Name: experimental protocol for detecting mitochondrial function in hepatocytes exposed to organochlorine pesticides
Uploaded: 2020-09-16T12:30:00
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Ce travail a été soutenu par la National Natural Science Foundation of China (Grant Nos. 81573174, 81570574); le Fonds pour la jeunesse exceptionnel de la province du Jiangsu (SBK2014010296); le projet de recherche du ministère chinois de l’Éducation (213015A); le programme académique prioritaire de développement des établissements d’enseignement supérieur du Jiangsu (PAPD), le développement majeur phare des établissements d’enseignement supérieur du Jiangsu; et le programme de projet ouvert du Laboratoire d’État clé de chimie environnementale et d’écotoxicologie (KF2015-01).

Toutes les expériences et les protocoles d’expérience ont été réalisés conformément aux lignes directrices et règlements pertinents et approuvés par le Comité d’éthique local de l’Université médicale de Nanjing.
1. Ultrastructure mitochondriale par TEM
<ol><li>Collecte des cellules HepG2<ol>
<li>Seed HepG2 cellules dans des plats de 100 mm. Conserver à 37 °C et 5 % de CO2.</li>
		<li>Digester les cellules avec 0,25% EDTA dans le tube de 1,5 mLEP.</li>
		<li>Ce...

<ol>
	<li>Rantakokko, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent+organic+pollutants+and+non-alcoholic+fatty+liver+disease+in+morbidly+obese+patients:+a+cohort+study.">Persistent organic pollutants and non-alcoholic fatty liver disease in morbidly obese patients: a cohort study.</a> Environ Health. 14, 79 (2015).</li><li>Mrema, E. 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I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+insights+into+the+antioxidant+role+of+tauroursodeoxycholic+acid+in+experimental+models+of+Parkinson's+disease.">Novel insights into the antioxidant role of tauroursodeoxycholic acid in experimental models of Parkinson's disease.</a> Biochim Biophys Acta. , (2017).</li><li>Matondo, A., Kim, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted-Mitochondria+Antioxidants+Therapeutic+Implications+in+Inflammatory+Bowel+Disease.">Targeted-Mitochondria Antioxidants Therapeutic Implications in Inflammatory Bowel Disease.</a> J Drug Target. , 1-30 (2017).</li></ol>

L’utilisation d’une variété de méthodes expérimentales qui ont été couvertes par le phénotype au mécanisme est essentielle au succès du protocole de détection. Dans cette étude, les cellules d’HepG2 ont été cultivées dans DMEM avec la pénicilline et la streptomycine et le sérum bovin foetal de 10%. Lorsque les cellules ont atteint 40-50% confluence, β-HCH (0, 10, 100 ng/mL) ont été ajoutés et incubés pendant 24 h. Nous avons d’abord utilisé TEM qui a montré les changements ultrastructuraux ...

Les effets des pesticides organochlorés (PCO) sur la santé, par exemple l’interférence reproductrice, la toxicité immunologique, les changements métaboliques ont été précédemment étudiés1,2,3. Les méthodes pour détecter le métabolisme cellulaire et découvrir le dysfonctionnement mitochondrial ont permis aux scientifiques de comprendre le rôle de la fonction mitochondriale(c.-à-d., niveaux de STAT3 mitochondrial, lactate, pyruvate, rapport lactate-pyruvate, coenzyme Q10, fuite de protons mitochondrials, bioénergétique, biogenèse, et dynamique) dans des domaines tels que le vieillissement, l’obésité, le diabète, la fonction cardiovasculaire, le cancer, et la toxicité de sécurité4,5,6,7. Dans cet article, nous décrivons les méthodes sur l’évaluation du dysfonctionnement mitochondrial provoqué par les OCP.
Nous avons exposé les cellules hepG2 à β-hexachlorocyclohexane (β-HCH), un OCP représentatif, pendant 24 h à une dose équivalente à l’exposition interne de l’homme. Tout d’abord, TEM a été appliqué pour observer l’ultrastructure des hépatocytes, tels que les noyaux, les mitochondries et le réticulum endoplasmique8. Par rapport aux microscopes ordinaires, TEM permet d’explorer l’ultra-structure 2D et 3D des cellules et des composants cellulaires (lignées cellulaires ou tissu), la morphologie, la composition chimique, ainsi que la fonction des matériaux naturels ou artificiels qui jouent un rôle central dans la science et la technologie modernes. La fonction mitochondriale a été évaluée par l’intensité de fluorescence mitochondriale, les niveaux d’adénosine 5'-triphosphate (ATP), le taux de consommation d’oxygène (OCR) et le potentiel memitorial de membrane (MMP)dans les cellules d’HepG2 incubées avec β-HCH. Mito-tracker vert est une sonde fluorescente verte mitochondries qui peut être utilisée pour la coloration fluorescente spécifique aux cellules vivantes. Les mitochondries dans les hépatocytes ont été tachées par la solution verte de mito-tracker et l’intensité de fluorescence mitochondriale, le nombre et le modèle ont été observés avec une microscopie confocale9. La sonde fluorescente verte mitochondriale peut être employée pour tacher des cellules vivantes. Par rapport à la rhodamine 123 ou à JC-1, la sonde fluorescente vert mitochondrial ne dépend pas du potentiel de membrane mitochondriale pour la coloration mitochondriale. Les niveaux d’ATP ont été déterminés par un kit de luciferase-luciferin et normalisés par la concentration de protéine. Le kit d’essai ATP peut être utilisé pour détecter les niveaux d’ATP dans les solutions, cellules ou tissus courants. Ce kit est basé sur luciferase de luciferase de lucfly catalysé par la fluorescéine pour produire la fluorescence, quand l’ATP est nécessaire pour fournir l’énergie. Lorsque la luciferase et la fluorescéine de lucfly sont excessives, dans une certaine plage de concentration, la génération de fluorescence est proportionnelle à la concentration d’ATP. En outre, ce kit a été spécialement conçu pour optimiser la chemiluminescence de l’ATP. L’ATP, en tant que molécules énergétiques les plus importantes, joue un rôle important dans les différents processus physiologiques ou pathologiques des cellules. Les changements dans les niveaux d’ATP peuvent refléter des défauts dans la fonction cellulaire, particulièrement la production d’énergie mitochondriale. Habituellement sous apoptose, nécrose ou dans un état toxique, les niveaux d’ATP cellulaire réduit 10. Le kit d’analyse MMP avec JC-1 est un kit qui utilise JC-1 comme sonde fluorescente pour détecter les cellules, les tissus ou les MMP purifiés rapidement et avec sensibilité. Il peut être utilisé pour la détection précoce de l’apoptose. Le colorant cationique JC-1 est une sonde fluorescente utilisée pour détecter le MMP qui peut être analysée sous cytométrie de débit indiquée par des changements de rapport de fluorescence vert et rouge. Lorsque le MMP est élevé, le JC-1 est agrégé dans la matrice des mitochondries pour former un polymère (agrégats J), qui produit de la fluorescence rouge. Lorsque le MMP est faible, JC-1 ne peut pas s’accumuler, et forme monomère qui produit la fluorescence verte11. Ainsi, le rapport de fluorescence rouge et vert peut refléter le niveau de MMP. L’OCR des cellules est un indicateur crucial de la fonction cellulaire normale12. Il est considéré comme un paramètre pour la recherche de la fonction mitochondriale. Cell mito stress test kit fournit une méthode stable pour analyser les paramètres clés de la fonction mitochondriale. Le kit fournit le contrôle de la qualité et les réactifs prédictifs ainsi qu’une méthode standard pour effectuer le test de stress mitochondrial cellulaire. Il peut être utilisé pour détecter tous les types de cellules, y compris les cellules primaires, les lignées cellulaires, les cellules en suspension, et aussi pour les îlots, les nématodes, les levures et les mitochondries isolées.
La mesure de l’OCR peut fournir un aperçu précieux de l’état physiologique ou des altérations des cellules. Il a été déterminé avec un analyseur de flux extracellulaire pour détecter la ligne de base de respiration, la fuite de proton, la respiration maximale, le chiffre d’affaires d’ATP et la capacité de réserve. En bref, après des mesures de base de l’OCR, l’OCR a été détecté après avoir ajouté séquentiellement à l’oligomycine (ATP Coupler), FCCP (phosphorylation oxydative mitochondriale uncoupler) et antimycine A/roténone (un inhibiteur de la consommation d’oxygène) par puits.
Dans un effort pour faciliter le développement d’un protocole plus spécifique pour détecter la fonction mitochondriale chez les hépatocytes in vitro, nous présentons ici des expériences par TEM, microscopie confocale, luminomètre, cytométrie de flux et analyseur de flux extracellulaire avec application future dans l’étude des dommages mitochondries effets indésirables connexes.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:756px;" width="755">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td>Transmission electron microscope&#160;</td>
			<td>FEI</td>
			<td>Tecnai G2 Spirit Bio TWIN</td>
			<td>High-contrast, high-resolution imaging, Low-dose observation and imaging, Low-temperature observation, Outstanding analytical performance, Automation for convenience and performance</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:205px;">Mito-Tracker Green</td>
			<td style="width:69px;">Beyotime</td>
			<td style="width:161px;">C1048</td>
			<td style="width:320px;">Mito-Tracker Green is a mitochondrial green fluorescent probe that can be used for live cell mitochondrial-specific fluorescent staining.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="105" style="height:105px;width:205px;">Laser scanning confocal microscope</td>
			<td style="width:69px;">Zeiss</td>
			<td style="width:161px;">700B</td>
			<td style="width:320px;">The design is compact, stable, light path is the shortest, high light precision, creative technology and sophisticated scanning technology together to&#160; produce a perfect 3-dimensional specimen image.</td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:205px;">Enhanced ATP Assay Kit</td>
			<td style="width:69px;">Beyotime</td>
			<td style="width:161px;">S0027</td>
			<td style="width:320px;">Enhanced ATP Assay Kit can be used to detect ATP (adenosine 5&#39;-triphosphate) levels in common solutions, cells or tissues. Cells and tissue samples can be split to complete the sample preparation, detection sensitivity up to 0.1nmol / L, chemiluminescence can be sustained for 30 minutes.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:205px;">Luminometer</td>
			<td style="width:69px;">Berthold</td>
			<td style="width:161px;">Centro LB 960</td>
			<td style="width:320px;">Luminometer is chemiluminescence detector, the test sample itself can be light, do not need to stimulate. Luminometer is the instrument that detects chemiluminescence.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:205px;">BCA Protein Assay Kit</td>
			<td style="width:69px;">Beyotime</td>
			<td style="width:161px;">P0012</td>
			<td style="width:320px;">BCA Protein Assay Kit is one of the most commonly used methods for detecting protein concentrations.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="42" style="height:42px;width:205px;">Multimode reader</td>
			<td style="width:69px;">TECAN</td>
			<td style="width:161px;">InfiniteM200</td>
			<td style="width:320px;">Multimode reader be used to detect protein consentration.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

experimental protocol for detecting mitochondrial function in hepatocytes exposed to organochlorine pesticides

Cet article présente des méthodes détaillées sur la détection de la fonction mitochondriale hépatique pour une meilleure compréhension de la cause des troubles métaboliques causés par les pesticides organochlorés environnementaux (PCO) chez les hépatocytes. Les cellules d’hépG2 ont été exposées à l’β-hexachlorocyclohexane (β-HCH) pendant 24 h à une dose équivalente d’exposition interne dans la population générale. L’ultrastructure dans les hépatocytes a été examinée par microscopie électronique de transmission (TEM) pour montrer les dommages des mitochondries. La fonction mitochondriale a été évaluée par l’intensité de fluorescence mitochondriale, les niveaux d’adénosine 5'-triphosphate (ATP), le taux de consommation d’oxygène (OCR) et le potentiel memitorial membranaire (MMP) dans les cellules d’HepG2 incubées avec β-HCH. L’intensité de fluorescence de mitochondries après tachée par la sonde fluorescente verte mitochondriale a été observée avec une microscopie de fluorescence. La réaction de luciferin-luciferase a été employée pour déterminer des niveaux d’ATP. Le MMP a été détecté par le colorant cationique JC-1 et analysé sous cytométrie de flux. L’OCR a été mesuré avec un analyseur de flux extracellulaire. En résumé, ces protocoles ont été utilisés dans la détection de la fonction mitochondriale dans les hépatocytes avec pour étudier les dommages mitochondries.

Les cristae mitochondries des cellules hepG2 exposées au β-HCH ont été nettement endommagées. Les mitochondries dispersées ont été légèrement étendues, de forme irrégulière, et la crête mitochondriale a disparu avec l’architecture mitochondriale relativement anormale (figure 1).
L’intensité moyenne de fluorescence vert mitochondrial, qui représente les mitochondries, a diminué d...

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Experimental Protocol for Detecting Mitochondrial Function in Hepatocytes Exposed to Organochlorine Pesticides

Comprendre l’influence des pesticides organochlorés environnementaux (PCO) sur la fonction mitochondriale dans les hépatocytes est important dans l’exploration du mécanisme des PCO causant des troubles métaboliques. Cet article présente des méthodes détaillées sur la détection de la fonction mitochondriale hépatique.

Protocole expérimental pour la détection de la fonction mitochondriale chez les hépatocytes exposés aux pesticides organochlorés

This paper presents detailed methods on detecting hepatic mitochondrial function for a better understanding the cause of metabolic disorders caused by ...

C’est un messer qui appellent répondre à une question clé que vous avez aussi dans une fonction de domaine tels que le niveau ATP et les taux de consommation d’oxygène. La nouvelle ou la vieille d’une page, cette technique est qu’il est facile à effectuer et c’est beaucoup pour une évaluation spéciale de la fonction mitochondriale cellulaire. Pour commencer cette expérience, grainez 20 000 cellules HepG2 dans une boîte de Pétri à fond de verre.Ajouter le bêta-hexachlorcyclohexane ou le B-HCH dans l’incubateur à 37 degrés Celsius et cinq pour cent de CO2 pendant 24 heures. Préparez une solution millimolaire de sonde verte de fluorescence mitochondriale en ajoutant le DMSO anhydre au milieu de culture cellulaire de DMEM. Ajouter ensuite un millilitre par plat de cette solution aux cellules dans des boîtes de Pétri à fond de verre.Et incuber à 37 degrés Celsius pendant 45 minutes. Après l’incubation, retirer la solution de sonde fluorescente verte mitochondriale des cellules. Ajouter un millilitre par plat de milieu de culture cellulaire DMEM fraîchement préparé à 37 degrés Celsius.Pour détecter la fluorescence verte dans les mitochondries, observez les cellules au microscope confocal. Pour évaluer les niveaux d’ATP cellulaire, les graines à 20 000 cellules HepG2 dans six plaques de puits. Ajouter le bêta-HCH et l’incubation à 37 degrés Celsius pendant 24 heures.Ajouter 200 microlitres de tampon de lyse aux cellules de chaque puits. Centrifugeuse à 12 000 fois G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius, et procéder à la collecte de supernatant comme décrit dans le protocole de texte. Ajouter 100 microlitres tampon de détection ATP à la plaque.Ajouter 100 microlitres de supernatant cellulaire collecté à une plaque de puits de 96 à température ambiante et a procédé à la détection de l’ATP cellulaire par un luminomètre tel que décrit dans le protocole de texte. Pour l’évaluation du potentiel memitochondrial de membrane, cultivez des cellules d’HepG2 dans six plaques de puits avec l’addition de bêta-HCH, comme précédemment décrit. Recueillir les cellules en les digérant avec 0,5 millilitres 0,25%EDTA pendant une minute à 37 degrés Celsius.Ajouter un millilitre de DMEM pour arrêter la digestion et transférer les cellules digérées dans des tubes de 1,5 millilitre. Centrifuger les tubes à 1000 fois G pendant trois minutes, puis jeter le supernatant. Diluer la pastille cellulaire avec 0,5 millilitres de milieu de culture cellulaire et 0,5 millilitres JC1 colorant potentiel de membrane mitochondriale.Et incuber pendant 20 minutes à 37 degrés Celsius. Ensuite, centrifugez les tubes à 600 fois G pendant trois minutes à quatre degrés Celsius, puis lavez la pastille cellulaire selon le protocole de texte. Après avoir centrifugé la pastille lavée, retirer le supernatant.Et re-suspendre la pastille dans 0,5 millilitres de tampon de teinture JC1. Analyser les cellules tachées JC1 par cytométrie d’écoulement pour détecter la fluorescence verte et rouge. Lorsque le monomère JC1 est détecté, réglez la lumière d’excitation à 490 nanomètres et la lumière d’émission à 530 nanomètres.Lorsque le polymère JC1 est détecté, réglez la lumière d’excitation à 525 nanomètres et la lumière d’émission à 590 nanomètres. Pour analyser le taux de consommation d’oxygène, les cellules hepG2 de graines dans une plaque de culture cellulaire de puits 96 dans une densité de 4500 cellules par 100 microlitres par puits. Après 24 heures d’incubation à 37 degrés Celsius, assurez-vous que les cellules de chaque puits sont recouvertes de milieu.Avant d’exécuter le logiciel OCR, chargez la microplaque avec cartouche et la plaque de culture cellulaire dans un analyseur de flux extracellulaire tel que décrit dans le protocole de texte. Ouvrez le logiciel OCR et dans le menu goutte à goutte des applications, choisissez le kit de test de stress mito cellulaire, et cliquez sur le bouton démarrer l’application. Ensuite, cliquez sur le bouton de test de résistance exécuté.Lorsque l’écran de test de stress cellulaire apparaît, entrez le nombre de cellules ensemencement par puits dans la boîte de numéro d’ensemencement cellulaire et l’OCR moyen dans la moyenne à la cellule basale OCR boîte. Entrez la concentration de travail finale pour chaque reagent, puis injectez les reagents. Cliquez sur le bouton suivant.Lorsque l’écran d’information de groupe apparaît, assignez un groupe à des puits non attribués en choisissant une couleur et en donnant un nom. Cliquez ensuite sur les puits appropriés. Cliquez sur le bouton suivant et dans l’écran de mise en page d’injection de test de stress qui apparaît, cliquez sur commencer à exécuter le test de résistance sur l’analyseur.Après la course terminée, suivez les invites dans le logiciel, puis retirez et jetez la cartouche et la plaque cellulaire. L’intensité moyenne de la coloration fluorescente verte mitochondriale a diminué dans les cellules HepG2 exposées au bêta-HCH. Cela montre qu’il y a une diminution du nombre mitochondrial et une augmentation des mitochondries endommagées compatibles avec l’augmentation de la concentration de pesticides.En outre, les niveaux d’ATP dans les cellules HepG2 ont diminué avec les concentrations accrues d’exposition bêta-HCH, montrant la fonction diminuée des mitochondries dans ces cellules. Après la coloration JC1 pour le potentiel de membrane mitochondriale, ou MMP, le cytomètre d’écoulement a montré la fluorescence verte élevée de JC1 dans les cellules intactes d’HepG2. Cela est dû à la présence d’agrégats JC1 fluorescents rouges, qui sont un signe de MMP élevé.Dans les cellules traitées par bêta-HCH, la fluorescence jc1 verte rouge a diminué en raison d’une présence de monomères JA1 fluorescents verts, un signe de faible MMP. Enfin, le taux de consommation d’oxygène a également diminué avec l’augmentation des concentrations d’exposition au bêta-HCH, ce qui montre en outre que ce pesticide nuit à la fonction mitochondriale appropriée. Oh, eh bien, essayez cette procédure, il est important cependant, de se rappeler de voir que les cellules comme approprié pour le tester.Après son développement, cela ouvre définitivement la voie à des recherches dans le domaine de la fonction fondamentale pour explorer les organismes pertinents dans le rôle médical qui lui est associé. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de détecter une quantité ou une qualité, la capacité, maintenant membre ou potentiel sous la fonction feuille de bec.

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