Name: experimental protocol for detecting mitochondrial function in hepatocytes exposed to organochlorine pesticides
Uploaded: 2020-09-16T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Experimental Protocol for Detecting Mitochondrial Function in Hepatocytes Exposed to Organochlorine Pesticides at JoVE.com

Detta arbete stöddes av National Natural Science Foundation of China (Grant Nos. 81573174, 81570574); den utestående ungdomsfonden i provinsen Jiangsu (SBK2014010296); det kinesiska utbildningsministeriets forskningsprojekt (213015A); Jiangsu-högskolornas (PAPD) prioriterade akademiska programutveckling, flaggskeppet större utveckling av Jiangsu-högskolor, och det öppna projektprogrammet för statens nyckellaboratorium för miljökemi och ekotoxikologi (KF2015-01).

Alla experiment och experimentprotokollen utfördes i enlighet med relevanta riktlinjer och föreskrifter och godkändes av den lokala etiska kommittén vid Nanjing Medical University.
1. Mitokondriell ultrastruktur av TEM
<ol><li>Samla HepG2-celler<ol>
<li>Frö HepG2 celler i 100 mm rätter. Förvaras vid 37 °C och 5 % CO2.</li>
		<li>Digest celler med 0,25% EDTA i 1,5 mLEP rör.</li>
		<li>Centrifugera vid 1000 x g i 3 min vid rumstemperatur (RT). Kassera supernatanten...

<ol>
	<li>Rantakokko, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent+organic+pollutants+and+non-alcoholic+fatty+liver+disease+in+morbidly+obese+patients:+a+cohort+study.">Persistent organic pollutants and non-alcoholic fatty liver disease in morbidly obese patients: a cohort study.</a> Environ Health. 14, 79 (2015).</li><li>Mrema, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent+organochlorinated+pesticides+and+mechanisms+of+their+toxicity.">Persistent organochlorinated pesticides and mechanisms of their toxicity.</a> Toxicology. 307, 74-88 (2013).</li><li>Dirinck, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity+and+persistent+organic+pollutants:+possible+obesogenic+effect+of+organochlorine+pesticides+and+polychlorinated+biphenyls.">Obesity and persistent organic pollutants: possible obesogenic effect of organochlorine pesticides and polychlorinated biphenyls.</a> Obesity (Silver Spring). 19 (4), 709-714 (2011).</li><li>Genini, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+induced+by+a+SH2+domain-targeting+STAT3+inhibitor+leads+to+metabolic+synthetic+lethality+in+cancer+cells.">Mitochondrial dysfunction induced by a SH2 domain-targeting STAT3 inhibitor leads to metabolic synthetic lethality in cancer cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. , (2017).</li><li>Korovljev, D., Trivic, T., Drid, P., Ostojic, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+hydrogen+affects+body+composition,+metabolic+profiles,+and+mitochondrial+function+in+middle-aged+overweight+women.">Molecular hydrogen affects body composition, metabolic profiles, and mitochondrial function in middle-aged overweight women.</a> Ir J Med Sci. , (2017).</li><li>Gonzalez-Franquesa, A., Patti, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+Resistance+and+Mitochondrial+Dysfunction.">Insulin Resistance and Mitochondrial Dysfunction.</a> Adv Exp Med Biol. 982, 465-520 (2017).</li><li>Cheng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Proton+Leak+Plays+a+Critical+Role+in+Pathogenesis+of+Cardiovascular+Diseases.">Mitochondrial Proton Leak Plays a Critical Role in Pathogenesis of Cardiovascular Diseases.</a> Adv Exp Med Biol. 982, 359-370 (2017).</li><li>Cheville, N. F., Stasko, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+in+electron+microscopy+of+animal+tissue.">Techniques in electron microscopy of animal tissue.</a> Vet Pathol. 51 (1), 28-41 (2014).</li><li>Nazmara, Z., Salehnia, M., HosseinKhani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Distribution+and+ATP+Content+of+Vitrified,+In+vitro+Matured+Mouse+Oocytes.">Mitochondrial Distribution and ATP Content of Vitrified, In vitro Matured Mouse Oocytes.</a> Avicenna J Med Biotechnol. 6 (4), 210-217 (2014).</li><li>Clapier, C. R., Iwasa, J., Cairns, B. R., Peterson, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+action+and+regulation+of+ATP-dependent+chromatin-remodelling+complexes.">Mechanisms of action and regulation of ATP-dependent chromatin-remodelling complexes.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. , (2017).</li><li>Reitman, Z. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer-associated+isocitrate+dehydrogenase+1+(IDH1)+R132H+mutation+and+d-2-hydroxyglutarate+stimulate+glutamine+metabolism+under+hypoxia.">Cancer-associated isocitrate dehydrogenase 1 (IDH1) R132H mutation and d-2-hydroxyglutarate stimulate glutamine metabolism under hypoxia.</a> J Biol Chem. 289 (34), 23318-23328 (2014).</li><li>Nelson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+consumption+rate+v.+rate+of+energy+utilization+of+fishes:+a+comparison+and+brief+history+of+the+two+measurements.">Oxygen consumption rate v. rate of energy utilization of fishes: a comparison and brief history of the two measurements.</a> J Fish Biol. 88 (1), 10-25 (2016).</li><li>Liu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organochloride+pesticides+impaired+mitochondrial+function+in+hepatocytes+and+aggravated+disorders+of+fatty+acid+metabolism.">Organochloride pesticides impaired mitochondrial function in hepatocytes and aggravated disorders of fatty acid metabolism.</a> Sci Rep. 7, 46339 (2017).</li><li>Tien, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+Glucose+Induces+Mitochondrial+Dysfunction+in+Retinal+Muller+Cells:+Implications+for+Diabetic+Retinopathy.">High Glucose Induces Mitochondrial Dysfunction in Retinal Muller Cells: Implications for Diabetic Retinopathy.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 58 (7), 2915-2921 (2017).</li><li>Dussmann, H., Perez-Alvarez, S., Anilkumar, U., Papkovsky, D. B., Prehn, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+time-lapse+imaging+of+intracellular+O2+in+response+to+metabolic+inhibition+and+mitochondrial+cytochrome-c+release.">Single-cell time-lapse imaging of intracellular O2 in response to metabolic inhibition and mitochondrial cytochrome-c release.</a> Cell Death Dis. 8 (6), 2853 (2017).</li><li>Jaiswal, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Riluzole+But+Not+Melatonin+Ameliorates+Acute+Motor+Neuron+Degeneration+and+Moderately+Inhibits+SOD1-Mediated+Excitotoxicity+Induced+Disrupted+Mitochondrial+Ca2++Signaling+in+Amyotrophic+Lateral+Sclerosis.">Riluzole But Not Melatonin Ameliorates Acute Motor Neuron Degeneration and Moderately Inhibits SOD1-Mediated Excitotoxicity Induced Disrupted Mitochondrial Ca2+ Signaling in Amyotrophic Lateral Sclerosis.</a> Front Cell Neurosci. 10, 295 (2016).</li><li>Song, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lenti-siRNA+Hsp60+promote+bax+in+mitochondria+and+induces+apoptosis+during+heat+stress.">Lenti-siRNA Hsp60 promote bax in mitochondria and induces apoptosis during heat stress.</a> Biochem Biophys Res Commun. 481 (1-2), 125-131 (2016).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tea+tree+oil+exhibits+antifungal+activity+against+Botrytis+cinerea+by+affecting+mitochondria.">Tea tree oil exhibits antifungal activity against Botrytis cinerea by affecting mitochondria.</a> Food Chem. 234, 62-67 (2017).</li><li>Grunig, D., Felser, A., Bouitbir, J., Krahenbuhl, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+catechol-O-methyltransferase+inhibitors+tolcapone+and+entacapone+uncouple+and+inhibit+the+mitochondrial+respiratory+chain+in+HepaRG+cells.">The catechol-O-methyltransferase inhibitors tolcapone and entacapone uncouple and inhibit the mitochondrial respiratory chain in HepaRG cells.</a> Toxicol In Vitro. 42, 337-347 (2017).</li><li>Mayor, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G+protein-coupled+receptor+kinase+2+(GRK2)+as+an+integrative+signalling+node+in+the+regulation+of+cardiovascular+function+and+metabolic+homeostasis.">G protein-coupled receptor kinase 2 (GRK2) as an integrative signalling node in the regulation of cardiovascular function and metabolic homeostasis.</a> Cell Signal. , (2017).</li><li>Clark, A., Mach, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Crosstalk+between+the+Gut+Microbiota+and+Mitochondria+during+Exercise.">The Crosstalk between the Gut Microbiota and Mitochondria during Exercise.</a> Front Physiol. 8, 319 (2017).</li><li>Robicsek, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolated+Mitochondria+Transfer+Improves+Neuronal+Differentiation+of+Schizophrenia-Derived+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+and+Rescues+Deficits+in+a+Rat+Model+of+the+Disorder.">Isolated Mitochondria Transfer Improves Neuronal Differentiation of Schizophrenia-Derived Induced Pluripotent Stem Cells and Rescues Deficits in a Rat Model of the Disorder.</a> Schizophr Bull. , (2017).</li><li>Akinrotimi, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shp+deletion+prevents+hepatic+steatosis+and+when+combined+with+Fxr+loss+protects+against+type+2+diabetes.">Shp deletion prevents hepatic steatosis and when combined with Fxr loss protects against type 2 diabetes.</a> Hepatology. , (2017).</li><li>Rosa, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+insights+into+the+antioxidant+role+of+tauroursodeoxycholic+acid+in+experimental+models+of+Parkinson's+disease.">Novel insights into the antioxidant role of tauroursodeoxycholic acid in experimental models of Parkinson's disease.</a> Biochim Biophys Acta. , (2017).</li><li>Matondo, A., Kim, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted-Mitochondria+Antioxidants+Therapeutic+Implications+in+Inflammatory+Bowel+Disease.">Targeted-Mitochondria Antioxidants Therapeutic Implications in Inflammatory Bowel Disease.</a> J Drug Target. , 1-30 (2017).</li></ol>

Avgörande för att detektionsprotokollet ska lyckas är användningen av en mängd experimentella metoder som har täckts studien från fenotyp till mekanism. I denna studie, HepG2 celler odlades i DMEM med penicillin och streptomycin och 10% fetala nötkreatur serum. När celler nådde 40-50% sammanflödet, β-HCH (0, 10, 100 ng/mL) tillsattes och inkuberas i 24 h. Vi använde först TEM som visade de ultrastrukturella förändringar i hepatocyte orsakas av den representativa OCPs, β-HCH, som visar nedskrivningar av m...

Effekterna av organiska klorbekämpningsmedel (OCPs) på hälsan, t ex reproduktionsstörningar, immunologisk toxicitet, metaboliska förändringar har tidigare studerats1,2,3. Metoderna för att upptäcka cellulär metabolism och ta reda på mitokondriell dysfunktion har gjort det möjligt för forskare att förstå rollen av mitokondriell funktion (dvs., mitokondriellt STAT3 nivåer, laktat, pyruvat, laktat-till-pyruvat förhållande, coenzym Q10, mitokondriell protonläcka, bioenergika, biogenes, och dynamik) inom områden som åldrande, fetma, diabetes, kardiovaskulär funktion, cancer, och säkerhet toxicitet4,5,6,7. I detta dokument beskriver vi metoderna på att bedöma mitokondriell dysfunktion orsakas av OCPs.
Vi exponerade HepG2-celler för β-hexaklorokyclohexane (β- HCH), en representativ OCPs, för 24 h vid en dos som motsvarar intern exponering av människa. För det första tillämpades TEM för att observera den ultrastruktur av hepatocyter, såsom kärnor, mitokondrier och endoplasmatisk reticulum8. Jämfört med vanliga mikroskop, TEM gör det möjligt att utforska 2D och 3D ultra-struktur av celler och cellkomponenter (cellinjer eller vävnad), morfologi, kemisk sammansättning, samt funktion av naturliga eller konstgjorda material som spelar en central roll i modern vetenskap och teknik. Mitokondriell funktion utvärderades ytterligare av mitokondriell fluorescensintensitet, adenosin 5'-triphosphate (ATP) nivåer, syreförbrukningshastighet (OCR) och mitokondriell membranpotential (MMP)i HepG2-celler inkuberade med β-HCH. Mito-tracker grön är en mitokondrierna grön fluorescerande sond som kan användas för levande cell mitokondriell-specifika fluorescerande färgning. Mitokondrierna i hepatocyter var färgas av mito-tracker grön lösning och mitokondriell fluorescens intensitet, antal och mönster observerades med en confocal mikroskopi9. Mitokondriellt grön fluorescerande sond kan användas för att färga levande celler. Jämfört med rhodamin 123 eller JC-1, mitokondriellt grön fluorescerande sond inte beroende av mitokondriellt membran potential för mitokondriellt färgning. ATP-nivåer fastställdes av en luciferas-luciferin kit och normaliseras av protein koncentration. ATP-analyssats kan användas för att detektera ATP-nivåer i vanliga lösningar, celler eller vävnader. Detta kit är baserat på firefly luciferase katalyseras av fluorescein för att generera fluorescens, när ATP krävs för att ge energi. När firefly luciferas och fluorescein är överdriven, i ett visst koncentrationsområde, är generering av fluorescens proportionell mot koncentrationen av ATP. Dessutom har detta kit speciellt utformats för att optimera chemiluminescens av ATP. ATP, som de viktigaste energimolekylerna, spelar en viktig roll i cellernas olika fysiologiska eller patologiska processer. Förändringar i ATP-nivåer kan återspegla defekter i cellfunktion, särskilt mitokondriell energiproduktion. Vanligtvis under apoptos, nekros eller i något giftigt tillstånd, cellulära ATP-nivåer minskat 10. MMPs-assay kit med JC-1 är ett kit som använder JC-1 som en fluorescerande sond för att upptäcka celler, vävnader eller renas MMPs snabbt och känsligt. Det kan användas för tidig upptäckt av apoptos. Det katjoniska färgämnet JC-1 är en fluorescerande sond som används för att upptäcka MMP som kan analyseras under flödescytometri indikeras av förändringar av grön och röd fluorescensförhållande. När MMP är hög, JC-1 aggregeras i matrisen av mitokondrierna att bilda en polymer (J-aggregat), som producerar röda fluorescens. När MMP är låg, JC-1 kan inte ackumuleras, och bildar monomer som producerar grön fluorescens11. Så förhållandet mellan rött och grönt fluorescens kan återspegla nivån på MMP. Cellernas OCR är en avgörande indikator på normal cellulär funktion12. Det betraktas som en parameter till forskning mitokondriefunktion. Cells mito stresstestsats ger en stabil metod för att analysera nyckelparametrar av mitokondriell funktion. Satsen ger kvalitetskontroll och prediktiva reagenser samt en standardmetod för att utföra cellmitokondriellt stresstest. Det kan användas för att upptäcka alla celltyper, inklusive primära celler, cellinjer, upphängda celler, och även för holmar, nematoder, jäst och isolerade mitokondrier.
OCR-mätning kan ge värdefull insikt i cellernas fysiologiska status eller ombyggnader. det fastställdes med en extracellulära flux analysator för att upptäcka andning baslinjen, proton läcka, maximal luftvägarna, ATP omsättning och reserv kapacitet. I korthet, efter baslinjemätningar av OCR, upptäcktes OCR efter att sekventiellt lägga till oligomycin (ATP Coupler), FCCP (mitokondriellt oxidativ phosphorylation uncoupler) och antimycin A/rotenone (en hämmare av syreförbrukning)per brunn.
I ett försök att underlätta utvecklingen av mer specifika protokoll för att upptäcka mitokondriell funktion i hepatocyter in vitro, presenterar vi här experiment av TEM, confocal mikroskopi, luminometer, flödescytometri och extracellulära flux analysator med framtida tillämpning i att studera mitokondrierna skada relaterade negativa resultat.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:756px;" width="755">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td>Transmission electron microscope&#160;</td>
			<td>FEI</td>
			<td>Tecnai G2 Spirit Bio TWIN</td>
			<td>High-contrast, high-resolution imaging, Low-dose observation and imaging, Low-temperature observation, Outstanding analytical performance, Automation for convenience and performance</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:205px;">Mito-Tracker Green</td>
			<td style="width:69px;">Beyotime</td>
			<td style="width:161px;">C1048</td>
			<td style="width:320px;">Mito-Tracker Green is a mitochondrial green fluorescent probe that can be used for live cell mitochondrial-specific fluorescent staining.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="105" style="height:105px;width:205px;">Laser scanning confocal microscope</td>
			<td style="width:69px;">Zeiss</td>
			<td style="width:161px;">700B</td>
			<td style="width:320px;">The design is compact, stable, light path is the shortest, high light precision, creative technology and sophisticated scanning technology together to&#160; produce a perfect 3-dimensional specimen image.</td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:205px;">Enhanced ATP Assay Kit</td>
			<td style="width:69px;">Beyotime</td>
			<td style="width:161px;">S0027</td>
			<td style="width:320px;">Enhanced ATP Assay Kit can be used to detect ATP (adenosine 5&#39;-triphosphate) levels in common solutions, cells or tissues. Cells and tissue samples can be split to complete the sample preparation, detection sensitivity up to 0.1nmol / L, chemiluminescence can be sustained for 30 minutes.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:205px;">Luminometer</td>
			<td style="width:69px;">Berthold</td>
			<td style="width:161px;">Centro LB 960</td>
			<td style="width:320px;">Luminometer is chemiluminescence detector, the test sample itself can be light, do not need to stimulate. Luminometer is the instrument that detects chemiluminescence.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:205px;">BCA Protein Assay Kit</td>
			<td style="width:69px;">Beyotime</td>
			<td style="width:161px;">P0012</td>
			<td style="width:320px;">BCA Protein Assay Kit is one of the most commonly used methods for detecting protein concentrations.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="42" style="height:42px;width:205px;">Multimode reader</td>
			<td style="width:69px;">TECAN</td>
			<td style="width:161px;">InfiniteM200</td>
			<td style="width:320px;">Multimode reader be used to detect protein consentration.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

experimental protocol for detecting mitochondrial function in hepatocytes exposed to organochlorine pesticides

Detta dokument presenterar detaljerade metoder på att upptäcka hepatic mitokondriell funktion för en bättre förståelse av orsaken till metabola sjukdomar som orsakas av miljöorganoklorin bekämpningsmedel (OCPs) i hepatocyter. HepG2-celler exponerades för β- hexaklorokyclohexan (β- HCH) för 24 h vid en ekvivalent dos av intern exponering i den allmänna populationen. Ultrastructure i hepatocytes undersöktes av överföring elektronmikroskopi (TEM) att visa skador av mitokondrier. Mitokondriell funktion utvärderades ytterligare av mitokondriell fluorescensintensitet, adenosin 5'-triphosphate (ATP) nivåer, syreförbrukningshastighet (OCR) och mitokondriell membranpotential (MMP) i HepG2-celler inkuberade med β-HCH. Mitokondrierna fluorescens intensitet efter färgas av mitokondriellt gröna fluorescerande sond observerades med en fluorescens mikroskopi. Luciferin- luciferasreaktionen användes för att bestämma ATP-nivåer. MMP upptäcktes av katjoniska färgämnet JC-1 och analyseras under flödescytometri. OCR mättes med en extracellulär flux analysator. Sammanfattningsvis var dessa protokoll används för att upptäcka mitokondriell funktion i hepatocyter med att undersöka mitokondrier skadestånd.

Mitokondrierna cristae av HepG2 celler som utsätts för β-HCH var markant skadade. Spridda mitokondrierna var milt till markant expanderade, oregelbundet formade, och mitokondriell ås försvann med relativt onormal mitokondriell arkitektur (Figur 1).
Genomsnittlig mitokondriell grön fluorescensintensitet, som representerar mitokondrierna, minskade i HepG2-celler som exponerades för β-HCH (<str...

Watch this Scientific Journal Video about Experimental Protocol for Detecting Mitochondrial Function in Hepatocytes Exposed to Organochlorine Pesticides at JoVE.com

Experimental Protocol for Detecting Mitochondrial Function in Hepatocytes Exposed to Organochlorine Pesticides

Förstå påverkan av miljöorganoklorin bekämpningsmedel (OCPs) på mitokondriell funktion i hepatocyter är viktigt att utforska mekanismen för OCPs orsakar metabola sjukdomar. Detta dokument presenterar detaljerade metoder på att upptäcka hepatic mitokondriell funktion.

Experimentellt protokoll för att upptäcka mitokondriell funktion i hepatocyter som utsätts för organiska klorbekämpningsmedel

This paper presents detailed methods on detecting hepatic mitochondrial function for a better understanding the cause of metabolic disorders caused by ...

Det är en messer som kallar svara på en viktig fråga som du har i också en funktion av fält som ATP-nivå och syreförbrukning priser. Den nya eller en sida gammal, denna teknik är att det är lätt att utföra och det är mycket för en särskild utvärdering av cellulära mitokondriell funktion. För att starta detta experiment, frö 20, 000 HepG2 celler i en glasbotten Petriskål.Tillsätt beta-hexaklorcyklopein eller B-HCH i inkubator vid 37 grader Celsius och fem procent CO2 i 24 timmar. Förbered en millimolär mitokondriell grön fluorescens sond lösning genom att lägga vattenfri DMSO till DMEM cellodling medium. Tillsätt sedan en milliliter per maträtt av denna lösning till cellerna i glasbotten Petriskålar.Och inkubera vid 37 grader Celsius i 45 minuter. Efter inkubationen, ta bort den mitokondriella gröna fluorescerande sondlösningen från cellerna. Lägg till en milliliter per maträtt av nyberedda vid 37 grader Celsius DMEM cellkultur medium.För att upptäcka grön fluorescens i mitokondrier, observera cellerna under ett konfokalmikroskop. För att utvärdera nivåer av cellulära ATP, utsäde till 20, 000 HepG2 celler i sex brunn plattor. Lägg till beta-HCH och inkubera i 37 grader Celsius i 24 timmar.Tillsätt 200 mikroliter av lysbuffert till cellerna i varje brunn. Centrifugera vid 12, 000 gånger G i fem minuter vid fyra grader Celsius, och fortsätt med att samla supernatant som beskrivs i textprotokollet. Lägg till 100 microliters ATP-detektionsbuffert till plattan.Tillsätt 100 mikroliter av uppsamlad cell supernatant till en 96 brunnsplatta vid rumstemperatur och fortsatte att upptäcka cellulära ATP genom en luminometer enligt beskrivningen i textprotokollet. För bedömning av mitokondriellt membran potential, växa HepG2 celler i sex brunn plattor med tillsats av beta-HCH, som tidigare beskrivits. Samla in cellerna genom att smälta dem med 0,5 milliliter 0,25%EDTA i en minut vid 37 grader Celsius.Lägg till en milliliter DMEM för att stoppa matsmältningen och överföra de smälta cellerna till 1,5 milliliter rör. Centrifugera rören vid 1000 gånger G i tre minuter, och sedan kasta supernatanten. Späd cellpelleten med 0,5 milliliter cellodlingsmedium och 0,5 milliliter JC1 mitokondriellt membranpotentialfärgämne.Och inkubera i 20 minuter vid 37 grader Celsius. Därefter centrifugera rören vid 600 gånger G i tre minuter vid fyra grader Celsius, och tvätta sedan cellpelleten enligt textprotokollet. Efter centrifugering av den tvättade pelleten, ta bort supernatanten.Och åter avbryta pelleten i 0,5 milliliter JC1 färgning buffert. Analysera JC1-färgade cellerna via flödescytometri för att upptäcka grön och röd fluorescens. När JC1 monomeren detekteras, ställ excitationslampan på 490 nanometer och utsläppslampan på 530 nanometer.När JC1-polymeren detekteras, ställ excitationsljuset på 525 nanometer och utsläppsljuset på 590 nanometer. För att analysera syreförbrukningshastigheten, utsäde HepG2 celler i en 96 väl cellodling plattan i en densitet av 4, 500 celler per 100 mikroliter per brunn. Efter 24 timmars inkubation vid 37 grader Celsius, se till att cellerna i varje brunn är täckta med medium.Innan du kör OCR-programvaran, ladda mikroplattan med patron och cellodlingsplattan i en extracellulär fluxanalysator enligt beskrivningen i textprotokollet. Öppna OCR-programvaran och i apparna rullgardinsmenyn, välj cell mito stresstest kit, och klicka på startappen knappen. Klicka därefter på knappen kör stresstest.När skärmen för cellstresstest visas anger du antalet celler som sås per brunn i rutan cellsådd nummer och medelvärdet OCR i medelvärdet vid basalcell OCR-rutan. Ange den slutliga arbetskoncentrationen för varje reagens och injicera sedan reagenserna. Klicka på nästa knapp.När skärmen för gruppinfo visas tilldelar du en grupp till ej tilldelade brunnar genom att välja en färg och ge ett namn. Klicka sedan på lämpliga brunnar. Klicka på nästa knapp och i stresstestet injektion layout skärmen som visas, klicka på start för att köra stresstest på analysatorn.Efter den slutförda körningen följer du uppmaningarna i programvaran och tar sedan bort och kasserar patronen och cellplattan. Medelintensiteten av mitokondriellt grön fluorescerande färgning minskade i HepG2-celler som exponerades för beta-HCH. Detta visar att det finns en minskning av mitokondriellt antal och ökning av skadade mitokondrierna överensstämmer med ökningen av koncentrationen av bekämpningsmedel.Vidare minskade ATP-nivåerna i HepG2-celler med de ökade koncentrationerna av beta- HCH-exponering, vilket visade den minskade funktionen av mitokondrier i dessa celler. Efter JC1 färgning för mitokondriellt membran potential, eller MMP, flöde cytometer visade hög röd grön JC1 fluorescens i intakt HepG2 celler. Detta berodde på förekomsten av röda fluorescerande JC1 aggregat, som är ett tecken på hög MMP.I celler som behandlats med beta-HCH, röd grön JC1 fluorescens minskade på grund av en förekomst av gröna fluorescerande JC1 monomerer, ett tecken på låg MMP. Slutligen minskade också syreförbrukningen med de ökade koncentrationerna av beta-HCH-exponering, vilket ytterligare visar att detta bekämpningsmedel försämrar korrekt mitokondriell funktion. Åh, ja, försök till detta förfarande, det är viktigt dock, att komma ihåg att se att celler som lämpligt att testa den.Efter dess utveckling, detta definitivt banar ett sätt för forskningar inom området grundläggande funktion att utforska relevanta organismer i den medicinska roll som är associerad med den. Efter att ha sett den här videon, bör du ha en god förståelse för hur man upptäcker en mängd eller kvalitet, kapacitet, nu medlem eller potentiella under pipa ark funktion.

Research

JoVE Journal

Environment

Experimental Protocol for Manipulating Plant-induced Soil Heterogeneity

Experimentell Protokoll för Manipulera växt-inducerad Soil Heterogenitet

Coexistence theory has often treated environmental heterogeneity as being independent of the community composition; however biotic feedbacks such as ...

A Protocol for Conducting Rainfall Simulation to Study Soil Runoff

Ett protokoll för Genomföra Regn simulering för att studera mark Avrinning

Rainfall is a driving force for the transport of environmental contaminants from agricultural soils to surficial water bodies via surface runoff. The ...

LC-MS Analysis of Human Platelets as a Platform for Studying Mitochondrial Metabolism

LC-MS-analys av humana blodplättar som en plattform för att studera Mitochondrial Metabolism

Perturbed mitochondrial metabolism has received renewed interest as playing a causative role in a range of diseases. Probing alterations to metabolic ...

Characterization and Application of Passive Samplers for Monitoring of Pesticides in Water

Karakterisering och tillämpning av passiva provtagare för övervakning av bekämpningsmedel i vatten

Five different water passive samplers were calibrated under laboratory conditions for measurement of 124 legacy and current used pesticides. This study ...

Experimental Protocol for Biodiesel Production with Isolation of Alkenones as Coproducts from Commercial Isochrysis Algal Biomass

Experimental Protocol for Biodiesel Production with Isolation of Alkenones as Coproducts from Commercial Isochrysis Algal Biomass

Experimentellt protokoll för produktion av biodiesel med isolering av Alkenones som samprodukter från Commercial<em&gt; Isochrysis</em&gt; Algbiomassa

The need to replace petroleum fuels with alternatives from renewable and more environmentally sustainable sources is of growing importance. ...

Experimental Protocol for Detecting Cyanobacteria in Liquid and Solid Samples with an Antibody Microarray Chip

Experimental Protocol for Detecting Cyanobacteria in Liquid and Solid Samples with an Antibody Microarray Chip

Experimentellt protokoll för att upptäcka<em&gt; Cyanobakterier</em&gt; I flytande och fasta prover med en antikropp microarray Chip

Global warming and eutrophication make some aquatic ecosystems behave as true bioreactors that trigger rapid and massive cyanobacterial growth; this has ...

Extraction of Organochlorine Pesticides from Plastic Pellets and Plastic Type Analysis

Extraktion av organiska klorpesticider från plastpellets och plasttypsanalys

Plastic resin pellets, categorized as microplastics (&#8804;5 mm in diameter), are small granules that can be unintentionally released to the environment ...

Video Tracking Protocol to Screen Deterrent Chemistries for Honey Bees

Video Tracking Protocol till Screen Deterrent Chemistries för honungsbinnar

The European honey bee, Apis mellifera L., is an economically and agriculturally important pollinator that generates billions of dollars annually. Honey ...

Experimental Protocol for Examining Behavioral Response Profiles in Larval Fish: Application to the Neuro-stimulant Caffeine

Experimentellt protokoll för att pröva beteendemässiga svar profiler i Larval fisk: ansökan till Neuro-stimulerande koffein

Fish models and behaviors are increasingly used in the biomedical sciences; however, fish have long been the subject of ecological, physiological and ...

An Experimental Protocol for Studying Mineral Effects on Organic Hydrothermal Transformations

Ett experimentellt protokoll för att studera Mineral effekter på organiska hydrotermiska transformationer

Organic-mineral interactions are widely occurring in hydrothermal environments, such as hot springs, geysers on land, and the hydrothermal vents in the ...