Name: experimental protocol for detecting mitochondrial function in hepatocytes exposed to organochlorine pesticides
Uploaded: 2020-09-16T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Experimental Protocol for Detecting Mitochondrial Function in Hepatocytes Exposed to Organochlorine Pesticides at JoVE.com

Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (Grant No 81573174, 81570574); Выдающийся молодежный фонд провинции Цзянсу (SBK2014010296); исследовательский проект Министерства образования Китая (213015A); приоритетная академическая программа развития высших учебных заведений Цзянсу (PAPD), флагманское крупное развитие высших учебных заведений Цзянсу; и Программа открытого проекта Государственной ключевой лаборатории экологической химии и экотоксикологии (KF2015-01).

Все эксперименты и протоколы экспериментов проводились в соответствии с соответствующими руководящими принципами и правилами и были одобрены местным комитетом по этике Нанкинского медицинского университета.
1. Митохондриальная ультраструктура TEM
<ol><li>Сбор клеток HepG2<...

<ol>
	<li>Rantakokko, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent+organic+pollutants+and+non-alcoholic+fatty+liver+disease+in+morbidly+obese+patients:+a+cohort+study.">Persistent organic pollutants and non-alcoholic fatty liver disease in morbidly obese patients: a cohort study.</a> Environ Health. 14, 79 (2015).</li><li>Mrema, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent+organochlorinated+pesticides+and+mechanisms+of+their+toxicity.">Persistent organochlorinated pesticides and mechanisms of their toxicity.</a> Toxicology. 307, 74-88 (2013).</li><li>Dirinck, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity+and+persistent+organic+pollutants:+possible+obesogenic+effect+of+organochlorine+pesticides+and+polychlorinated+biphenyls.">Obesity and persistent organic pollutants: possible obesogenic effect of organochlorine pesticides and polychlorinated biphenyls.</a> Obesity (Silver Spring). 19 (4), 709-714 (2011).</li><li>Genini, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+induced+by+a+SH2+domain-targeting+STAT3+inhibitor+leads+to+metabolic+synthetic+lethality+in+cancer+cells.">Mitochondrial dysfunction induced by a SH2 domain-targeting STAT3 inhibitor leads to metabolic synthetic lethality in cancer cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. , (2017).</li><li>Korovljev, D., Trivic, T., Drid, P., Ostojic, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+hydrogen+affects+body+composition,+metabolic+profiles,+and+mitochondrial+function+in+middle-aged+overweight+women.">Molecular hydrogen affects body composition, metabolic profiles, and mitochondrial function in middle-aged overweight women.</a> Ir J Med Sci. , (2017).</li><li>Gonzalez-Franquesa, A., Patti, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+Resistance+and+Mitochondrial+Dysfunction.">Insulin Resistance and Mitochondrial Dysfunction.</a> Adv Exp Med Biol. 982, 465-520 (2017).</li><li>Cheng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Proton+Leak+Plays+a+Critical+Role+in+Pathogenesis+of+Cardiovascular+Diseases.">Mitochondrial Proton Leak Plays a Critical Role in Pathogenesis of Cardiovascular Diseases.</a> Adv Exp Med Biol. 982, 359-370 (2017).</li><li>Cheville, N. F., Stasko, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+in+electron+microscopy+of+animal+tissue.">Techniques in electron microscopy of animal tissue.</a> Vet Pathol. 51 (1), 28-41 (2014).</li><li>Nazmara, Z., Salehnia, M., HosseinKhani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Distribution+and+ATP+Content+of+Vitrified,+In+vitro+Matured+Mouse+Oocytes.">Mitochondrial Distribution and ATP Content of Vitrified, In vitro Matured Mouse Oocytes.</a> Avicenna J Med Biotechnol. 6 (4), 210-217 (2014).</li><li>Clapier, C. R., Iwasa, J., Cairns, B. R., Peterson, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+action+and+regulation+of+ATP-dependent+chromatin-remodelling+complexes.">Mechanisms of action and regulation of ATP-dependent chromatin-remodelling complexes.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. , (2017).</li><li>Reitman, Z. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer-associated+isocitrate+dehydrogenase+1+(IDH1)+R132H+mutation+and+d-2-hydroxyglutarate+stimulate+glutamine+metabolism+under+hypoxia.">Cancer-associated isocitrate dehydrogenase 1 (IDH1) R132H mutation and d-2-hydroxyglutarate stimulate glutamine metabolism under hypoxia.</a> J Biol Chem. 289 (34), 23318-23328 (2014).</li><li>Nelson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+consumption+rate+v.+rate+of+energy+utilization+of+fishes:+a+comparison+and+brief+history+of+the+two+measurements.">Oxygen consumption rate v. rate of energy utilization of fishes: a comparison and brief history of the two measurements.</a> J Fish Biol. 88 (1), 10-25 (2016).</li><li>Liu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organochloride+pesticides+impaired+mitochondrial+function+in+hepatocytes+and+aggravated+disorders+of+fatty+acid+metabolism.">Organochloride pesticides impaired mitochondrial function in hepatocytes and aggravated disorders of fatty acid metabolism.</a> Sci Rep. 7, 46339 (2017).</li><li>Tien, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+Glucose+Induces+Mitochondrial+Dysfunction+in+Retinal+Muller+Cells:+Implications+for+Diabetic+Retinopathy.">High Glucose Induces Mitochondrial Dysfunction in Retinal Muller Cells: Implications for Diabetic Retinopathy.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 58 (7), 2915-2921 (2017).</li><li>Dussmann, H., Perez-Alvarez, S., Anilkumar, U., Papkovsky, D. B., Prehn, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+time-lapse+imaging+of+intracellular+O2+in+response+to+metabolic+inhibition+and+mitochondrial+cytochrome-c+release.">Single-cell time-lapse imaging of intracellular O2 in response to metabolic inhibition and mitochondrial cytochrome-c release.</a> Cell Death Dis. 8 (6), 2853 (2017).</li><li>Jaiswal, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Riluzole+But+Not+Melatonin+Ameliorates+Acute+Motor+Neuron+Degeneration+and+Moderately+Inhibits+SOD1-Mediated+Excitotoxicity+Induced+Disrupted+Mitochondrial+Ca2++Signaling+in+Amyotrophic+Lateral+Sclerosis.">Riluzole But Not Melatonin Ameliorates Acute Motor Neuron Degeneration and Moderately Inhibits SOD1-Mediated Excitotoxicity Induced Disrupted Mitochondrial Ca2+ Signaling in Amyotrophic Lateral Sclerosis.</a> Front Cell Neurosci. 10, 295 (2016).</li><li>Song, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lenti-siRNA+Hsp60+promote+bax+in+mitochondria+and+induces+apoptosis+during+heat+stress.">Lenti-siRNA Hsp60 promote bax in mitochondria and induces apoptosis during heat stress.</a> Biochem Biophys Res Commun. 481 (1-2), 125-131 (2016).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tea+tree+oil+exhibits+antifungal+activity+against+Botrytis+cinerea+by+affecting+mitochondria.">Tea tree oil exhibits antifungal activity against Botrytis cinerea by affecting mitochondria.</a> Food Chem. 234, 62-67 (2017).</li><li>Grunig, D., Felser, A., Bouitbir, J., Krahenbuhl, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+catechol-O-methyltransferase+inhibitors+tolcapone+and+entacapone+uncouple+and+inhibit+the+mitochondrial+respiratory+chain+in+HepaRG+cells.">The catechol-O-methyltransferase inhibitors tolcapone and entacapone uncouple and inhibit the mitochondrial respiratory chain in HepaRG cells.</a> Toxicol In Vitro. 42, 337-347 (2017).</li><li>Mayor, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G+protein-coupled+receptor+kinase+2+(GRK2)+as+an+integrative+signalling+node+in+the+regulation+of+cardiovascular+function+and+metabolic+homeostasis.">G protein-coupled receptor kinase 2 (GRK2) as an integrative signalling node in the regulation of cardiovascular function and metabolic homeostasis.</a> Cell Signal. , (2017).</li><li>Clark, A., Mach, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Crosstalk+between+the+Gut+Microbiota+and+Mitochondria+during+Exercise.">The Crosstalk between the Gut Microbiota and Mitochondria during Exercise.</a> Front Physiol. 8, 319 (2017).</li><li>Robicsek, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolated+Mitochondria+Transfer+Improves+Neuronal+Differentiation+of+Schizophrenia-Derived+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+and+Rescues+Deficits+in+a+Rat+Model+of+the+Disorder.">Isolated Mitochondria Transfer Improves Neuronal Differentiation of Schizophrenia-Derived Induced Pluripotent Stem Cells and Rescues Deficits in a Rat Model of the Disorder.</a> Schizophr Bull. , (2017).</li><li>Akinrotimi, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shp+deletion+prevents+hepatic+steatosis+and+when+combined+with+Fxr+loss+protects+against+type+2+diabetes.">Shp deletion prevents hepatic steatosis and when combined with Fxr loss protects against type 2 diabetes.</a> Hepatology. , (2017).</li><li>Rosa, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+insights+into+the+antioxidant+role+of+tauroursodeoxycholic+acid+in+experimental+models+of+Parkinson's+disease.">Novel insights into the antioxidant role of tauroursodeoxycholic acid in experimental models of Parkinson's disease.</a> Biochim Biophys Acta. , (2017).</li><li>Matondo, A., Kim, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted-Mitochondria+Antioxidants+Therapeutic+Implications+in+Inflammatory+Bowel+Disease.">Targeted-Mitochondria Antioxidants Therapeutic Implications in Inflammatory Bowel Disease.</a> J Drug Target. , 1-30 (2017).</li></ol>

Решающее значение для успеха протокола обнаружения имеет использование различных экспериментальных методов, которые были охвачены исследования от фенотипа к механизму. В этом исследовании клетки HepG2 были откоучались в DMEM с пенициллином и стрептомицином и 10% сыворотки крупного рогато...

Влияние органохлорных пестицидов (OCPs) на здоровье, например, репродуктивное вмешательство, иммунологическая токсичность, метаболические изменения былиранее изучены 1,,2,,3. Методы обнаружения клеточного метаболизма и выявления митохондриальной дисфункции позволили ученым понять роль митохондриальной функции,,,(т.е.митохондриальных уровней STAT3,лактата, пирувата, соотношения лактата к пирувату,коэнзима No10, митохондриальной утечки протонов, биоэнергетики, биогенеза идинамики) втакихобластях, как старение, ожирение, диабет, сердечно-сосудистая функция, рак и токсичность.6 В этом документе мы описываем методы оценки митохондриальной дисфункции, вызванной OCPs.
Мы подвергли клетки HepG2 воздействию гексахлороциклогексана (З-ГХГ), одного репрезентативного OCP, на 24 ч в дозе, эквивалентной внутреннему воздействию человека. Во-первых, TEM был применен для наблюдения за ультраструктурой гепатоцитов, таких как ядра, митохондрии и эндоплазмическийритикулум 8. По сравнению с обычными микроскопами, TEM позволяет исследовать 2D и 3D ультра-структуру клеток и клеточных компонентов (клеточные линии или ткани), морфологию, химический состав, а также функции природных или искусственных материалов, которые играют ключевую роль в современной науке и технике. Митохондриальная функция была дополнительно оценена по интенсивности митохондриальной флуоресценции, уровням аденозина 5'-трифосфата (АТФ), скорости потребления кислорода (OCR) и митохондриальному мембранальному потенциалу (MMP) в клетках HepG2, инкубированных С-ГХГ. Мито-трекер зеленый митохондрии зеленый флуоресцентный зонд, который может быть использован для живых клеток митохондриальных флуоресцентных окрашивания. Митохондрии в гепатоцитах были окрашены мито-трекер зеленый раствор и митохондриальной интенсивности флуоресценции, количество и картина наблюдались с конфокальноймикроскопии 9. Митохондриальный зеленый флуоресцентный зонд может быть использован для окрашивания живых клеток. По сравнению с роданом 123 или JC-1 митохондриальный зеленый флуоресцентный зонд не зависит от митохондриального мембранного потенциала митохондриального окрашивания. Уровни АТФ определялись набором люциферазы-люциферина и нормализовались концентрацией белка. Набор анализа АТФ может быть использован для обнаружения уровней АТФ в общих растворах, клетках или тканях. Этот комплект основан на светлячка люцифераза катализа флуоресценции для создания флуоресценции, когда АТФ требуется для обеспечения энергией. Когда светлячок люцифераза и флуорессейн являются чрезмерными, в определенном диапазоне концентрации, генерация флуоресценции пропорциональна концентрации АТФ. Кроме того, этот комплект был специально разработан для оптимизации химилюминесценции АТФ. АТФ, как наиболее важные молекулы энергии, играет важную роль в различных физиологических или патологических процессах клеток. Изменения в уровнях АТФ могут отражать дефекты в функции клеток, особенно митохондриальной выработки энергии. Обычно при апоптозе, некрозе или в каком-то токсичном состоянии уровень клеточного АТФ снижается на 10. MMPs анализ комплект с JC-1 является комплект, который использует JC-1 в качестве флуоресцентного зонда для обнаружения клеток, тканей или очищенных MMPs быстро и чувствительно. Он может быть использован для раннего выявления апоптоза. Катионый краситель JC-1 является флуоресцентным зондом, используемым для обнаружения MMP, который может быть проанализирован под цитометрией потока, указанной изменениями зеленого и красного соотношения флуоресценции. Когда MMP высок, JC-1 агрегируется в матрице митохондрий, чтобы сформировать полимер (J-агрегаты), который производит красную флуоресценцию. Когда MMP низок, JC-1 не может накапливаться, и образует мономер, который производит зеленую флуоресценцию11. Таким образом, соотношение красной и зеленой флуоресценции может отражать уровень MMP. OCR клеток является важнейшим показателем нормальной клеточной функции12. Он рассматривается как параметр исследования митохондриальной функции. Комплект стресс-теста Cell mito обеспечивает стабильный метод анализа ключевых параметров митохондриальной функции. Комплект обеспечивает контроль качества и прогностические реагенты, а также стандартный метод для выполнения клеточного митохондриального стресс-теста. Он может быть использован для обнаружения всех типов клеток, в том числе первичных клеток, клеточных линий, подвесных клеток, а также для островков, нематод, дрожжей и изолированных митохондрий.
Измерение OCR может обеспечить ценное понимание физиологического состояния или изменения клеток. Он был определен с помощью внеклеточного анализатора потока для обнаружения дыхания базовых, протонной утечки, максимальных дыхательных путей, оборота АТФ и резервной мощности. Короче говоря, после базовых измерений OCR, OCR был обнаружен после последовательного добавления к олигомицину (ATP Coupler), FCCP (митохондриальное окислительное фосфорилирование uncoupler) и антимицин а/ротенон (ингибитор потребления кислорода) на колодец.
В целях содействия разработке более конкретного протокола для обнаружения митохондриальной функции в гепатоцитах in vitro, мы представляем здесь эксперименты TEM, конфокальной микроскопии, люминометра, цитометра потока и внеклеточного анализатора потока с будущим применением в изучении митохондрий повреждения, связанные с неблагоприятными исходами.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:756px;" width="755">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td>Transmission electron microscope&#160;</td>
			<td>FEI</td>
			<td>Tecnai G2 Spirit Bio TWIN</td>
			<td>High-contrast, high-resolution imaging, Low-dose observation and imaging, Low-temperature observation, Outstanding analytical performance, Automation for convenience and performance</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:205px;">Mito-Tracker Green</td>
			<td style="width:69px;">Beyotime</td>
			<td style="width:161px;">C1048</td>
			<td style="width:320px;">Mito-Tracker Green is a mitochondrial green fluorescent probe that can be used for live cell mitochondrial-specific fluorescent staining.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="105" style="height:105px;width:205px;">Laser scanning confocal microscope</td>
			<td style="width:69px;">Zeiss</td>
			<td style="width:161px;">700B</td>
			<td style="width:320px;">The design is compact, stable, light path is the shortest, high light precision, creative technology and sophisticated scanning technology together to&#160; produce a perfect 3-dimensional specimen image.</td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:205px;">Enhanced ATP Assay Kit</td>
			<td style="width:69px;">Beyotime</td>
			<td style="width:161px;">S0027</td>
			<td style="width:320px;">Enhanced ATP Assay Kit can be used to detect ATP (adenosine 5&#39;-triphosphate) levels in common solutions, cells or tissues. Cells and tissue samples can be split to complete the sample preparation, detection sensitivity up to 0.1nmol / L, chemiluminescence can be sustained for 30 minutes.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:205px;">Luminometer</td>
			<td style="width:69px;">Berthold</td>
			<td style="width:161px;">Centro LB 960</td>
			<td style="width:320px;">Luminometer is chemiluminescence detector, the test sample itself can be light, do not need to stimulate. Luminometer is the instrument that detects chemiluminescence.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:205px;">BCA Protein Assay Kit</td>
			<td style="width:69px;">Beyotime</td>
			<td style="width:161px;">P0012</td>
			<td style="width:320px;">BCA Protein Assay Kit is one of the most commonly used methods for detecting protein concentrations.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="42" style="height:42px;width:205px;">Multimode reader</td>
			<td style="width:69px;">TECAN</td>
			<td style="width:161px;">InfiniteM200</td>
			<td style="width:320px;">Multimode reader be used to detect protein consentration.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

experimental protocol for detecting mitochondrial function in hepatocytes exposed to organochlorine pesticides

В настоящем документе представлены подробные методы обнаружения печеночным митохондриальной функции для лучшего понимания причины метаболических нарушений, вызванных экологическими органохлоринными пестицидами (OCPs) в гепатоцитах. Клетки HepG2 подвергались воздействию гексахлороциклогексана (З-ГХГ) в течение 24 ч при эквивалентной дозе внутреннего воздействия в общей популяции. Ультраструктура в гепатоцитах была исследована с помощью электронной микроскопии передачи (TEM), чтобы показать повреждение митохондрий. Митохондриальная функция была дополнительно оценена по интенсивности митохондриальной флуоресценции, уровням аденозина 5'-трифосфата (АТФ), скорости потребления кислорода (OCR) и митохондриальному мембранальному потенциалу (MMP) в клетках HepG2, инкубированных С-ГХГ. Интенсивность митохондрий флуоресценции после окрашенных митохондриального зеленого флуоресцентного зонда наблюдалась с помощью микроскопии флуоресценции. Реакция люциферина-люциферазы была использована для определения уровней АТФ. MMP был обнаружен катионом красителя JC-1 и проанализирован под цитометрией потока. OCR измерялся с помощью внеклеточного анализатора потока. Таким образом, эти протоколы были использованы в обнаружении митохондриальной функции в гепатоцитах с для исследования повреждений митохондрий.

Митохондрии cristae клеток HepG2 подвергаются К-ГХГ были заметно повреждены. Рассеянные митохондрии были слегка заметно расширены, неправильной формы, и митохондриальный хребет исчез с относительно ненормальной митохондриальной архитектурой(рисунок 1).
...

Watch this Scientific Journal Video about Experimental Protocol for Detecting Mitochondrial Function in Hepatocytes Exposed to Organochlorine Pesticides at JoVE.com

Experimental Protocol for Detecting Mitochondrial Function in Hepatocytes Exposed to Organochlorine Pesticides

Понимание влияния экологических органохлоринных пестицидов (OCPs) на митохондриальную функцию в гепатоцитах имеет важное значение для изучения механизма OCPs вызывает нарушения обмена веществ. В настоящем документе представлены подробные методы обнаружения печеночным митохондриальной функции.

Экспериментальный протокол для обнаружения митохондриальной функции в гепатоцитах, подвергшихся воздействию органохлорных пестицидов

This paper presents detailed methods on detecting hepatic mitochondrial function for a better understanding the cause of metabolic disorders caused by ...

Это messer, которые называют ответ на ключевой вопрос, который у вас есть в также функции области, такие как уровень АТФ и потребления кислорода. Новая или одна страница старая, этот метод является то, что это легко выполнить, и это много для специальной оценки клеточной митохондриальной функции. Чтобы начать этот эксперимент, семя 20 000 клеток HepG2 в стеклянном дне чашки Петри.Добавить бета-гексахлорциклолексан или B-HCH в инкубаторе при 37 градусах Цельсия и пять процентов CO2 в течение 24 часов. Подготовьте один миллимолярный митохондриальный зеленый раствор зонда флуоресценции, добавив ангидроус DMSO в среду культуры клеток DMEM. Затем добавьте один миллилитр на тарелку этого раствора в клетки в стеклянном дне чашек Петри.И инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение 45 минут. После инкубации удалите митохондриальный зеленый флуоресцентный раствор зонда из клеток. Добавить один миллилитр на блюдо свежеприготовленных при 37 градусах по Цельсию DMEM клеточной культуры среды.Чтобы обнаружить зеленую флуоресценцию в митохондриях, наблюдайте за клетками под конфокальцатором. Для оценки уровней клеточного АТФ, семян до 20000 hepG2 клеток в шести пластин хорошо. Добавить бета-ГХГ и инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение 24 часов.Добавьте 200 микролитров буфера лиза к клеткам в каждой хорошо. Центрифуга в 12 000 раз G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия, и приступить к сбору супернатантов, как описано в текстовом протоколе. Добавьте к пластине буфер обнаружения АТФ 100 микролитров.Добавьте 100 микролитров собранного клеточного супернатанта к пластине 96 хорошо при комнатной температуре и приступили к обнаружению клеточного АТФ с помощью люминометра, как описано в текстовом протоколе. Для оценки потенциала митохондриальной мембраны, расти HepG2 клетки в шести пластин хорошо с добавлением бета-ГХГ, как описано ранее. Соберите клетки, переваривая их с 0,5 миллилитров 0,25%EDTA в течение одной минуты при 37 градусов по Цельсию.Добавьте один миллилитр DMEM, чтобы остановить пищеварение и перенести переваренные клетки в 1,5 миллилитровые трубки. Центрифуга труб при 1000 раз G в течение трех минут, а затем отказаться от супернатанта. Разбавить клеточной гранулы с 0,5 миллилитров клеточной культуры среднего и 0,5 миллилитров JC1 митохондриальной мембраны потенциального красителя.И инкубировать в течение 20 минут при 37 градусах по Цельсию. Далее центрифуга трубки при 600 раз G в течение трех минут при четырех градусах по Цельсию, а затем мыть гранулы клетки в соответствии с текстовым протоколом. После центрифугирования промытой гранулы снимите супернатант.И повторно приостановить гранулы в 0,5 миллилитров JC1 окраски буфера. Проанализируйте окрашенные клетки JC1 с помощью цитометрии потока для обнаружения зеленой и красной флуоресценции. При обнаружении мономера JC1 установите свет возбуждения до 490 нанометров, а свет излучения до 530 нанометров.При обнаружении полимера JC1 установите свет возбуждения до 525 нанометров, а свет излучения - до 590 нанометров. Чтобы проанализировать скорость потребления кислорода, семенные клетки HepG2 в 96 хорошо клеточной культуры пластины в плотности 4500 клеток на 100 микролитров на колодец. После 24 часов инкубации при 37 градусах по Цельсию убедитесь, что клетки в каждой колодец покрыты средой.Перед запуском программного обеспечения OCR загрузите микроплатформу картриджем и пластину культуры клеток во внеклеточный анализатор потока, как описано в текстовом протоколе. Откройте программное обеспечение OCR и в приложениях падение вниз меню, выбрать набор сотовой мито стресс-тест, и нажмите на кнопку запуска приложения. Далее нажмите кнопку стресс-теста.Когда экран стресс-теста клетки появляется, введите количество клеток посева на колодец в поле номер посева клеток и средний OCR в среднем на базальной ячейки OCR поле. Введите окончательную рабочую концентрацию для каждого реагента, а затем введите реагенты. Нажмите на следующую кнопку.Когда появится экран групповой информации, назначьте группу неподписанным колодцам, выбрав цвет и дав имя. Затем нажмите на соответствующие скважины. Нажмите на следующую кнопку и в экране макета инъекции стресс-теста, который появляется, нажмите на начало запуска стресс-теста на анализаторе.После завершения запуска следуйте подсказкам в программном обеспечении, а затем удалите и отбросьте картридж и клеточную пластину. Средняя интенсивность митохондриального зеленого флуоресцентного окрашивания снизилась в клетках HepG2, подвергшихся воздействию бета-ГХГ. Это свидетельствует о снижении митохондриального числа и увеличении поврежденных митохондрий в соответствии с увеличением концентрации пестицидов.Кроме того, уровни АТФ в клетках HepG2 снизились с увеличением концентрации бета-ГХГ воздействия, показывая снижение функции митохондрий в этих клетках. После JC1 окрашивания для митохондриального мембранного потенциала, или MMP, цитометр потока показал высокую красную зеленую флуоресценцию JC1 в нетронутых клетках HepG2. Это было связано с наличием красных флуоресцентных агрегатов JC1, которые являются признаком высокой MMP.В клетках, обработанных бета-ГХГ, красная зеленая флуоресценция JC1 уменьшилась из-за присутствия зеленых флуоресцентных мономеров JC1, что является признаком низкого MMP. Наконец, уровень потребления кислорода также снизился с увеличением концентрации бета-ГХГ воздействия, что еще раз показывает, что этот пестицид ухудшает надлежащую митохондриальную функцию. О, ну, попытка этой процедуры, важно, хотя, чтобы помнить, чтобы увидеть, что клетки, как это уместно, чтобы проверить его.После своего развития, это определенно прокладывает путь для исследований в области фундаментальной функции для изучения соответствующих организмов в медицинской роли, связанной с ним. После просмотра этого видео, вы должны иметь хорошее понимание того, как обнаружить количество или качество, емкость, в настоящее время член или потенциал под носик лист функции.

Research

JoVE Journal

Environment

Experimental Protocol for Manipulating Plant-induced Soil Heterogeneity

Экспериментальный протокол для работы с завод-индуцированной неоднородности почвы

Coexistence theory has often treated environmental heterogeneity as being independent of the community composition; however biotic feedbacks such as ...

A Protocol for Conducting Rainfall Simulation to Study Soil Runoff

Протокол по проведению Rainfall моделирование по изучению почвы стока

Rainfall is a driving force for the transport of environmental contaminants from agricultural soils to surficial water bodies via surface runoff. The ...

Administering and Detecting Protein Marks on Arthropods for Dispersal Research

Администрирование и обнаружения меток белка на членистоногих для разгона исследований

Monitoring arthropod movement is often required to better understand associated population dynamics, dispersal patterns, host plant preferences, and other ...

LC-MS Analysis of Human Platelets as a Platform for Studying Mitochondrial Metabolism

ЖХ-МС анализ тромбоцитами человека как платформа для изучения метаболизма митохондрий

Perturbed mitochondrial metabolism has received renewed interest as playing a causative role in a range of diseases. Probing alterations to metabolic ...

Characterization and Application of Passive Samplers for Monitoring of Pesticides in Water

Характеристика и применение пассивных пробоотборников для мониторинга пестицидов в воде

Five different water passive samplers were calibrated under laboratory conditions for measurement of 124 legacy and current used pesticides. This study ...

Experimental Protocol for Biodiesel Production with Isolation of Alkenones as Coproducts from Commercial Isochrysis Algal Biomass

Experimental Protocol for Biodiesel Production with Isolation of Alkenones as Coproducts from Commercial Isochrysis Algal Biomass

Экспериментальный протокол для производства биодизеля с выделением Alkenones в копроизведениями из коммерческих<em&gt; Isochrysis</em&gt; Algal Биомасса

The need to replace petroleum fuels with alternatives from renewable and more environmentally sustainable sources is of growing importance. ...

Experimental Protocol for Detecting Cyanobacteria in Liquid and Solid Samples with an Antibody Microarray Chip

Experimental Protocol for Detecting Cyanobacteria in Liquid and Solid Samples with an Antibody Microarray Chip

Экспериментальный протокол для обнаружения<em&gt; Цианобактерии</em&gt; В жидких и твердых образцах с антителом Microarray Chip

Global warming and eutrophication make some aquatic ecosystems behave as true bioreactors that trigger rapid and massive cyanobacterial growth; this has ...

Extraction of Organochlorine Pesticides from Plastic Pellets and Plastic Type Analysis

Экстракция органохлоридных пестицидов из пластиковых гранул и анализ пластического типа

Plastic resin pellets, categorized as microplastics (&#8804;5 mm in diameter), are small granules that can be unintentionally released to the environment ...

Video Tracking Protocol to Screen Deterrent Chemistries for Honey Bees

Протокол отслеживания видеосигнала для фильтров сдерживающих устройств для медоносных пчел

The European honey bee, Apis mellifera L., is an economically and agriculturally important pollinator that generates billions of dollars annually. Honey ...

Dispersion of Nanomaterials in Aqueous Media: Towards Protocol Optimization

Дисперсия наноматериалов в средах: на пути к оптимизации протокола

The sonication process is commonly used for de-agglomerating and dispersing nanomaterials in aqueous based media, necessary to improve homogeneity and ...