Name: experimental protocol for detecting mitochondrial function in hepatocytes exposed to organochlorine pesticides
Uploaded: 2020-09-16T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Experimental Protocol for Detecting Mitochondrial Function in Hepatocytes Exposed to Organochlorine Pesticides at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (גרנט מס' 81573174, 81570574); קרן הנוער המצטיינים של מחוז ג'יאנגסו (SBK2014010296); פרויקט המחקר של משרד החינוך הסיני (213015A); פיתוח התוכנית האקדמית עדיפות של מוסדות להשכלה גבוהה ג'יאנגסו (PAPD), פיתוח מרכזי הדגל של מוסדות להשכלה גבוהה ג'יאנגסו; ותכנית הפרויקט הפתוח של המעבדה לכימיה סביבתית ואקוטוקסיקולוגיה (KF2015-01).

כל הניסויים ופרוטוקולי הניסוי בוצעו בהתאם להנחיות ולתקנות הרלוונטיות ואושרו על ידי הוועדה האתית המקומית של האוניברסיטה הרפואית של נאנג'ינג.
1. מבנה אולטרה מיטוכונדריאלי על ידי TEM
<ol><li>איסוף תאי HepG2<ol>
<li>זרע HepG2 תאים ב 100 מ"מ כלים. לאחסן ב- 37 °C ו- 5% CO2.</li>
		<li>תאי עיכול עם 0.25% ...

<ol>
	<li>Rantakokko, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent+organic+pollutants+and+non-alcoholic+fatty+liver+disease+in+morbidly+obese+patients:+a+cohort+study.">Persistent organic pollutants and non-alcoholic fatty liver disease in morbidly obese patients: a cohort study.</a> Environ Health. 14, 79 (2015).</li><li>Mrema, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent+organochlorinated+pesticides+and+mechanisms+of+their+toxicity.">Persistent organochlorinated pesticides and mechanisms of their toxicity.</a> Toxicology. 307, 74-88 (2013).</li><li>Dirinck, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity+and+persistent+organic+pollutants:+possible+obesogenic+effect+of+organochlorine+pesticides+and+polychlorinated+biphenyls.">Obesity and persistent organic pollutants: possible obesogenic effect of organochlorine pesticides and polychlorinated biphenyls.</a> Obesity (Silver Spring). 19 (4), 709-714 (2011).</li><li>Genini, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+induced+by+a+SH2+domain-targeting+STAT3+inhibitor+leads+to+metabolic+synthetic+lethality+in+cancer+cells.">Mitochondrial dysfunction induced by a SH2 domain-targeting STAT3 inhibitor leads to metabolic synthetic lethality in cancer cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. , (2017).</li><li>Korovljev, D., Trivic, T., Drid, P., Ostojic, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+hydrogen+affects+body+composition,+metabolic+profiles,+and+mitochondrial+function+in+middle-aged+overweight+women.">Molecular hydrogen affects body composition, metabolic profiles, and mitochondrial function in middle-aged overweight women.</a> Ir J Med Sci. , (2017).</li><li>Gonzalez-Franquesa, A., Patti, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+Resistance+and+Mitochondrial+Dysfunction.">Insulin Resistance and Mitochondrial Dysfunction.</a> Adv Exp Med Biol. 982, 465-520 (2017).</li><li>Cheng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Proton+Leak+Plays+a+Critical+Role+in+Pathogenesis+of+Cardiovascular+Diseases.">Mitochondrial Proton Leak Plays a Critical Role in Pathogenesis of Cardiovascular Diseases.</a> Adv Exp Med Biol. 982, 359-370 (2017).</li><li>Cheville, N. F., Stasko, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+in+electron+microscopy+of+animal+tissue.">Techniques in electron microscopy of animal tissue.</a> Vet Pathol. 51 (1), 28-41 (2014).</li><li>Nazmara, Z., Salehnia, M., HosseinKhani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Distribution+and+ATP+Content+of+Vitrified,+In+vitro+Matured+Mouse+Oocytes.">Mitochondrial Distribution and ATP Content of Vitrified, In vitro Matured Mouse Oocytes.</a> Avicenna J Med Biotechnol. 6 (4), 210-217 (2014).</li><li>Clapier, C. R., Iwasa, J., Cairns, B. R., Peterson, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+action+and+regulation+of+ATP-dependent+chromatin-remodelling+complexes.">Mechanisms of action and regulation of ATP-dependent chromatin-remodelling complexes.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. , (2017).</li><li>Reitman, Z. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer-associated+isocitrate+dehydrogenase+1+(IDH1)+R132H+mutation+and+d-2-hydroxyglutarate+stimulate+glutamine+metabolism+under+hypoxia.">Cancer-associated isocitrate dehydrogenase 1 (IDH1) R132H mutation and d-2-hydroxyglutarate stimulate glutamine metabolism under hypoxia.</a> J Biol Chem. 289 (34), 23318-23328 (2014).</li><li>Nelson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+consumption+rate+v.+rate+of+energy+utilization+of+fishes:+a+comparison+and+brief+history+of+the+two+measurements.">Oxygen consumption rate v. rate of energy utilization of fishes: a comparison and brief history of the two measurements.</a> J Fish Biol. 88 (1), 10-25 (2016).</li><li>Liu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organochloride+pesticides+impaired+mitochondrial+function+in+hepatocytes+and+aggravated+disorders+of+fatty+acid+metabolism.">Organochloride pesticides impaired mitochondrial function in hepatocytes and aggravated disorders of fatty acid metabolism.</a> Sci Rep. 7, 46339 (2017).</li><li>Tien, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+Glucose+Induces+Mitochondrial+Dysfunction+in+Retinal+Muller+Cells:+Implications+for+Diabetic+Retinopathy.">High Glucose Induces Mitochondrial Dysfunction in Retinal Muller Cells: Implications for Diabetic Retinopathy.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 58 (7), 2915-2921 (2017).</li><li>Dussmann, H., Perez-Alvarez, S., Anilkumar, U., Papkovsky, D. B., Prehn, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+time-lapse+imaging+of+intracellular+O2+in+response+to+metabolic+inhibition+and+mitochondrial+cytochrome-c+release.">Single-cell time-lapse imaging of intracellular O2 in response to metabolic inhibition and mitochondrial cytochrome-c release.</a> Cell Death Dis. 8 (6), 2853 (2017).</li><li>Jaiswal, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Riluzole+But+Not+Melatonin+Ameliorates+Acute+Motor+Neuron+Degeneration+and+Moderately+Inhibits+SOD1-Mediated+Excitotoxicity+Induced+Disrupted+Mitochondrial+Ca2++Signaling+in+Amyotrophic+Lateral+Sclerosis.">Riluzole But Not Melatonin Ameliorates Acute Motor Neuron Degeneration and Moderately Inhibits SOD1-Mediated Excitotoxicity Induced Disrupted Mitochondrial Ca2+ Signaling in Amyotrophic Lateral Sclerosis.</a> Front Cell Neurosci. 10, 295 (2016).</li><li>Song, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lenti-siRNA+Hsp60+promote+bax+in+mitochondria+and+induces+apoptosis+during+heat+stress.">Lenti-siRNA Hsp60 promote bax in mitochondria and induces apoptosis during heat stress.</a> Biochem Biophys Res Commun. 481 (1-2), 125-131 (2016).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tea+tree+oil+exhibits+antifungal+activity+against+Botrytis+cinerea+by+affecting+mitochondria.">Tea tree oil exhibits antifungal activity against Botrytis cinerea by affecting mitochondria.</a> Food Chem. 234, 62-67 (2017).</li><li>Grunig, D., Felser, A., Bouitbir, J., Krahenbuhl, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+catechol-O-methyltransferase+inhibitors+tolcapone+and+entacapone+uncouple+and+inhibit+the+mitochondrial+respiratory+chain+in+HepaRG+cells.">The catechol-O-methyltransferase inhibitors tolcapone and entacapone uncouple and inhibit the mitochondrial respiratory chain in HepaRG cells.</a> Toxicol In Vitro. 42, 337-347 (2017).</li><li>Mayor, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G+protein-coupled+receptor+kinase+2+(GRK2)+as+an+integrative+signalling+node+in+the+regulation+of+cardiovascular+function+and+metabolic+homeostasis.">G protein-coupled receptor kinase 2 (GRK2) as an integrative signalling node in the regulation of cardiovascular function and metabolic homeostasis.</a> Cell Signal. , (2017).</li><li>Clark, A., Mach, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Crosstalk+between+the+Gut+Microbiota+and+Mitochondria+during+Exercise.">The Crosstalk between the Gut Microbiota and Mitochondria during Exercise.</a> Front Physiol. 8, 319 (2017).</li><li>Robicsek, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolated+Mitochondria+Transfer+Improves+Neuronal+Differentiation+of+Schizophrenia-Derived+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+and+Rescues+Deficits+in+a+Rat+Model+of+the+Disorder.">Isolated Mitochondria Transfer Improves Neuronal Differentiation of Schizophrenia-Derived Induced Pluripotent Stem Cells and Rescues Deficits in a Rat Model of the Disorder.</a> Schizophr Bull. , (2017).</li><li>Akinrotimi, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shp+deletion+prevents+hepatic+steatosis+and+when+combined+with+Fxr+loss+protects+against+type+2+diabetes.">Shp deletion prevents hepatic steatosis and when combined with Fxr loss protects against type 2 diabetes.</a> Hepatology. , (2017).</li><li>Rosa, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+insights+into+the+antioxidant+role+of+tauroursodeoxycholic+acid+in+experimental+models+of+Parkinson's+disease.">Novel insights into the antioxidant role of tauroursodeoxycholic acid in experimental models of Parkinson's disease.</a> Biochim Biophys Acta. , (2017).</li><li>Matondo, A., Kim, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted-Mitochondria+Antioxidants+Therapeutic+Implications+in+Inflammatory+Bowel+Disease.">Targeted-Mitochondria Antioxidants Therapeutic Implications in Inflammatory Bowel Disease.</a> J Drug Target. , 1-30 (2017).</li></ol>

קריטי להצלחת פרוטוקול הזיהוי הוא השימוש במגוון שיטות ניסיוניות כיסו את המחקר מפנוטיפ למנגנון. במחקר זה, תאי HepG2 היו תרבותיים DMEM עם פניצילין וסטרפטומיצין ו 10% סרום של פר העובר. כאשר תאים הגיעו 40-50% confluence, β-HCH (0, 10, 100 ng/mL) נוספו ותווספו במשך 24 שעות. השתמשנו לראשונה TEM אשר הראה את השינויים ultrastructural...

ההשפעות של חומרי הדברה אורגנוכלורין (OCPs) על בריאות, למשל התערבות הרבייה, רעילות חיסונית, שינויים מטבולייםנחקרו בעבר 1,,2,3. השיטות לזיהוי חילוף חומרים תאי ולגלות תפקוד מיטוכונדריאלי אפשרו למדענים להבין את התפקיד של תפקוד המיטוכונדריה (כלומר.רמות STAT3 מיטוכונדריאלי, לקטאט, pyruvate, יחס לקטר-pyruvate, קואנזים Q10, דליפת פרוטון מיטוכונדריאלי, bioenergetics, biogenesis, ודינמיקה) בתחומים כגון הזדקנות, השמנת יתר, סוכרת, תפקוד לב וכלי דם,סרטן, רעילותבטיחות 4,5,6,7. בעיתון זה, אנו מתארים את השיטות על הערכת תפקוד מיטוכונדריאלי שנגרם על ידי OCPs.
חשפנו תאי HepG2 β-hexachlorocyclohexane (β-HCH), OCPs נציג אחד, במשך 24 שעות במינון שווה ערך לחשיפה פנימית של אדם. ראשית, TEM הוחל כדי לצפות במבנה האולטרה של hepatocytes, כגון גרעין, מיטוכונדריה ו אנדופלסמי רטיטולום8. בהשוואה למיקרוסקופים רגילים, TEM מאפשר לחקור את מבנה האולטרה-תלת-מידי והתלת-מיויד של תאים ורכיבי תאים (קווי תאים או רקמה), מורפולוגיה, הרכב כימי, כמו גם פונקציה של חומרים טבעיים או מלאכותיים המגללים תפקיד מרכזי במדע ובטכנולוגיה המודרניים. תפקוד המיטוכונדריה הוערך עוד יותר על ידי עוצמת פלואורסצנטי מיטוכונדריאלי, אדנוסין 5'-טריפוספט (ATP) רמות, קצב צריכת חמצן (OCR) ופוטנציאל קרום מיטוכונדריאלי (MMP)בתאי HepG2 דגירה עם β-HCH. ירוק מיטו-גשש הוא בדיקה פלורסנט ירוק המיטוכונדריה שיכול לשמש כתמי פלואורסצנט מיטוכונדריאלי ספציפי תא חי. המיטוכונדריה בהפטוציטים הוכתמה על ידי תמיסה ירוקה מיטו-גשש ועוצמת פלואורסצסצנציה מיטוכונדריאלית, מספר ודפוס נצפו עם מיקרוסקופ confocal9. בדיקה מיטוכונדריאלית ירוקה פלורסנט יכול לשמש כדי להכתים תאים חיים. בהשוואה לרודמין 123 או JC-1, בדיקה פלואורסצנטית ירוקה מיטוכונדריאלית אינה תלויה בפוטנציאל קרום מיטוכונדריאלי לכתמים מיטוכונדריאליים. רמות ATP נקבעו על ידי ערכת לוציפראז-לוציפרין ומנורמל על ידי ריכוז חלבון. ערכת אחסון ATP יכול לשמש כדי לזהות רמות ATP בפתרונות נפוצים, תאים או רקמות. ערכה זו מבוססת על גחלילית לוציפראז נבליזה על ידי פלואורסצן כדי ליצור פלואורסצנט, כאשר ATP נדרש לספק אנרגיה. כאשר לוציפראז גחלילית ופלואורסצ'ין הם מוגזמים, בטווח ריכוז מסוים, דור הפלואורסצנט הוא פרופורציונלי לריכוז של ATP. בנוסף, ערכה זו תוכננה במיוחד כדי לייעל את הכימותרפיה של ATP. ATP, כמו מולקולות האנרגיה החשובות ביותר, ממלא תפקיד חשוב בתהליכים פיזיולוגיים או פתולוגיים שונים של תאים. שינויים ברמות ATP יכול לשקף פגמים בתפקוד התא, במיוחד ייצור אנרגיה מיטוכונדריאלית. בדרך כלל תחת אפופטוזיס, נמק או במצב רעיל כלשהו, רמות ATP הסלולר מופחת 10. ערכת אסאי MMPs עם JC-1 היא ערכה המשתמשת JC-1 כבדיקה פלורסנט כדי לזהות תאים, רקמות או MMPs מטוהר במהירות וברגישות. זה יכול לשמש לגילוי מוקדם של אפופטוזיס. הצבע cationic JC-1 הוא גשושית פלורסנט המשמשת לזיהוי MMP אשר ניתן לנתח תחת ציתימת זרימה המצוינת על ידי שינויים של יחס פלואורסצנטי ירוק ואדום. כאשר ה-MMP גבוה, JC-1 נצבר במטריצה של המיטוכונדריה כדי ליצור פולימר (אגרגטים J), המייצר פלואורסצנס אדום. כאשר MMP נמוך, JC-1 אינו יכול לצבור, ויוצר מונומר המייצר פלואורסצנס ירוק11. אז היחס של פלואורסץ אדום וירוק יכול לשקף את הרמה של MMP. OCR של תאים הוא אינדיקטור מכריע של תפקוד תאי נורמלי12. הוא נחשב כפרמטר למחקר פונקציה מיטוכונדריאלית. ערכת בדיקת מיטו של התא מספקת שיטה יציבה לניתוח פרמטרים מרכזיים של פונקציית מיטוכונדריאלי. הערכה מספקת בקרת איכות ריגנטים חזוי, כמו גם שיטה סטנדרטית לביצוע בדיקת מיטוכונדריה של תאים. זה יכול לשמש כדי לזהות את כל סוגי התאים, כולל תאים ראשיים, קווי תאים, תאים מושעים, וגם עבור איונים, נמטודות, שמרים ומיטוכונדריה מבודדת.
מדידת OCR יכולה לספק תובנה חשובה לגבי המצב הפיזיולוגי או שינויים של תאים. זה נקבע עם מנתח שטף תות-תאי כדי לזהות בסיס נשימה, דליפת פרוטון, נשימה מקסימלית, מחזור ATP וקיבולת מילואים. בקצרה, לאחר מדידות בסיסיות של OCR, OCR זוהה לאחר הוספה רציפה אוליגומיצין (ATP מינר), FCCP (מיטוכונדריאלי חמצון phosphorylation uncoupler) ואנטימיצין A / rotenone (מעכב של צריכת חמצן)לכל טוב.
במאמץ להקל על הפיתוח של פרוטוקול ספציפי יותר לזיהוי פונקציה מיטוכונדריאלית בהפטוציטים במבחנה, אנו מציגים כאן ניסויים על ידי TEM, מיקרוסקופיה קונפוקלית, luminometer, ציטומטריה זרימה ומנתח שטף חוץ-תאי עם יישום עתידי בחקר תוצאות שליליות הקשורות נזק המיטוכונדריה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:756px;" width="755">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td>Transmission electron microscope&#160;</td>
			<td>FEI</td>
			<td>Tecnai G2 Spirit Bio TWIN</td>
			<td>High-contrast, high-resolution imaging, Low-dose observation and imaging, Low-temperature observation, Outstanding analytical performance, Automation for convenience and performance</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:205px;">Mito-Tracker Green</td>
			<td style="width:69px;">Beyotime</td>
			<td style="width:161px;">C1048</td>
			<td style="width:320px;">Mito-Tracker Green is a mitochondrial green fluorescent probe that can be used for live cell mitochondrial-specific fluorescent staining.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="105" style="height:105px;width:205px;">Laser scanning confocal microscope</td>
			<td style="width:69px;">Zeiss</td>
			<td style="width:161px;">700B</td>
			<td style="width:320px;">The design is compact, stable, light path is the shortest, high light precision, creative technology and sophisticated scanning technology together to&#160; produce a perfect 3-dimensional specimen image.</td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:205px;">Enhanced ATP Assay Kit</td>
			<td style="width:69px;">Beyotime</td>
			<td style="width:161px;">S0027</td>
			<td style="width:320px;">Enhanced ATP Assay Kit can be used to detect ATP (adenosine 5&#39;-triphosphate) levels in common solutions, cells or tissues. Cells and tissue samples can be split to complete the sample preparation, detection sensitivity up to 0.1nmol / L, chemiluminescence can be sustained for 30 minutes.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:205px;">Luminometer</td>
			<td style="width:69px;">Berthold</td>
			<td style="width:161px;">Centro LB 960</td>
			<td style="width:320px;">Luminometer is chemiluminescence detector, the test sample itself can be light, do not need to stimulate. Luminometer is the instrument that detects chemiluminescence.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:205px;">BCA Protein Assay Kit</td>
			<td style="width:69px;">Beyotime</td>
			<td style="width:161px;">P0012</td>
			<td style="width:320px;">BCA Protein Assay Kit is one of the most commonly used methods for detecting protein concentrations.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="42" style="height:42px;width:205px;">Multimode reader</td>
			<td style="width:69px;">TECAN</td>
			<td style="width:161px;">InfiniteM200</td>
			<td style="width:320px;">Multimode reader be used to detect protein consentration.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

experimental protocol for detecting mitochondrial function in hepatocytes exposed to organochlorine pesticides

נייר זה מציג שיטות מפורטות על זיהוי תפקוד המיטוכונדריאלי הכבד להבנה טובה יותר של הגורם להפרעות מטבוליות הנגרמות על ידי חומרי הדברה אורגנוכלורין סביבתיים (OCPs) בהפטוציטים. תאי HepG2 נחשפו β-hexachlorocyclohexane (β-HCH) במשך 24 שעות במינון שווה ערך של חשיפה פנימית באוכלוסייה הכללית. Ultrastructure בהפטוציטים נבדק על ידי מיקרוסקופאלקטרונים שידור (TEM) כדי להראות את הנזק של המיטוכונדריה. תפקוד המיטוכונדריה הוערך עוד יותר על ידי עוצמת פלואורסצנטי מיטוכונדריאלי, אדנוסין 5'-טריפוספט (ATP) רמות, קצב צריכת חמצן (OCR) ופוטנציאל קרום מיטוכונדריאלי (MMP) בתאי HepG2 דגירה עם β-HCH. עוצמת המיטוכונדריה פלואורסצנטית לאחר מוכתם על ידי בדיקה פלואורסצנטי ירוק מיטוכונדריאלי נצפתה עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי. תגובת לוציפרין-לוציפראז שימשה לקביעת רמות ATP. MMP זוהה על ידי צבע cationic JC-1 וניתח תחת ציתימת זרימה. OCR נמדד עם מנתח שטף extracellular. לסיכום, פרוטוקולים אלה שימשו לזיהוי פונקציה מיטוכונדריאלית בהפטוציטים עם לחקור נזקי המיטוכונדריה.

המיטוכונדריה cristae של תאי HepG2 שנחשפו β-HCH נפגעו במידה ניכרת. המיטוכונדריה המפוזרת התרחבה במתינות, בצורה לא סדירה, ורכס המיטוכונדריה נעלם עם ארכיטקטורה מיטוכונדריאלית חריגה יחסית (איור 1).
עוצמת הפלואורסצנס הירוקה הממוצעת, ה?...

Watch this Scientific Journal Video about Experimental Protocol for Detecting Mitochondrial Function in Hepatocytes Exposed to Organochlorine Pesticides at JoVE.com

Experimental Protocol for Detecting Mitochondrial Function in Hepatocytes Exposed to Organochlorine Pesticides

הבנת ההשפעה של חומרי הדברה אורגנוכלורין סביבתיים (OCPs) על תפקוד המיטוכונדריאלי בהפטוציטים חשוב לחקור את המנגנון של OCPs גורם להפרעות מטבוליות. נייר זה מציג שיטות מפורטות על זיהוי פונקציית המיטוכונדריה הכבד.

פרוטוקול ניסיוני לזיהוי תפקוד מיטוכונדריאלי בהפטוציטים שנחשפו לחומרי הדברה אורגנוכלורין

This paper presents detailed methods on detecting hepatic mitochondrial function for a better understanding the cause of metabolic disorders caused by ...

זה מסר שמתקשר לענות על שאלת מפתח שיש לך גם פונקציה של שדה כגון רמת ATP ואת שיעורי צריכת החמצן. החדש או הישן בעמוד אחד, טכניקה זו היא שזה קל לבצע וזה הרבה להערכה מיוחדת של תפקוד המיטוכונדריאלי הסלולר. כדי להתחיל את הניסוי הזה, זרע 20, 000 תאי HepG2 בצלחת פטרי בתחתית זכוכית.הוסף בטא-hexachlorcyclohexane או B-HCH באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס וחמישה אחוזים CO2 במשך 24 שעות. הכן פתרון בדיקה פלואורסצנטי ירוק מיטוכונדריאלי אחד על ידי הוספת DMSO נטול מים למדיום תרבות התאים של DMEM. לאחר מכן מוסיפים מיליליטר אחד למנה של פתרון זה לתאים במנות פטרי תחתון זכוכית.ותגרה ב-37 מעלות צלזיוס במשך 45 דקות. לאחר הדגירה, להסיר את פתרון בדיקה פלואורסצנטי ירוק מיטוכונדריאלי מהתאים. מוסיפים מיליליטר אחד למנה של טרי מוכן ב 37 מעלות צלזיוס DMEM תאים בינוני.כדי לזהות פלואורסצנטיות ירוקה במיטוכונדריה, התבונן בתאים תחת מיקרוסקופ קונפוקאלי. כדי להעריך את רמות ATP הסלולר, זרע ל 20, 000 תאי HepG2 בשש צלחות גם. מוסיפים בטא-HCH ודגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות.הוסף 200 מיקרוליטרים של מאגר תיזה לתאים בכל באר. צנטריפוגה ב 12, 000 פעמים G במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס, ולהמשיך עם איסוף על טבעי כמתואר בפרוטוקול הטקסט. הוסף 100 מאגר זיהוי ATP microliters לצלחת.הוסף 100 מיקרוליטרים של תא שנאסף על-טבעי לצלחת באר 96 בטמפרטורת החדר והמשיך לזהות ATP סלולרי על ידי מד זוהר כמתואר בפרוטוקול הטקסט. להערכת פוטנציאל קרום המיטוכונדריאלי, לגדל תאי HepG2 בשש צלחות גם עם תוספת של בטא HCH, כפי שתואר קודם לכן. לאסוף את התאים על ידי עיכול אותם עם 0.5 מיליליטר 0.25% EDTA במשך דקה אחת ב 37 מעלות צלזיוס.הוסף DMEM מיליליטר אחד כדי לעצור את העיכול ולהעביר את התאים המתעכלים לצינורות 1.5 מיליליטר. צנטריפוגה הצינורות ב 1000 פעמים G במשך שלוש דקות, ולאחר מכן להשליך את העל טבעי. לדלל את גלולת התא עם 0.5 מיליליטר של תאים בינוני ו 0.5 מיליליטר JC1 מיטוכונדריאלי קרום צבע פוטנציאלי.ודגירה במשך 20 דקות ב37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, צנטריפוגה הצינורות ב 600 פעמים G במשך שלוש דקות בארבע מעלות צלזיוס, ולאחר מכן לשטוף את גלולת התא על פי פרוטוקול הטקסט. לאחר צנטריפוגה גלולה שטף, להסיר את supernatant.ולהשעות מחדש את גלולה ב 0.5 מיליליטר של חיץ צביעה JC1. נתח את התאים המוכתמים JC1 באמצעות ציטומטריית זרימה כדי לזהות פלואורסצנטיות ירוקה ואדום. כאשר מונומר JC1 מזוהה, להגדיר את אור העירור ל 490 ננומטר ואת אור הפליטה ל 530 ננומטר.כאשר פולימר JC1 מזוהה, להגדיר את אור העירור ל 525 ננומטר ואת אור הפליטה ל 590 ננומטר. כדי לנתח את קצב צריכת החמצן, זרע תאי HepG2 בצלחת תרבות תאים 96 היטב בצפיפות של 4, 500 תאים לכל 100 microliters ל הבאר. לאחר 24 שעות של דגירה ב 37 מעלות צלזיוס, ודא כי התאים בכל באר מכוסים בינוני.לפני הפעלת תוכנת זיהוי תווים אופטי (OCR) , טען את המיקרו-פלטה עם המחסנית ואת לוחית תא התרבות לתוך מנתח שטף חוץ-תאי כמתואר בפרוטוקול הטקסט. פתח את תוכנת זיהוי תווים אופטי (OCR) ובתפריט הנפתח של האפליקציות, בחר בערכת בדיקת הלחץ של ה-mito של התא ולחץ על לחצן אפליקציית 'התחל'. לאחר מכן, לחץ על כפתור בדיקת הלחץ לרוץ.כאשר מופיע מסך בדיקת הלחץ של התא, הזן את מספר התאים שזורעים ל הבאר בתיבה מספר זריעת תאים ואת זיהוי תווים אופטי (OCR) הממוצע בתיבה ממוצעת של זיהוי תווים אופטי (OCR) של תאים בזלתיים. הזן את ריכוז העבודה הסופי עבור כל רהגנט ולאחר מכן להזריק את reagents. לחץ על הכפתור הבא.כאשר מסך פרטי הקבוצה מופיע, הקצה קבוצה ל בארות שלא הוקצו על-ידי בחירת צבע ומתן שם. לאחר מכן לחץ על הבאר המתאימה. לחץ על הכפתור הבא ובמסך פריסת הזרקת מבחן הלחץ שמופיע, לחץ על להתחיל להפעיל את בדיקת הלחץ על המנתח.לאחר הריצה שהושלמה, בצע את ההנחיות בתוכנה ולאחר מכן הסר ומחק את המחסנית ואת לוח התא. העוצמה הממוצעת של כתמי פלואורסצנט ירוק מיטוכונדריאלי ירד בתאי HepG2 חשופים בטא HCH. זה מראה כי יש ירידה במספר המיטוכונדריה וגידול המיטוכונדריה פגום עולה בקנה אחד עם הגידול בריכוז חומרי הדברה.יתר על כן, רמות ATP בתאי HepG2 ירדו עם ריכוזים מוגברים של חשיפה בטא HCH, מראה את הפונקציה ירדה של המיטוכונדריה בתאים אלה. לאחר כתמי JC1 עבור פוטנציאל קרום מיטוכונדריאלי, או MMP, ציטומטר זרימה הראה פלואורסצנטיות JC1 ירוק אדום גבוה בתאי HepG2 שלמים. זאת בשל נוכחותם של אגרגטים אדומים פלואורסצנטיים JC1, שהם סימן של MMP גבוה.בתאים שטופלו בבטא-HCH, פלואורסצנטיות JC1 ירוקה אדומה ירדה עקב נוכחות של מונומרים ירוקים פלואורסצנטיים JC1, סימן של MMP נמוך. לבסוף, שיעור צריכת החמצן ירד גם עם הריכוזים המוגברים של חשיפה בטא HCH, עוד יותר מראה כי הדברה זו פוגעת בתפקוד המיטוכונדריאלי תקין. נו, טוב, לנסות להליך זה, זה חשוב אם כי, לזכור לראות את התאים המתאימים כדי לבדוק את זה.לאחר התפתחותו, זה בהחלט סולל דרך למחקרים בתחום התפקוד הבסיסי לחקור אורגניזמים רלוונטיים בתפקיד הרפואי הקשור אליו. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה צריך הבנה טובה של איך לזהות כמות או איכות, קיבולת, עכשיו חבר או פוטנציאל תחת פונקציית גיליון זרבובית.

Research

JoVE Journal

Environment

Experimental Protocol for Manipulating Plant-induced Soil Heterogeneity

פרוטוקול ניסוי להטרוגניות קרקע מושרה צמח מניפולציה

Coexistence theory has often treated environmental heterogeneity as being independent of the community composition; however biotic feedbacks such as ...

A Protocol for Conducting Rainfall Simulation to Study Soil Runoff

פרוטוקול לעריכת סימולציה גשם לחקר ניגר קרקע

Rainfall is a driving force for the transport of environmental contaminants from agricultural soils to surficial water bodies via surface runoff. The ...

Administering and Detecting Protein Marks on Arthropods for Dispersal Research

ניהול וזיהוי סימני חלבון על פרוקי רגליים לחקר פיזור

Monitoring arthropod movement is often required to better understand associated population dynamics, dispersal patterns, host plant preferences, and other ...

LC-MS Analysis of Human Platelets as a Platform for Studying Mitochondrial Metabolism

ניתוח LC-MS של טסיות האדם כפלטפורמה ללימוד מטבוליזם מיטוכונדריאלי

Perturbed mitochondrial metabolism has received renewed interest as playing a causative role in a range of diseases. Probing alterations to metabolic ...

Characterization and Application of Passive Samplers for Monitoring of Pesticides in Water

אפיון ויישום של דוגמים פסיביים עבור ניטור של דברה במים

Five different water passive samplers were calibrated under laboratory conditions for measurement of 124 legacy and current used pesticides. This study ...

Experimental Protocol for Biodiesel Production with Isolation of Alkenones as Coproducts from Commercial Isochrysis Algal Biomass

Experimental Protocol for Biodiesel Production with Isolation of Alkenones as Coproducts from Commercial Isochrysis Algal Biomass

פרוטוקול ניסויי עבור ייצור ביודיזל עם בידוד של Alkenones כמו קו-מכפלה מ מסחרי<em&gt; Isochrysis</em&gt; ביומסה אצות

The need to replace petroleum fuels with alternatives from renewable and more environmentally sustainable sources is of growing importance. ...

Experimental Protocol for Detecting Cyanobacteria in Liquid and Solid Samples with an Antibody Microarray Chip

Experimental Protocol for Detecting Cyanobacteria in Liquid and Solid Samples with an Antibody Microarray Chip

פרוטוקול הניסוי לזיהוי<em&gt; כחוליות</em&gt; בדגימות נוזלים ומוצקים עם צ&#39;יפ Microarray נוגדן

Global warming and eutrophication make some aquatic ecosystems behave as true bioreactors that trigger rapid and massive cyanobacterial growth; this has ...

Extraction of Organochlorine Pesticides from Plastic Pellets and Plastic Type Analysis

הפקת חומרי הדברה אורגנוכלורינים מפלסטיק וגלגול סוג פלסטיק

Plastic resin pellets, categorized as microplastics (&#8804;5 mm in diameter), are small granules that can be unintentionally released to the environment ...

Video Tracking Protocol to Screen Deterrent Chemistries for Honey Bees

פרוטוקול מעקב וידאו מסך ההרתעה Chemistries עבור דבורים דבש

The European honey bee, Apis mellifera L., is an economically and agriculturally important pollinator that generates billions of dollars annually. Honey ...

Dispersion of Nanomaterials in Aqueous Media: Towards Protocol Optimization

פיזור של ננו בתקשורת מימית: לקראת פרוטוקול אופטימיזציה

The sonication process is commonly used for de-agglomerating and dispersing nanomaterials in aqueous based media, necessary to improve homogeneity and ...