of the community composition; however biotic feedbacks such as ...

A Protocol for Conducting Rainfall Simulation to Study Soil Runoff

A Protocol for Conducting Rainfall Simulation to Study Soil Runoff (Video) | JoVE

En protokol til Gennemførelsen Rainfall Simulering til Studieinformationen Jord Afstrømning

Rainfall is a driving force for the transport of environmental contaminants from agricultural soils to surficial water bodies via surface runoff. The ...

Administering and Detecting Protein Marks on Arthropods for Dispersal Research

Administering and Detecting Protein Marks on Arthropods for Dispersal Research (Video) | JoVE

Administrere og Detektering Protein Marks på Leddyr til Dispersal Forskning

Monitoring arthropod movement is often required to better understand associated population dynamics, dispersal patterns, host plant preferences, and other ...

LC-MS Analysis of Human Platelets as a Platform for Studying Mitochondrial Metabolism

LC-MS Analysis of Human Platelets as a Platform for Studying Mitochondrial Metabolism (Video) | JoVE

LC-MS analyse af humane blodplader som en platform for at studere Mitokondriel Metabolism

Perturbed mitochondrial metabolism has received renewed interest as playing a causative role in a range of diseases. Probing alterations to metabolic ...

Characterization and Application of Passive Samplers for Monitoring of Pesticides in Water

Characterization and Application of Passive Samplers for Monitoring of Pesticides in Water (Video) | JoVE

Karakterisering og anvendelse af passive samplere for Overvågning af pesticider i vand

Five different water passive samplers were calibrated under laboratory conditions for measurement of 124 legacy and current used pesticides. This study ...

Experimental Protocol for Biodiesel Production with Isolation of Alkenones as Coproducts from Commercial Isochrysis Algal Biomass

Experimental Protocol for Biodiesel Production with Isolation of Alkenones as Coproducts from Commercial Isochrysis Algal Biomass (Video) | JoVE

Eksperimentel Protokol for Biodiesel Production med Isolering af Alkenones som sam-produkter fra Commercial<em&gt; Isochrysis</em&gt; Algebiomassen

The need to replace petroleum fuels with alternatives from renewable and more environmentally sustainable sources is of growing importance. ...

Experimental Protocol for Detecting Cyanobacteria in Liquid and Solid Samples with an Antibody Microarray Chip

Experimental Protocol for Detecting Cyanobacteria in Liquid and Solid Samples with an Antibody Microarray Chip (Video) | JoVE

Eksperimentel protokol til påvisning<em&gt; Cyanobakterier</em&gt; I flydende og faste Prøver med et antistof mikroarraychippen

Global warming and eutrophication make some aquatic ecosystems behave as true bioreactors that trigger rapid and massive cyanobacterial growth; this has ...

Extraction of Organochlorine Pesticides from Plastic Pellets and Plastic Type Analysis

Extraction of Organochlorine Pesticides from Plastic Pellets and Plastic Type Analysis (Video) | JoVE

Ekstraktion af organiske chlorpesticider fra plastpellets og plasttypeanalyse

Plastic resin pellets, categorized as microplastics (&#8804;5 mm in diameter), are small granules that can be unintentionally released to the environment ...

Video Tracking Protocol to Screen Deterrent Chemistries for Honey Bees

Video Tracking Protocol to Screen Deterrent Chemistries for Honey Bees (Video) | JoVE

Video Tracking Protocol til Screen Deterrent Chemistries for honningbier

The European honey bee, Apis mellifera L., is an economically and agriculturally important pollinator that generates billions of dollars annually. Honey ...

Dispersion of Nanomaterials in Aqueous Media: Towards Protocol Optimization

Dispersion of Nanomaterials in Aqueous Media: Towards Protocol Optimization (Video) | JoVE

Spredning af nanomaterialer i vandige medier: mod protokollen optimering

The sonication process is commonly used for de-agglomerating and dispersing nanomaterials in aqueous based media, necessary to improve homogeneity and ...