Name: experimental protocol for detecting mitochondrial function in hepatocytes exposed to organochlorine pesticides
Uploaded: 2020-09-16T12:30:00
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この研究は中国国立自然科学財団(グラント81573174、81570574)によって支援されました。江蘇省優秀青少年基金(SBK2014010296);中国教育省の研究プロジェクト(213015A);江蘇高等教育機関(PAPD)の優先的な学術プログラム開発、江蘇高等教育機関の主力主要な発展;環境化学・環境毒性学の国家キー研究所のオープンプロジェクトプログラム(KF2015-01)。

すべての実験と実験プロトコルは、関連するガイドラインと規制に従って行われ、南京医科大学の地元の倫理委員会によって承認されました。
1. TEMによるミトコンドリア超構造
<ol><li>HepG2細胞の収集<ol>
<li>100 mm の皿の種 HepG2 細胞。37°C、5%CO2で2保管。</li>
		<li>1.5 mLEPチューブに0.25%EDTAを有する消化細胞。</li>
		<li>室温(RT)で3分間1000 x g で遠心分離機。上清...

<ol>
	<li>Rantakokko, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent+organic+pollutants+and+non-alcoholic+fatty+liver+disease+in+morbidly+obese+patients:+a+cohort+study.">Persistent organic pollutants and non-alcoholic fatty liver disease in morbidly obese patients: a cohort study.</a> Environ Health. 14, 79 (2015).</li><li>Mrema, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent+organochlorinated+pesticides+and+mechanisms+of+their+toxicity.">Persistent organochlorinated pesticides and mechanisms of their toxicity.</a> Toxicology. 307, 74-88 (2013).</li><li>Dirinck, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity+and+persistent+organic+pollutants:+possible+obesogenic+effect+of+organochlorine+pesticides+and+polychlorinated+biphenyls.">Obesity and persistent organic pollutants: possible obesogenic effect of organochlorine pesticides and polychlorinated biphenyls.</a> Obesity (Silver Spring). 19 (4), 709-714 (2011).</li><li>Genini, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+induced+by+a+SH2+domain-targeting+STAT3+inhibitor+leads+to+metabolic+synthetic+lethality+in+cancer+cells.">Mitochondrial dysfunction induced by a SH2 domain-targeting STAT3 inhibitor leads to metabolic synthetic lethality in cancer cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. , (2017).</li><li>Korovljev, D., Trivic, T., Drid, P., Ostojic, S. 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F., Stasko, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+in+electron+microscopy+of+animal+tissue.">Techniques in electron microscopy of animal tissue.</a> Vet Pathol. 51 (1), 28-41 (2014).</li><li>Nazmara, Z., Salehnia, M., HosseinKhani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Distribution+and+ATP+Content+of+Vitrified,+In+vitro+Matured+Mouse+Oocytes.">Mitochondrial Distribution and ATP Content of Vitrified, In vitro Matured Mouse Oocytes.</a> Avicenna J Med Biotechnol. 6 (4), 210-217 (2014).</li><li>Clapier, C. R., Iwasa, J., Cairns, B. R., Peterson, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+action+and+regulation+of+ATP-dependent+chromatin-remodelling+complexes.">Mechanisms of action and regulation of ATP-dependent chromatin-remodelling complexes.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. , (2017).</li><li>Reitman, Z. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer-associated+isocitrate+dehydrogenase+1+(IDH1)+R132H+mutation+and+d-2-hydroxyglutarate+stimulate+glutamine+metabolism+under+hypoxia.">Cancer-associated isocitrate dehydrogenase 1 (IDH1) R132H mutation and d-2-hydroxyglutarate stimulate glutamine metabolism under hypoxia.</a> J Biol Chem. 289 (34), 23318-23328 (2014).</li><li>Nelson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+consumption+rate+v.+rate+of+energy+utilization+of+fishes:+a+comparison+and+brief+history+of+the+two+measurements.">Oxygen consumption rate v. rate of energy utilization of fishes: a comparison and brief history of the two measurements.</a> J Fish Biol. 88 (1), 10-25 (2016).</li><li>Liu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organochloride+pesticides+impaired+mitochondrial+function+in+hepatocytes+and+aggravated+disorders+of+fatty+acid+metabolism.">Organochloride pesticides impaired mitochondrial function in hepatocytes and aggravated disorders of fatty acid metabolism.</a> Sci Rep. 7, 46339 (2017).</li><li>Tien, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+Glucose+Induces+Mitochondrial+Dysfunction+in+Retinal+Muller+Cells:+Implications+for+Diabetic+Retinopathy.">High Glucose Induces Mitochondrial Dysfunction in Retinal Muller Cells: Implications for Diabetic Retinopathy.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 58 (7), 2915-2921 (2017).</li><li>Dussmann, H., Perez-Alvarez, S., Anilkumar, U., Papkovsky, D. B., Prehn, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+time-lapse+imaging+of+intracellular+O2+in+response+to+metabolic+inhibition+and+mitochondrial+cytochrome-c+release.">Single-cell time-lapse imaging of intracellular O2 in response to metabolic inhibition and mitochondrial cytochrome-c release.</a> Cell Death Dis. 8 (6), 2853 (2017).</li><li>Jaiswal, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Riluzole+But+Not+Melatonin+Ameliorates+Acute+Motor+Neuron+Degeneration+and+Moderately+Inhibits+SOD1-Mediated+Excitotoxicity+Induced+Disrupted+Mitochondrial+Ca2++Signaling+in+Amyotrophic+Lateral+Sclerosis.">Riluzole But Not Melatonin Ameliorates Acute Motor Neuron Degeneration and Moderately Inhibits SOD1-Mediated Excitotoxicity Induced Disrupted Mitochondrial Ca2+ Signaling in Amyotrophic Lateral Sclerosis.</a> Front Cell Neurosci. 10, 295 (2016).</li><li>Song, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lenti-siRNA+Hsp60+promote+bax+in+mitochondria+and+induces+apoptosis+during+heat+stress.">Lenti-siRNA Hsp60 promote bax in mitochondria and induces apoptosis during heat stress.</a> Biochem Biophys Res Commun. 481 (1-2), 125-131 (2016).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tea+tree+oil+exhibits+antifungal+activity+against+Botrytis+cinerea+by+affecting+mitochondria.">Tea tree oil exhibits antifungal activity against Botrytis cinerea by affecting mitochondria.</a> Food Chem. 234, 62-67 (2017).</li><li>Grunig, D., Felser, A., Bouitbir, J., Krahenbuhl, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+catechol-O-methyltransferase+inhibitors+tolcapone+and+entacapone+uncouple+and+inhibit+the+mitochondrial+respiratory+chain+in+HepaRG+cells.">The catechol-O-methyltransferase inhibitors tolcapone and entacapone uncouple and inhibit the mitochondrial respiratory chain in HepaRG cells.</a> Toxicol In Vitro. 42, 337-347 (2017).</li><li>Mayor, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G+protein-coupled+receptor+kinase+2+(GRK2)+as+an+integrative+signalling+node+in+the+regulation+of+cardiovascular+function+and+metabolic+homeostasis.">G protein-coupled receptor kinase 2 (GRK2) as an integrative signalling node in the regulation of cardiovascular function and metabolic homeostasis.</a> Cell Signal. , (2017).</li><li>Clark, A., Mach, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Crosstalk+between+the+Gut+Microbiota+and+Mitochondria+during+Exercise.">The Crosstalk between the Gut Microbiota and Mitochondria during Exercise.</a> Front Physiol. 8, 319 (2017).</li><li>Robicsek, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolated+Mitochondria+Transfer+Improves+Neuronal+Differentiation+of+Schizophrenia-Derived+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+and+Rescues+Deficits+in+a+Rat+Model+of+the+Disorder.">Isolated Mitochondria Transfer Improves Neuronal Differentiation of Schizophrenia-Derived Induced Pluripotent Stem Cells and Rescues Deficits in a Rat Model of the Disorder.</a> Schizophr Bull. , (2017).</li><li>Akinrotimi, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shp+deletion+prevents+hepatic+steatosis+and+when+combined+with+Fxr+loss+protects+against+type+2+diabetes.">Shp deletion prevents hepatic steatosis and when combined with Fxr loss protects against type 2 diabetes.</a> Hepatology. , (2017).</li><li>Rosa, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+insights+into+the+antioxidant+role+of+tauroursodeoxycholic+acid+in+experimental+models+of+Parkinson's+disease.">Novel insights into the antioxidant role of tauroursodeoxycholic acid in experimental models of Parkinson's disease.</a> Biochim Biophys Acta. , (2017).</li><li>Matondo, A., Kim, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted-Mitochondria+Antioxidants+Therapeutic+Implications+in+Inflammatory+Bowel+Disease.">Targeted-Mitochondria Antioxidants Therapeutic Implications in Inflammatory Bowel Disease.</a> J Drug Target. , 1-30 (2017).</li></ol>

検出プロトコルの成功に不可欠なのは、表現型からメカニズムまで研究をカバーしてきた様々な実験方法の使用である。本研究では、ヘプG2細胞をペニシリンおよびストレプトマイシンおよび10%胎児ウシ血清でDMEMで培養した。細胞が合流率40~50%に達すると、β-HCH(0,10,100 ng/mL)を加え、24時間インキュベートした。代表のPPSによる肝細胞の超構造変化を示すTEMをまず用いたβ-HCHは、ミトコンドリ?...

健康に対する有機塩素農薬(OMP)の影響、例えば生殖障害、免疫毒性、代謝変化は、以前に検討された1、2、3。2,3細胞代謝を検出し、ミトコンドリア機能障害を発見する方法は、科学者がミトコンドリア機能の役割を理解することを可能にしました (すなわち.、 ミトコンドリア STAT3レベル、 乳酸、 ピルビン酸、 乳酸とピルビン酸比、 コエンザイム Q10、 ミトコンドリア陽子漏れ、生体精エネルギー、生物発生、および動力学) 老化、肥満、糖尿病、心血管機能、癌、および安全毒性4,,55,6,,7.本論文では、オプスによるミトコンドリア機能障害の評価方法について述べている。
HepG2細胞をヒトの内部暴露に相当する用量で24時間の代表的なOCPであるβ-ヘキサクロロシクロヘキサン(β-HCH)に曝露した。まず、TEMを適用して、核、ミトコンドリア、小胞体8などの肝細胞の超構造を観察した。通常の顕微鏡と比較して、TEMは、細胞および細胞成分(細胞株または組織)の2Dおよび3D超構造、形態、化学組成、ならびに現代の科学技術において極めて重要な役割を果たす天然または人工材料の機能を探求することを可能にする。ミトコンドリア機能は、さらに、β-HCHでインキュベートされたHepG2細胞におけるミトコンドリア蛍光強度、アデノシン5'-三リン酸(ATP)レベル、酸素消費率(OCR)およびミトコンドリア膜電位(MMP)によって評価された。水戸トラッカーグリーンは、生細胞ミトコンドリア特異的蛍光染色に使用できるミトコンドリア緑色蛍光プローブです。肝細胞におけるミトコンドリアを、ミトトラッカーグリーン溶液とミトコンドリア蛍光強度で染色し、数とパターンを共焦点顕微鏡9で観察した。ミトコンドリア緑色蛍光プローブは、生細胞を染色するために使用することができる。ローダミン123またはJC-1と比較して、ミトコンドリア緑色蛍光プローブは、ミトコンドリア染色のミトコンドリア膜電位に依存しない。ATPレベルはルシファーゼ-ルシフェリンキットによって決定され、タンパク質濃度によって正規化された。ATPアッセイキットは、一般的な溶液、細胞または組織のATPレベルを検出するために使用することができます。このキットは、エネルギーを提供するためにATPが必要な場合、蛍光を生成するために蛍光を生成するために蛍光を触媒ホタルルシファーゼをベースにしています。ホタルルシメラーゼとフルオレセインが過剰である場合、ある濃度範囲では、蛍光の発生はATPの濃度に比例する。さらに、このキットはATPの化学発光を最大限に活用するために特別に設計されていた。ATPは、最も重要なエネルギー分子として、細胞の様々な生理学的または病理学的プロセスにおいて重要な役割を果たす。ATPレベルの変化は、細胞機能、特にミトコンドリアエネルギー産生の欠陥を反映することができる。通常、アポトーシス下で、 壊死またはいくつかの毒性状態で, 細胞の ATP レベルは 10.JC-1のMMPアッセイキットは、細胞、組織、精製されたMMPを迅速かつ敏感に検出するための蛍光プローブとしてJC-1を使用するキットです。アポトーシスの早期発見に使用できます。カチオン色素JC-1は、緑と赤色の蛍光比の変化によって示されるフローサイトメトリー下で分析することができるMMPを検出するために使用される蛍光プローブです。MMPが高いとき、JC-1はミトコンドリアのマトリックスに凝集してポリマー(J-凝集体)を形成し、赤色蛍光を生じる。MMPが低いと、JC-1は蓄積できず、緑色蛍光11を生成する単量体を形成する。したがって、赤と緑の蛍光の比率は、MMPのレベルを反映することができます。細胞のOCRは、正常な細胞機能12の重要な指標である。ミトコンドリア機能を研究するためのパラメータとみなされます。細胞糸球菌ストレステストキットは、ミトコンドリア機能の主要パラメータを分析するための安定した方法を提供します。このキットは、細胞ミトコンドリアストレステストを行うための標準的な方法と同様に、品質管理と予測試薬を提供します。これは、すべての細胞タイプを検出するために使用することができます, プライマリ細胞を含みます, 細胞株, 浮遊細胞, また、小島, 線虫, 酵母と単離ミトコンドリア.
OCR測定は、細胞の生理的状態または変化に関する貴重な洞察を提供することができる。これは、呼吸ベースライン、陽子漏れ、最大呼吸、ATPターンオーバーおよび予備容量を検出するために細胞外フラックス分析装置で決定された。簡単に言えば、OCRのベースライン測定の後、OCRはオリゴマイシン(ATPカプラ)、FCCP(ミトコンドリア酸化リン酸化アンカプラー)および抗マイシンA/ロテノーネ(酸素消費の阻害剤)に順次添加した後に検出された。
インビトロでの肝細胞におけるミトコンドリア機能を検出するためのより具体的なプロトコルの開発を促進するために、ここでは、ミトコンドリアの損傷関連有害な結果を研究する際に、TEM、共焦点顕微鏡、ルミノメーター、フローサイトメトリーおよび細胞外フラックス分析による実験を提示する。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:756px;" width="755">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td>Transmission electron microscope&#160;</td>
			<td>FEI</td>
			<td>Tecnai G2 Spirit Bio TWIN</td>
			<td>High-contrast, high-resolution imaging, Low-dose observation and imaging, Low-temperature observation, Outstanding analytical performance, Automation for convenience and performance</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:205px;">Mito-Tracker Green</td>
			<td style="width:69px;">Beyotime</td>
			<td style="width:161px;">C1048</td>
			<td style="width:320px;">Mito-Tracker Green is a mitochondrial green fluorescent probe that can be used for live cell mitochondrial-specific fluorescent staining.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="105" style="height:105px;width:205px;">Laser scanning confocal microscope</td>
			<td style="width:69px;">Zeiss</td>
			<td style="width:161px;">700B</td>
			<td style="width:320px;">The design is compact, stable, light path is the shortest, high light precision, creative technology and sophisticated scanning technology together to&#160; produce a perfect 3-dimensional specimen image.</td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:205px;">Enhanced ATP Assay Kit</td>
			<td style="width:69px;">Beyotime</td>
			<td style="width:161px;">S0027</td>
			<td style="width:320px;">Enhanced ATP Assay Kit can be used to detect ATP (adenosine 5&#39;-triphosphate) levels in common solutions, cells or tissues. Cells and tissue samples can be split to complete the sample preparation, detection sensitivity up to 0.1nmol / L, chemiluminescence can be sustained for 30 minutes.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:205px;">Luminometer</td>
			<td style="width:69px;">Berthold</td>
			<td style="width:161px;">Centro LB 960</td>
			<td style="width:320px;">Luminometer is chemiluminescence detector, the test sample itself can be light, do not need to stimulate. Luminometer is the instrument that detects chemiluminescence.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:205px;">BCA Protein Assay Kit</td>
			<td style="width:69px;">Beyotime</td>
			<td style="width:161px;">P0012</td>
			<td style="width:320px;">BCA Protein Assay Kit is one of the most commonly used methods for detecting protein concentrations.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="42" style="height:42px;width:205px;">Multimode reader</td>
			<td style="width:69px;">TECAN</td>
			<td style="width:161px;">InfiniteM200</td>
			<td style="width:320px;">Multimode reader be used to detect protein consentration.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

experimental protocol for detecting mitochondrial function in hepatocytes exposed to organochlorine pesticides

本論文では、肝細胞における環境有機塩素農薬(OSP)による代謝障害の原因をより深く理解するための、肝ミトコンドリア機能の検出に関する詳細な方法を紹介する。ヘプG2細胞は、一般集団における内部曝露の等価用量で24時間のβ−ヘキサクロロシクロヘキサン(β-HCH)に曝露した。肝細胞における超構造を透過電子顕微鏡(TEM)で調べ、ミトコンドリアの損傷を示した。ミトコンドリア機能は、さらに、β-HCHでインキュベートされたHepG2細胞におけるミトコンドリア蛍光強度、アデノシン5'-三リン酸(ATP)レベル、酸素消費率(OCR)およびミトコンドリア膜電位(MMP)によって評価された。ミトコンドリア緑色蛍光プローブで染色後のミトコンドリア蛍光強度を蛍光顕微鏡で観察した。ルシフェリン-ルシメラーゼ反応を用い、ATPレベルを決定した。MMPを、カチオン色素JC-1によって検出し、フローサイトメトリー下で分析した。OCRは細胞外フラックス分析装置で測定した。要約すると、これらのプロトコルは、ミトコンドリアの損傷を調査するために肝細胞におけるミトコンドリア機能を検出するのに使用された。

β-HCHに曝露したHepG2細胞のミトコンドリアクリステは著しく損傷を受けた。散在したミトコンドリアは、比較的異常なミトコンドリア建築で、著しく膨張し、不規則な形状、およびミトコンドリア尾根が消失した軽度であった(図1)。
ミトコンドリアを表す平均ミトコンドリアグリーン蛍光強度は、β-...

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Experimental Protocol for Detecting Mitochondrial Function in Hepatocytes Exposed to Organochlorine Pesticides (Video) | JoVE

肝細胞におけるミトコンドリア機能に対する環境有機塩素農薬(OP)の影響を理解することは、代謝障害を引き起こすOMPのメカニズムを探求する上で重要である。本論文では、肝ミトコンドリア機能の検出方法について詳しく説明する。

有機塩素系農薬に曝露した肝細胞におけるミトコンドリア機能の検出実験プロトコル

This paper presents detailed methods on detecting hepatic mitochondrial function for a better understanding the cause of metabolic disorders caused by ...

ATPレベルや酸素消費率などの分野の機能にも重要な質問に答えるメッサーです。新しいまたは1ページ古い、この技術は、それが実行しやすいことであり、それは細胞ミトコンドリア機能の特別な評価のために多くです。この実験を開始するために、ガラス底ペトリ皿に20,000個のHepG2細胞をシードする。インキュベーターにβ-ヘキサクロルシクロヘキサンまたはB-HCHを摂氏37度、CO2を5%24時間加えます。DMEM細胞培地に無水DMSOを添加してミトコンドリアグリーン蛍光プローブ溶液を1ミリモル調製した。その後、ガラス底ペトリ皿の細胞にこの溶液の皿当たり1ミリリットルを追加します。そして、摂氏37度で45分間インキュベートします。インキュベーション後、ミトコンドリア緑色蛍光プローブ溶液を細胞から取り出します。37°C DMEM細胞培養培地で作りたての1皿につき1ミリリットルを加えます。ミトコンドリアで緑色蛍光を検出するには、共焦点顕微鏡で細胞を観察します。細胞ATPのレベルを評価するために、6つのウェルプレートに20,000 HepG2細胞に播種する。β-HCHを加え、摂氏37度で24時間インキュベートします。各ウェルの細胞に200マイクロリットルのライシスバッファーを加えます。摂氏4度で5分間Gの12,000倍で遠心分離機を、テキストプロトコルに記載されているように上清の収集を進める。プレートに100マイクロリットルのATP検出バッファーを追加します。収集した細胞上清の100マイクロリットルを室温で96ウェルプレートに加え、テキストプロトコルに記載されているようにルミノメーターで細胞ATPを検出する。ミトコンドリア膜電位の評価のために、前に述べたようにβ-HCHを添加して6つのウェルプレートでHepG2細胞を増殖させる。0.5ミリリットル0.25%EDTAで37°Cで1分間消化して細胞を収集します。1ミリリットルDMEMを加え、消化を止め、消化した細胞を1.5ミリリットルのチューブに移します。チューブをGの1000倍の3分間遠心し、上清を捨てます。細胞ペレットを0.5ミリリットルの細胞培養培地と0.5ミリリットルのJC1ミトコンドリア膜電位色素で希釈します。そして、摂氏37度で20分間インキュベートします。次に、チューブを600倍Gで摂氏4度で3分間遠心し、次にテキストプロトコルに従って細胞ペレットを洗浄する。洗浄したペレットを遠心した後、上清を取り除く。そして、ペレットをJC1染色バッファーの0.5ミリリットルに再懸濁した。フローサイトメトリーを介してJC1染色細胞を分析し、緑色および赤色の蛍光を検出します。JC1モノマーが検出されたら、励起光を490ナノメートル、発光光を530ナノメートルに設定します。JC1ポリマーが検出されたら、励起光を525ナノメートル、発光光を590ナノメートルに設定します。酸素消費率を分析するために、ヘプG2細胞を96ウェル細胞培養プレートに4,500細胞/ウェル当たり100マイクロリットルの密度で播種します。摂氏37度で24時間のインキュベーションの後、各ウェルの細胞が培地で覆われていることを確認してください。OCRソフトウェアを実行する前に、テキストプロトコルに記載されているように、カートリッジと細胞培養プレートをマイクロプレートに細胞外フラックスアナライザにロードします。OCRソフトウェアを開き、アプリのドロップダウンメニューでセルの「ミトストレステストキット」を選択し、アプリの開始ボタンをクリックします。次に、[ストレス テストの実行] ボタンをクリックします。細胞ストレステスト画面が表示されたら、細胞の播種数ボックスにウェル当たりの細胞播種数を入力し、基底細胞OCRボックスでの平均OCRを平均値に入力します。各試薬の最終作業濃度を入力し、試薬を注入します。次のボタンをクリックします。グループ情報画面が表示されたら、色を選択して名前を付けることで、割り当てられていないウェルにグループを割り当てます。その後、適切な井戸をクリックします。次のボタンをクリックし、表示されるストレス テストインジェクション レイアウト画面で、[開始] をクリックして、アナライザでストレス テストを実行します。実行が完了したら、ソフトウェアの指示に従い、カートリッジとセルプレートを取り外して廃棄します。β-HCHに曝露したHepG2細胞におけるミトコンドリア緑色蛍光染色の平均強度が低下した。これは、ミトコンドリア数の減少と農薬濃度の増加と一致する損傷したミトコンドリアの増加があることを示しています。さらに、HepG2細胞におけるATPレベルはβ-HCH曝露の濃度の増加とともに減少し、これらの細胞におけるミトコンドリアの機能低下を示す。ミトコンドリア膜電位、またはMMPに対するJC1染色後、フローサイトメーターは、無傷のHepG2細胞において高赤色緑色JC1蛍光を示した。これは、高いMMPの兆候である赤色蛍光JC1凝集体の存在によるものであった。β-HCHで処理した細胞において、緑色のJC1モノマーの存在により赤緑色JC1蛍光が低下し、低MMPの徴候である。最後に、β-HCH曝露の濃度の増加に伴って酸素消費率も低下し、この農薬が適切なミトコンドリア機能を損なうことをさらに示す。ああ、まあ、この手順を試みて、しかし、それをテストするために適切なセルを見ることを忘れないでください。その開発後、これは間違いなくそれに関連する医学的役割の関連する生物を探求する基本的な機能の分野での研究のための道を開きます。このビデオを見た後、あなたは、不足シート機能の下で、量や品質、容量、今メンバーまたは潜在的なを検出する方法をよく理解している必要があります。

Research

JoVE Journal

Environment

Experimental Protocol for Detecting Mitochondrial Function in Hepatocytes Exposed to Organochlorine Pesticides

Experimental Protocol for Manipulating Plant-induced Soil Heterogeneity

Experimental Protocol for Manipulating Plant-induced Soil Heterogeneity (Video) | JoVE

の操作植物に誘導される土壌の不均一性のための実験プロトコール

Coexistence theory has often treated environmental heterogeneity as being independent of the community composition; however biotic feedbacks such as ...

A Protocol for Conducting Rainfall Simulation to Study Soil Runoff

A Protocol for Conducting Rainfall Simulation to Study Soil Runoff (Video) | JoVE

土壌流出を研究する降雨シミュレーションを行うためのプロトコル

Rainfall is a driving force for the transport of environmental contaminants from agricultural soils to surficial water bodies via surface runoff. The ...

Administering and Detecting Protein Marks on Arthropods for Dispersal Research

Administering and Detecting Protein Marks on Arthropods for Dispersal Research (Video) | JoVE

管理と分散研究のための節足動物にプロテインマークを検出

Monitoring arthropod movement is often required to better understand associated population dynamics, dispersal patterns, host plant preferences, and other ...

LC-MS Analysis of Human Platelets as a Platform for Studying Mitochondrial Metabolism

LC-MS Analysis of Human Platelets as a Platform for Studying Mitochondrial Metabolism (Video) | JoVE

ミトコンドリア代謝を研究するためのプラットフォームとしてのヒト血小板のLC-MS分析

Perturbed mitochondrial metabolism has received renewed interest as playing a causative role in a range of diseases. Probing alterations to metabolic ...

Characterization and Application of Passive Samplers for Monitoring of Pesticides in Water

Characterization and Application of Passive Samplers for Monitoring of Pesticides in Water (Video) | JoVE

水中の農薬のモニタリングのための特性とパッシブサンプラーの応用

Five different water passive samplers were calibrated under laboratory conditions for measurement of 124 legacy and current used pesticides. This study ...

Experimental Protocol for Biodiesel Production with Isolation of Alkenones as Coproducts from Commercial Isochrysis Algal Biomass

Experimental Protocol for Biodiesel Production with Isolation of Alkenones as Coproducts from Commercial Isochrysis Algal Biomass (Video) | JoVE

コマーシャルからの副産物としてアルケノンの単離とバイオディーゼル生産のための実験プロトコール<em&gt;イソクリシス</em&gt;藻類バイオマス

The need to replace petroleum fuels with alternatives from renewable and more environmentally sustainable sources is of growing importance. ...

Experimental Protocol for Detecting Cyanobacteria in Liquid and Solid Samples with an Antibody Microarray Chip

Experimental Protocol for Detecting Cyanobacteria in Liquid and Solid Samples with an Antibody Microarray Chip (Video) | JoVE

検出するための実験プロトコール<em&gt;シアノバクテリア</em&gt;抗体マイクロアレイチップと液体と固体試料中の

Global warming and eutrophication make some aquatic ecosystems behave as true bioreactors that trigger rapid and massive cyanobacterial growth; this has ...

Extraction of Organochlorine Pesticides from Plastic Pellets and Plastic Type Analysis

Extraction of Organochlorine Pesticides from Plastic Pellets and Plastic Type Analysis (Video) | JoVE

プラスチックペレットからの有機塩素系農薬の抽出と塑性解析

Plastic resin pellets, categorized as microplastics (&#8804;5 mm in diameter), are small granules that can be unintentionally released to the environment ...

Video Tracking Protocol to Screen Deterrent Chemistries for Honey Bees

Video Tracking Protocol to Screen Deterrent Chemistries for Honey Bees (Video) | JoVE

ハチミツの抑止化学物質をスクリーニングするためのビデオトラッキングプロトコル

The European honey bee, Apis mellifera L., is an economically and agriculturally important pollinator that generates billions of dollars annually. Honey ...

Dispersion of Nanomaterials in Aqueous Media: Towards Protocol Optimization

Dispersion of Nanomaterials in Aqueous Media: Towards Protocol Optimization (Video) | JoVE

水溶液中におけるナノ材料の分散: プロトコルの最適化に向けて

The sonication process is commonly used for de-agglomerating and dispersing nanomaterials in aqueous based media, necessary to improve homogeneity and ...