Name: evaluation of stem cell therapies in a bilateral patellar tendon injury model in rats
Uploaded: 2018-03-30T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Stem Cell Therapies in a Bilateral Patellar Tendon Injury Model in Rats at JoVE.com

De auteurs wil erkennen van Dr. Su, PhD, voor haar statistische analyse van de gegevens. De auteurs Dr. McClure, DVM, PhD DACLAM, ook bedanken voor haar advies over de narcose en pijn beheerprotocollen gebruikt in de studie. Dit project werd ondersteund door subsidies van Western University of Health Sciences Bureau van de ondervoorzitter voor onderzoek (12678v) en de USDA sectie 1433 fondsen (2090).

Alle methoden die hier worden beschreven zijn goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) van Western University of Health Sciences.
1. isolatie en uitbreiding van MSCs uit paarden navelstreng Matrix
<ol><li>De placenta verkrijgen door een volwassen merrie (zwanger) na waargenomen veulenen en aseptisch isoleren de navelstreng van de moederkoek. Houd de navelstreng in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) met 1% penicilline-streptomycine (P/S) bij 4 ° C tijdens ...

Paarden cellen werden geselecteerd voor dit project, omdat we uiteindelijk willen beproeven van kandidaat-benaderingen in het beheer van de natuurlijke Tendinopathieën in paarden. Inderdaad, pees blessures bij paarden zijn aantrekkelijk als natuurlijke modellen van tendinopathie in de mens vanwege de biologische gelijkenis tussen de paarden oppervlakkige digitale flexor en achillespees in mens41. De cel oppervlakte markers CD44, CD90, CD105, CD34 en MHC II werden geselecteerd voor immunophenotypi...

Pees letsel is een van de meest voorkomende oorzaken van aanzienlijke pijn en spier atrofie over soorten1. In de diergeneeskunde zijn pees en een ligament letsel speciale belangstelling voor paarden, en 82% van alle blessures bij RAS paarden impliceren het houdings-en bewegingsapparaat, 46% van die van invloed zijn op pezen en ligamenten2,3. Littekenvorming is van invloed op de biomechanische eigenschappen van genezen pezen en verklaart de bewaakte prognose voor terugkeer naar atletische gebruik na flexor pees verwondingen; Re-blessure treedt op binnen 2 jaar in maximaal 67% van de paarden behandeld conservatief4. Regeneratieve geneeskunde biedt nieuwe alternatieven voor een aandoening die traditionele behandelingen daagt. Autologe stamcel therapie heeft enkele bemoedigende resultaten5,6 , maar wordt beperkt door de morbiditeit geassocieerd met weefsel collectie, vertraagde administratie als gevolg van verwerking/herprogrammering van de cellen en de invloed van de gezondheidstoestand van de patiënt (zoals leeftijd) op de eigenschappen van de stam cellen7,8. Deze beperkingen geven een reden voor het onderzoeken van allogene cellen van de stam als alternatief off-the-shelf. Foetale adnexen-afgeleide cellen zijn aantrekkelijke kandidaten omdat ze omzeilen de ethische bezwaren en de kans op vorming van Teratoom embryonale stamcellen is gekoppeld. Onder foetale adnexen is navelstreng matrix (UCM), gelei van Wharton, ook wel genoemd overvloedig en gemakkelijk te verzamelen.
Ongeacht de bron van de cel is versterking van de stemness essentieel voor het opzetten van een cel bank voor allogene regeneratieve geneeskunde. Vanuit een functioneel oogpunt, kan stemness worden gedefinieerd als de mogelijkheden voor zelf-vernieuwing en multi lineage differentiatie9. Bewijs van stemness is afhankelijk van de proliferatie en differentiatie testen, samen met expressie van gene markeringen Nanog, Oct4en Sox2, 9. Een strategie ter verbetering van de stemness is afhankelijk van het gebruik van biomaterialen om te dienen als ongeldig vulstoffen en verbetering van de proliferatie en differentiatie van de UCM-MSCs vervoerders. Deze benadering elimineert bezorgdheid over manipulatie van transcriptionele factoren om te herprogrammeren van volwassen cellen in geïnduceerde pluripotente cellen. Onder biomaterialen beschouwd als potentiële dragers voor stamcellen, is chitosan aantrekkelijk voor de biocompatibiliteit en afbreekbaarheid10. Deze natuurlijke aminopolysaccharide wordt gevormd door de alkalische deacetylation van chitine, de tweede meest voorkomende natuurlijke polysacharide, hoofdzakelijk verkregen als een subproduct van schelpdieren10. We hebben eerder onderzocht van interacties tussen MSCs en chitosan steigers en waargenomen de vorming van spheroïden11,12,13,14,15, 16. we ook gemeld op de superioriteit van chondrogenesis op chitosan matrices12,13,14,15,16,17, 18. Meer recentelijk, twee onafhankelijke studies beschreven spheroïden formatie door vetweefsel en weefsel van de placenta afgeleid MSCs gekweekt op een chitosan film19,20. Deze formatie van spheroïden niet alleen verbeterd stemness, maar ook het behoud van stamcellen na in vivo implantatie20verbeterd.
De prevalentie en de morbiditeit van tendinopathie over soorten hebben gevraagd de ontwikkeling van experimentele modellen bestuderen de pathofysiologie van Tendinopathieën en testen van nieuwe therapieën zoals stamcel injecties. Bij paarden is collagenase-geïnduceerde tendinitis een gemeenschappelijk model aan doelmatigheid met behulp van MSCs in pees reparatie21aan te tonen. De relevantie van deze aanpak is beperkt, zoals injecties veroorzaken acute ontstekingsreactie, overwegende dat klinische Tendinopathieën meestal het gevolg van chronische overspannenheid22,23. Bovendien, chemische inductie van pees ziekte induceert een genezende reactie en het verminderde genezingsproces aanwezig in klinische gevallen22,23niet gerepliceerd. Excisie van een segment van de oppervlakkige digitale flexor pees is bestempeld als een chirurgische model van tendinitis in paarden24. Meer recentelijk, een minimaal invasieve benadering werd gebruikt om de traumatische schade beperken tot de centrale kern van de oppervlakkige digitale flexor pees25. Chirurgische modellen doen niet de vermoeidheid-mechanisme dat kan leiden tot natuurlijke pees ziekte, en de neiging om het gebrek aan reproduceerbaarheid in de omvang van schade gemaakt25simuleren. Ongeacht het model, de morbiditeit en de kosten in verband met paarden modellen van pees zijn ziekten extra beperkingen, die een belang in knaagdier modellen te als een eerste stap voor in vivo evaluatie van nieuwe therapieën rechtvaardigen.
Een van de belangrijkste voordelen van experimentele modellen bij knaagdieren bestaat uit de kosten en de mogelijkheid om controle van Inter individuele variabiliteit. Knaagdieren kunnen worden gestandaardiseerd ten opzichte van verschillende fysiologische factoren als gevolg van hun snelle groei en relatief korte levensduur, beperking van de bronnen van variatie en dus vermindering van het aantal dieren nodig voor de detectie van verschillen. Strategieën voor het opwekken van de pees ziekten bij knaagdieren hebben vertrouwd op chemische inductie, maar ook op chirurgische oprichting van gedeeltelijke pees gebreken21. Chirurgische modellen natuurlijke Tendinopathieën beter dan chemische modellen kunnen simuleren, maar kunnen leiden tot hogere morbiditeit en katastrofisch mislukking van de beschadigde pees. In dat opzicht lijken ratten betere kandidaten dan muizen voor deze modellen, aangezien hun grootte staat toe de verwezenlijking van grotere defecten, teneinde de evaluatie van de genezing van weefsel te vergemakkelijken. Sprague-Dawley ratten zijn gebruikt in experimentele studies van Tendinopathieën in vier belangrijke pees groepen: rotator cuff, musculus flexor, Achilles en patellacomponenten pezen26. Daaronder zijn de modellen waarbij de Patellaire pees vooral aantrekkelijk vanwege de grotere omvang van deze pees en het gemak van toegang tot het27. De Patellaire pees hecht de spier van de quadriceps aan de tibiale radii. Binnen dit mechanisme extensor is de knieschijf een sesambeen die regisseert de actie van de quadriceps en bakent de proximale omvang van de Patellaire pees. De aanwezigheid van bony ankers op de proximale en distale afmetingen van de Patellaire pees vergemakkelijkt biomechanische proeven. Modellen waarbij de Patellaire pees meestal rekenen op eenzijdige chirurgische gebreken, met een contralaterale intact pees een besturingselement28,29bijeenkomen. De meest voorkomende Patellaire pees defect model omvat middendoor van het centrale deel (1 mm in de breedte) van de Patellaire pees van de distale apex van de knieschijf naar het inbrengen van de tibiale radii, terwijl de contralaterale Patellaire pees intact is gelaten. Maatregelen van uitkomsten hebben opgenomen histologie, niet-destructieve biomechanische proefneming of biomechanische testen tot mislukking, echografie imaging ex vivo fluorescentie imaging, bruto observatie en functionele tests28,30 ,31. Unilaterale modellen staan geen vergelijking van een voorgestelde behandeling met conservatieve beheer van een soortgelijke schade binnen hetzelfde dier. Vergelijking tussen verschillende behandelingen vereist ook afzonderlijke dieren. Een bilaterale model zou elimineren tussen afzonderlijke varianten en verminderen van het aantal dieren dat nodig is voor een studie32. Echter bilaterale verwondingen kunnen verhogen morbiditeit en evaluatie van de behandeling kan worden belemmerd door bilaterale kreupelheid. Het gebruik van bilaterale Patellaire pees defecten in ratten maar focus verslag een paar studies kort over de effecten van behandelingen in plaats van peri-operatieve beheer en morbiditeit van de model33,,34.
Doel van deze studie op lange termijn is het ontwikkelen van een strategie ter verbetering van de stemness en in vivo overleving van de UCM-MSCs bestemd voor allogene transplantatie. Om dit te bereiken, hebben we onlangs verbeterde stemness voor UCM-MSCs door vorming van spheroïden gemeld op chitosan film en incubatie onder hypoxische milieu35. Deze eigenschappen in vitro werden geassocieerd met verbeterde biomechanische eigenschappen van Patellaire pees gebreken behandeld met geconditioneerde UCM-MSCs. op basis van deze resultaten, de rat bilaterale Patellaire pees defect model lijkt geschikt voor het testen van de kandidaat-lidstaten behandelingen voor pees verwondingen36. Het doel van de studie gemeld hier is het verschaffen van gedetailleerde protocollen voor isolatie en karakterisatie van UCM-MSCs, voorbereiding van een biologische expresbezorgingssysteem voor stamcellen, creatie en behandeling van bilaterale patella pees gebreken en postoperatieve herstel en evaluatie van weefsel genezing binnen de gebreken.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>PBS 10X</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30258.01</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type IA</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004197</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM low glucose</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30021.FS</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30910.03</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin 100X</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SV30010</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 0.25%</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30042.01</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Innovative Cell Technologies</td>
			<td>AT104</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SV30084.01</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chitosan</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3646</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8045</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30574.01</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round bottom polystyrene tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>149591A</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-horse CD44 (FITC)</td>
			<td>AbD serotec</td>
			<td>MCA1082F</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-rat CD90 (FITC)</td>
			<td>AbD serotec</td>
			<td>MCA47FT</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-horse MHC-II (FITC)</td>
			<td>AbD serotec</td>
			<td>MCA1085F</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG1 (FITC) - Isotype Control</td>
			<td>AbD serotec</td>
			<td>MCA928F</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal [SN6] to CD105 (FITC)</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab11415</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG1 (FITC) - Isotype Control</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab91356</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-human CD34 (FITC)</td>
			<td>BD</td>
			<td>BDB560942</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IdG1 kappa (FITC)</td>
			<td>BD</td>
			<td>BDB555748</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7-AAD</td>
			<td>BD</td>
			<td>BDB559925</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Accuri C6 Flow Cytometer</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacutainer 5ml</td>
			<td>Med Vet International</td>
			<td>RED5.0</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acid-citrate-dextrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3821</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5670</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sevoflurane</td>
			<td>JD Medical</td>
			<td>60307-320-25</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rats</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>Strain code: 400</td>
			<td>Experimental animal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat surgical kit</td>
			<td>Harvard apparatus</td>
			<td>728942</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Blade #15</td>
			<td>MEDLINE</td>
			<td>MDS15115</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat MD&#39;s Baytril (2 mg/Tablet), 
			Rimadyl (2 mg/Tablet)</td>
			<td>Bio Serv</td>
			<td>F06801</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyglactin 910, 5-0</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>J436G</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin alchol shandon</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>6766007</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harris Hematoxylin</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>143907</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of stem cell therapies in a bilateral patellar tendon injury model in rats

Regeneratieve geneeskunde biedt nieuwe alternatieven voor voorwaarden die uitdaging van traditionele behandelingen. De prevalentie en de morbiditeit van tendinopathie over soorten, hebben gecombineerd met de beperkte helende eigenschappen van dit weefsel, gevraagd het zoeken naar cellulaire therapieën en aangedreven de ontwikkeling van experimentele modellen om te studeren van hun doeltreffendheid. Mesenchymale stamcellen, navelstreng dik, (UCM-MSC) matrix afkomstige zijn aantrekkelijke kandidaten omdat ze overvloedig, gemakkelijk te verzamelen, omzeilen de ethische bezwaren en het risico van Teratoom formatie, maar lijken op primitieve embryonale stamcellen nauwer dan volwassen weefsel afkomstige MSCs. significante belang heeft zich gericht op chitosan als een strategie ter verbetering van de eigenschappen van MSCs door sferoïde vorming. Dit papier details technieken te isoleren van de UCM-MSCs, spheroïden op chitosan film voor te bereiden en analyseren het effect van sferoïde vorming op oppervlakte marker expressie. Bijgevolg, oprichting van een bilaterale Patellaire pees letsel model bij ratten wordt beschreven voor in vivo implantatie van UCM-MSC spheroïden gevormd op chitosan film. Geen complicatie werd waargenomen in de studie met betrekking tot de morbiditeit, benadrukken stijgende effecten, of weefsel infectie. De totale functionele score van de bediende ratten op 7 dagen was lager dan dat van normale ratten, maar keerde terug naar normale binnen 28 dagen na de operatie. Histologische scores van weefsel-genezende bevestigde de aanwezigheid van een klonter in behandelde gebreken geëvalueerd op 7 dagen, afwezigheid van vreemd lichaam reactie en genezing vordert na 28 dagen. Deze bilaterale patella pees defect model was besturingselementen Inter-individuele variatie via de oprichting van een interne controle in elke rat, aanvaardbaar morbiditeit is gekoppeld en detectie van verschillen tussen onbehandelde pezen en behandelingen toegestaan.

In de huidige studie, zijn de resultaten gepresenteerd zoals bedoel ± SD (standaarddeviatie). Cellen werden geïsoleerd uit de navelstreng koorden van 6 merries en percentage van geïsoleerde cellijnen uiting van iedere markeerdraad cel oppervlakte onder standaard of chitosan conditionering werden vergeleken met een test van Friedman, als een niet-parametrische variantie-analyse met herhaling maatregelen. Voor de pees defect model creatie, 8 ratten werden gebruikt voor 7 dagen na chirurg...

Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Stem Cell Therapies in a Bilateral Patellar Tendon Injury Model in Rats at JoVE.com

Evaluation of Stem Cell Therapies in a Bilateral Patellar Tendon Injury Model in Rats

Evaluatie van stamcellen therapieën in een bilaterale Patellaire pees letsel Model bij ratten

Deze paper beschrijft de voorbereiding en de evaluatie van de navelstreng mesenchymale stamcellen matrix afkomstige spheroïden met een bilaterale Patellaire pees defect model in een rat. Dit model werd werd geassocieerd met een aanvaardbaar morbiditeit en gevonden voor het detecteren van de verschillen tussen onbehandelde en behandelde pezen, en tussen de twee behandelingen getest.

Regenerative medicine provides novel alternatives to conditions that challenge traditional treatments. The prevalence and morbidity of tendinopathy across ...

Research

JoVE Journal

Medicine

A Mouse Model of in Utero Transplantation

A Mouse Model of in Utero Transplantation

Een muis model van de In Utero Transplantatie

The transplantation of stem cells and viruses in utero has tremendous potential for treating congenital disorders in the human fetus.  For example, in ...

A Contusion Model of Severe Spinal Cord Injury in Rats

Een Kneuzing Model van Severe ruggenmergletsel bij ratten

The translational potential of novel treatments should be investigated in severe spinal cord injury (SCI) contusion models. A detailed methodology is ...

A Radio-telemetric System to Monitor Cardiovascular Function in Rats with Spinal Cord Transection and Embryonic Neural Stem Cell Grafts

Een radio-telemetrische systeem om de cardiovasculaire functie bij ratten met Spinal Cord doorsnijding en embryonale neurale stamcellen Enten Monitor

High thoracic or cervical spinal cord injury (SCI) can lead to cardiovascular dysfunction. To monitor cardiovascular parameters, we implanted a catheter ...

Neural Stem Cell Transplantation in Experimental Contusive Model of Spinal Cord Injury

Neurale stamceltransplantatie bij Experimentele Contusive Model van Spinal Cord Injury

Spinal cord injury is a devastating clinical condition, characterized by a complex of neurological dysfunctions. Animal models of spinal cord injury can ...

Evaluation of the Efficacy of the H. pylori Protein HP-NAP as a Therapeutic Tool for Treatment of Bladder Cancer in an Orthotopic Murine Model

Evaluation of the Efficacy of the H. pylori Protein HP-NAP as a Therapeutic Tool for Treatment of Bladder Cancer in an Orthotopic Murine Model

Evaluatie van de werkzaamheid van de<em&gt; H. pylori</em&gt; Protein HP-NAP als een therapeutisch hulpmiddel voor de behandeling van blaaskanker in een orthotope Murine Model

Bladder cancer is one of the most common malignancies of the urogenital tract. Intravesical injection of Bacillus Calmette-Gu&#233;rin (BCG) is the gold ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Studeren alvleesklier- Stamcel Kenmerken voor het ontwikkelen van nieuwe behandelingsstrategieën

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

A Neonatal Mouse Spinal Cord Compression Injury Model

Een Neonatale Mouse Spinal Cord Injury Compressie Model

Spinal cord injury (SCI) typically causes devastating neurological deficits, particularly through damage to fibers descending from the brain to the spinal ...

Murine Flexor Tendon Injury and Repair Surgery

Murine flexorpeesletsel en Repair Surgery

Tendon connects skeletal muscle and bone, facilitating movement of nearly the entire body. In the hand, flexor tendons (FTs) enable flexion of the fingers ...

Balloon-based Injury to Induce Myointimal Hyperplasia in the Mouse Abdominal Aorta

Ballon gebaseerde letsel ertoe Myointimal Hyperplasia in de muis abdominale Aorta

The use of animal models is essential for a better understanding of MH, one major cause for arterial stenosis.In this article, we demonstrate a murine ...

Evaluation of Coronary Flow Reserve After Myocardial Ischemia Reperfusion in Rats

Evaluatie van coronaire stroom reserve na myocardiale ischemie reperfusie bij ratten

Coronary artery disease is the leading cause of death worldwide. After an acute myocardial infarction, early and successful myocardial intervention via ...