Name: evaluation of stem cell therapies in a bilateral patellar tendon injury model in rats
Uploaded: 2018-03-30T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Stem Cell Therapies in a Bilateral Patellar Tendon Injury Model in Rats at JoVE.com

Forfatterne vil gerne anerkende Dr. Su, ph.d., for hendes statistisk analyse af data. Forfatterne også takke Dr. McClure, DVM, ph.d.-DACLAM, for hendes råd om anæstesi og pain management protokoller bruges i undersøgelsen. Dette projekt blev støttet af tilskud fra Western University of Health Sciences Office af Vice President for forskning (12678v) og USDA afsnit 1433 midler (2090).

Alle metoder beskrevet her er blevet godkendt af institutionelle Animal Care og brug udvalg (IACUC) af Western University of Health Sciences.
1. isolering og udvidelse af MSCs fra Equine navlestrengen Matrix
<ol><li>Få moderkagen fra en voksen mare (gravid) efter observeret foedselslandets og aseptisk isolere navlestreng fra moderkagen. Holde navlestrengen i fosfatbufferet saltopløsning (PBS) med 1% penicillin-streptomycin (P/S) ved 4 ° C under overførsel indtil behandling.</li>
	<li>Vas...

Equine celler blev udvalgt til dette projekt, fordi vi i sidste ende har til hensigt at teste kandidat tilgange i forvaltningen af naturlige tendinopathies i heste. Senen skader hos heste er faktisk tiltrækkende som naturlige modeller af tendinopati i mand på grund af den biologiske lighed mellem equine overfladiske digital flexor og achillessenen i mennesker41. Celle celleoverflademarkører CD44, CD90, CD105, CD34 og MHC II blev udvalgt til Immunofænotypning af celler, i overensstemmelse med d...

Senen skade er en af de mest almindelige årsager til betydelige smerter og muskel atrofi på tværs af arter1. I veterinærmedicin er sener og ledbånd skader af særlig interesse for heste, som 82% af alle personskader i væddeløbsheste indebærer bevægeapparatet, og 46% af dem påvirker sener og ledbånd2,3. Arvæv dannelse påvirker de biomekaniske egenskaber af helede sener og forklarer bevogtet prognosen for tilbagevenden til athletic brug efter flexor senen skader; re-skade, der opstår i løbet af 2 år op til 67% af heste behandles konservativt4. Regenerativ medicin giver nye alternativer til en betingelse, der udfordrer traditionelle behandlinger. Autolog stamcelleterapi har produceret nogle opmuntrende resultater5,6 , men er begrænset af de sygelighed forbundet med væv samling, forsinket administration som følge af forarbejdning/omprogrammering af celler og påvirkning af den patientens sundhedstilstand (f.eks. alder) på egenskaber af stamceller-celler7,8. Disse begrænsninger give et rationale for at undersøge allogene stamceller som off-the-shelf alternativ. Føtal adnexa-afledte celler er tiltalende kandidater, fordi de omgå de etiske bekymringer og risikoen for teratom formation forbundet med embryonale stamceller. Blandt føtal adnexa er navlestrengen matrix (UCM), også kaldet Wharton's Jelly, rigelig og let at samle.
Uanset celle kilde er forbedring af stemness afgørende at etablere en celle bank for allogen regenerativ medicin. Fra et funktionelt synspunkt, kan stemness defineres som potentialet for selvfornyelse og multi lineage differentiering9. Dokumentation af stemness bygger på spredning og differentiering assays, sammen med udtryk af genet markører Oct4, Sox2, og Nanog9. En strategi til at forbedre stemness er baseret på brugen af biomaterialer at tjene som ugyldige fyldstoffer og luftfartsselskaber forbedre spredning og differentiering af UCM-MSCs. Denne fremgangsmåde fjerner bekymringer med hensyn til manipulation af transcriptional faktorer til at omprogrammere voksne celler inducerede pluripotente celler. Blandt biomaterialer betragtes som potentielle smittebærere for stamceller, er chitosan tiltrækkende for sin biokompatibilitet og nedbrydelighed10. Denne naturlige aminopolysaccharide er dannet af alkalisk deacetylation af kitin, den anden mest rigelige naturlige polysaccharid, primært fremstillet som et subproduct skaldyr10. Vi har tidligere undersøgt samspillet mellem MSCs og chitosan stilladser og observeret dannelsen af spheroids11,12,13,14,15, 16. vi også rapporteret om overlegenhed af chondrogenesis chitosan matricer12,13,14,15,16,17, 18. For nylig, to uafhængige undersøgelser beskrevet spheroids dannelsen af fedtvæv og moderkage væv udvundet MSCs kulturperler på en chitosan film19,20. Denne dannelse af spheroids ikke kun forbedret stemness, men også forbedret fastholdelse af stamceller efter i vivo implantation20.
Prævalens og sygelighed af tendinopati på tværs af arter har bedt om udviklingen af eksperimentelle modeller til at studere Patofysiologi af tendinopathies og teste nye behandlinger såsom stamcelle injektioner. I heste er collagenase-induceret senebetændelse en fælles model til at påvise effektiviteten ved hjælp af MSCs i senen reparation21. Relevansen af denne tilgang er begrænset, da injektioner forårsage akut inflammatoriske forandringer, der henviser til, at klinisk tendinopathies sædvanligvis et resultat af kronisk overanstrenger22,23. Derudover kemiske induktion af senen sygdom inducerer en healing svar og replikerer ikke nedsat helingsprocessen i kliniske tilfælde22,23. Excision af et segment af overfladiske digital flexor senen er blevet beskrevet som en kirurgisk model af senebetændelse i heste24. For nylig, en minimalt invasiv metode blev brugt til at begrænse de traumatiske skader til den centrale kerne af overfladiske digital flexor sene25. Kirurgisk modeller ikke simulere den træthed mekanisme, der kan føre til naturlige senen sygdom, og har tendens til at mangle reproducerbarhed i omfanget af skader oprettet25. Uanset model, sygelighed og omkostningerne forbundet med equine modeller af senen er sygdomme yderligere begrænsninger, som berettiger en interesse i gnavere modeller som et første skridt i vivo evaluering af nye behandlingsformer.
En af de vigtigste fordele ved eksperimentelle modeller i gnavere består af omkostninger og muligheden for at styre mellem individuelle variation. Gnavere kan være standardiseret med hensyn til forskellige fysiologiske faktorer på grund af deres hurtige vækst og korte relativt levetider, begrænse kilder til variation og derfor reducerer antallet af dyr, der kræves til at opdage forskelle. Strategier til at fremkalde senen sygdomme hos gnavere har stolet på kemiske induktion, men også på kirurgisk oprettelsen af delvis senen defekter21. Kirurgisk modeller kan simulere naturlige tendinopathies bedre end kemiske modeller, men kan føre til højere sygelighed og katastrofale svigt af beskadigede senen. I henseende synes rotter bedre kandidater end mus for disse modeller, da deres størrelse giver mulighed for skabelse af større fejl, derved at lette evalueringen af væv healing. Sprague-Dawley rotter har været brugt i eksperimentelle studier af tendinopathies i fire store senen grupper: rotator cuff, flexor, Achilles og patella sener26. Blandt disse er modeller der involverer patellar senen særligt tiltrækkende på grund af den større størrelse af denne sene og nem adgang til den27. Patellar senen tillægger den tibial tuberositas quadriceps muskler. Inden for denne extensor mekanisme er patella en sesamoid knogle, der dirigerer handlingen af quadriceps og skildrer det proksimale omfanget af patellar senen. Tilstedeværelsen af benede ankre på de proksimale og distale udvidelser af patellar senen letter biomekaniske tests. Modeller der involverer patellar senen typisk stole på ensidig kirurgisk defekter, med en kontralaterale intakt senen tjener som en kontrol28,29. Den mest almindelige patellar senen defekt model indebærer udtagelse den centrale del (1 mm i bredden) af patellar senen fra den distale spids af knæskallen til indsættelsen af den tibial tuberositas, mens de kontralaterale patellar senen er overladt intakt. Foranstaltninger af resultater har inkluderet histologi, ikke-destruktiv biomekaniske prøvning eller biomekaniske test fiasko, ultrasound imaging, ex vivo fluorescens imaging, brutto observation og funktionsprøver28,30 ,31. Ensidige modeller tillader ikke sammenligning af en foreslået behandling med konservative ledelse for en lignende skade inden for de samme dyr. Tilsvarende kræver sammenligning mellem flere behandlinger separate dyr. En bilaterale model ville eliminere mellem individuelle variationer og reducere antallet af dyr, der kræves for en undersøgelse32. Imidlertid bilaterale skader kan øge sygelighed, og bilaterale halthed kunne hindre behandling evaluering. Et par undersøgelser rapport kort brugen af bilaterale patellar senen defekter i rotter, men fokuserer på virkningerne af behandlinger i stedet for peri-operative ledelse og sygelighed af model33,34.
Denne undersøgelse langsigtede mål er at udvikle en strategi for at forbedre stemness og i vivo overlevelse af UCM-MSCs bestemt til allogen transplantation. For at nå dette mål har vi for nylig rapporteret forbedret stemness af UCM-MSCs ved dannelsen af spheroids på chitosan film og inkubering under hypoksiske miljø35. Disse in vitro- egenskaber var forbundet med forbedret biomekaniske egenskaber af patellar senen defekter behandles med konditioneret UCM-MSCs. baseret på disse resultater, rotte bilaterale patellar senen defekt model synes passende at teste kandidat behandlinger for senen skader36. Formålet med undersøgelsen rapporterede her er at give detaljerede protokoller til isolering og karakterisering af UCM-MSC'er, forberedelse af en biologiske leveringssystemet for stamceller, oprettelse og behandling af bilaterale patella senen defekter og postoperativ Recovery og evaluering af væv, healing inden for fejl.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>PBS 10X</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30258.01</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type IA</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004197</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM low glucose</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30021.FS</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30910.03</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin 100X</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SV30010</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 0.25%</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30042.01</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Innovative Cell Technologies</td>
			<td>AT104</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SV30084.01</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chitosan</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3646</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8045</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30574.01</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round bottom polystyrene tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>149591A</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-horse CD44 (FITC)</td>
			<td>AbD serotec</td>
			<td>MCA1082F</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-rat CD90 (FITC)</td>
			<td>AbD serotec</td>
			<td>MCA47FT</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-horse MHC-II (FITC)</td>
			<td>AbD serotec</td>
			<td>MCA1085F</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG1 (FITC) - Isotype Control</td>
			<td>AbD serotec</td>
			<td>MCA928F</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal [SN6] to CD105 (FITC)</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab11415</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG1 (FITC) - Isotype Control</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab91356</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-human CD34 (FITC)</td>
			<td>BD</td>
			<td>BDB560942</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IdG1 kappa (FITC)</td>
			<td>BD</td>
			<td>BDB555748</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7-AAD</td>
			<td>BD</td>
			<td>BDB559925</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Accuri C6 Flow Cytometer</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacutainer 5ml</td>
			<td>Med Vet International</td>
			<td>RED5.0</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acid-citrate-dextrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3821</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5670</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sevoflurane</td>
			<td>JD Medical</td>
			<td>60307-320-25</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rats</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>Strain code: 400</td>
			<td>Experimental animal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat surgical kit</td>
			<td>Harvard apparatus</td>
			<td>728942</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Blade #15</td>
			<td>MEDLINE</td>
			<td>MDS15115</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat MD&#39;s Baytril (2 mg/Tablet), 
			Rimadyl (2 mg/Tablet)</td>
			<td>Bio Serv</td>
			<td>F06801</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyglactin 910, 5-0</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>J436G</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin alchol shandon</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>6766007</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harris Hematoxylin</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>143907</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of stem cell therapies in a bilateral patellar tendon injury model in rats

Regenerativ medicin giver nye alternativer til forhold, der udfordrer traditionelle behandlinger. Prævalens og sygelighed af tendinopati på tværs af arter, har kombineret med de begrænsede helbredende egenskaber af dette væv, bedt om søgning efter cellulære terapier og fremdrives udviklingen af eksperimentelle modeller at studere deres effektivitet. Navlestrengen matrix-afledte mesenkymale stamceller (UCM-MSC) er tiltalende kandidater, fordi de er rigelige, nem at samle, omgå de etiske bekymringer og risikoen for teratom dannelse, men ligner primitive embryonale stamceller tættere end voksen væv-afledte MSCs. betydende interesse har fokuseret på chitosan som en strategi til at forbedre egenskaberne af MSCs gennem klumpformet dannelse. Dette papir detaljer teknikker til at isolere UCM-MSC'er, forberede spheroids på chitosan film, og analysere effekten af klumpformet dannelse på overfladen markør udtryk. Derfor er skabelsen af en bilateral patellar senen skade model i rotter beskrevet for i vivo implantation af UCM-MSC spheroids dannet på chitosan film. Ingen komplikation blev observeret i undersøgelsen med hensyn til morbiditet, understreger stigende effekter, eller væv infektion. Den samlede funktionelle score på de opererede rotter på 7 dage var lavere end normale rotter, men vendte tilbage til normal inden for 28 dage efter operationen. Histologiske snesevis af væv-healing bekræftet tilstedeværelsen af en blodprop i behandlede defekter evalueres på 7 dage, manglende udenlandske krop reaktion, og forløbet helbredende på 28 dage. Denne bilaterale patella senen defekt model var styrer Inter individuel variation via oprettelsen af en intern kontrol i hver rotte, forbundet med acceptabel sygelighed, og tilladt registrering af forskelle mellem ubehandlet sener og behandlinger.

Resultaterne præsenteres i den aktuelle undersøgelse, da betyde ± SD (standardafvigelse). Celler blev isoleret fra umbilical snore af 6 hopper, og procentdelen af isolerede cellelinjer udtrykker hver celle overflade markør under standard eller chitosan conditioning blev sammenlignet med en Friedman test, som en ikke-parametrisk variansanalyse med gentagne foranstaltninger. For sene defekt modeloprettelse, 8 rotter blev brugt til 7 dage efter operationen vurdering og 12 rotter blev bru...

Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Stem Cell Therapies in a Bilateral Patellar Tendon Injury Model in Rats at JoVE.com

Evaluation of Stem Cell Therapies in a Bilateral Patellar Tendon Injury Model in Rats

Evaluering af stamceller behandlinger i en Bilateral Patellar senen skade Model i rotter

Dette papir beskriver forberedelse og evaluering af navlestreng matrix-afledte mesenkymale stamceller spheroids med en bilateral patellar senen defekt model i en rotte. Denne model blev var forbundet med en acceptabel sygelighed og fundet til at opdage forskelle mellem ubehandlet og behandlede sener, og mellem de to behandlinger testet.

Regenerative medicine provides novel alternatives to conditions that challenge traditional treatments. The prevalence and morbidity of tendinopathy across ...

Research

JoVE Journal

Medicine

A Mouse Model of in Utero Transplantation

A Mouse Model of in Utero Transplantation

The transplantation of stem cells and viruses in utero has tremendous potential for treating congenital disorders in the human fetus.  For example, in ...

A Contusion Model of Severe Spinal Cord Injury in Rats

En Kontusion Model of Svær Rygmarvsskader i rotter

The translational potential of novel treatments should be investigated in severe spinal cord injury (SCI) contusion models. A detailed methodology is ...

A Radio-telemetric System to Monitor Cardiovascular Function in Rats with Spinal Cord Transection and Embryonic Neural Stem Cell Grafts

En radio-telemetri system til overvågning Kardiovaskulær funktion i rotter med Spinal Cord transection og embryonale neural stamcelle transplantater

High thoracic or cervical spinal cord injury (SCI) can lead to cardiovascular dysfunction. To monitor cardiovascular parameters, we implanted a catheter ...

Neural Stem Cell Transplantation in Experimental Contusive Model of Spinal Cord Injury

Neural stamcelletransplantation i Eksperimentel Contusive Model for Rygmarvsskader

Spinal cord injury is a devastating clinical condition, characterized by a complex of neurological dysfunctions. Animal models of spinal cord injury can ...

Evaluation of the Efficacy of the H. pylori Protein HP-NAP as a Therapeutic Tool for Treatment of Bladder Cancer in an Orthotopic Murine Model

Evaluation of the Efficacy of the H. pylori Protein HP-NAP as a Therapeutic Tool for Treatment of Bladder Cancer in an Orthotopic Murine Model

Evaluering af effekten af<em&gt; H. pylori</em&gt; Protein HP-NAP som et terapeutisk værktøj til behandling af blærekræft i en ortotopisk murin model

Bladder cancer is one of the most common malignancies of the urogenital tract. Intravesical injection of Bacillus Calmette-Gu&#233;rin (BCG) is the gold ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Studere i bugspytkirtlen Kræft stamceller Karakteristik for udvikling af nye behandlingsstrategier

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

A Neonatal Mouse Spinal Cord Compression Injury Model

En Neonatal Mouse rygmarvskompression Skade Model

Spinal cord injury (SCI) typically causes devastating neurological deficits, particularly through damage to fibers descending from the brain to the spinal ...

Murine Flexor Tendon Injury and Repair Surgery

Murine Flexor seneskade og reparation kirurgi

Tendon connects skeletal muscle and bone, facilitating movement of nearly the entire body. In the hand, flexor tendons (FTs) enable flexion of the fingers ...

Balloon-based Injury to Induce Myointimal Hyperplasia in the Mouse Abdominal Aorta

Ballon-baserede skade til at fremkalde Myointimal hyperplasi i mus Abdominal Aorta

The use of animal models is essential for a better understanding of MH, one major cause for arterial stenosis.In this article, we demonstrate a murine ...

Evaluation of Coronary Flow Reserve After Myocardial Ischemia Reperfusion in Rats

Evaluering af koronar flow reserve efter myokardieiskæmi reperfusion hos rotter

Coronary artery disease is the leading cause of death worldwide. After an acute myocardial infarction, early and successful myocardial intervention via ...