Name: evaluation of stem cell therapies in a bilateral patellar tendon injury model in rats
Uploaded: 2018-03-30T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Stem Cell Therapies in a Bilateral Patellar Tendon Injury Model in Rats at JoVE.com

Die Autoren möchten Dr. Su, PhD, für ihre statistische Analyse der Daten zu bestätigen. Die Autoren danken auch Dr. McClure, DVM, PhD DACLAM, für ihre Beratung auf die Anästhesie und Schmerz-Management-Protokolle in der Studie verwendet. Dieses Projekt wurde unterstützt durch Zuschüsse aus dem Western University of Health Sciences Amt des Vizepräsidenten für Forschung (12678v) und USDA Abschnitt 1433 Mittel (2090).

Alle hier beschriebene Methoden wurden von den institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) der Western University of Health Sciences genehmigt.
1. Isolierung und Ausbau der MSCs von Equine Nabelschnur Matrix
<ol><li>Erhalten Sie die Plazenta von einem Erwachsenen Mare (schwanger), nach dem Abfohlen beobachtet und aseptisch isolieren Sie die Nabelschnur aus der Plazenta. Halten Sie die Nabelschnur in Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) mit 1 % Penicillin-Streptomycin (P/S...

Equine Zellen wurden für dieses Projekt ausgewählt, weil wir wollen schließlich Kandidat Ansätze bei der Verwaltung der natürlichen Sehnenpathologien bei Pferden zu testen. In der Tat sind Sehnenverletzungen bei Pferden wegen der biologischen Ähnlichkeit zwischen dem equine oberflächlichen Beugesehne und Achillessehne Menschen41ansprechend als natürlichen Vorbildern der Sehnenerkrankung im Menschen. Die Zelle Oberflächenmarker CD44, CD90, CD105, CD34 und MHC-II wurden für die Immunphäno...

Sehnenverletzung ist eines der häufigsten Ursachen für erhebliche Schmerzen und Muskel-Atrophie Arten1. In der Veterinärmedizin sind Sehnen und Bänder Verletzungen von besonderem Interesse bei Pferden, wie 82 % aller Verletzungen im Rennpferde des Muskel-Skelett-Systems einbeziehen, und 46 % der Befragten Einfluss auf Sehnen und Bänder2,3. Bildung von Narbengewebe beeinflusst die biomechanischen Eigenschaften des geheilten Sehnen und erklärt die bewachte Prognose für Rückkehr zur sportlichen Nutzung nach Flexor Sehnenverletzungen; Re-Verletzung tritt innerhalb von 2 Jahren in bis zu 67 % der Pferde4konservativ behandelt. Regenerativer Medizin bietet neuartige Alternativen zu eine Bedingung, die traditionelle Behandlungen herausfordert. Autologe Stammzell-Therapie hat einige ermutigende Ergebnisse5,6 aber ist begrenzt durch die Morbidität verbunden mit Gewebe Sammlung, verzögerte Verwaltung aufgrund der Verarbeitung/Neuprogrammierung der Zellen und der Einfluss von der Gesundheitszustand des Patienten (z.B. Alter) auf die Eigenschaften der Stammzellen Zellen7,8. Diese Einschränkungen bieten eine Begründung für die Untersuchung von allogenen Stammzellen als handelsübliche Alternative. Fetale Adnexe-abgeleitete Zellen sind ansprechende Kandidaten, weil sie die ethische Bedenken und das Risiko von Teratom Bildung verbunden mit embryonalen Stammzellen umgehen. Gehört der fetalen Adnexe Nabelschnur Matrix (UCM), auch benannt Wharton Gelee, reichlich vorhanden und leicht zu sammeln.
Unabhängig von der Zelle Quelle unbedingt verbessern Stemness eine Zellbank für allogene regenerative Medizin zu etablieren. In funktioneller Hinsicht kann Stemness definiert werden als das Potenzial für die Differenzierung der Selbsterneuerung und Multi-Linie9. Nachweis der Stemness stützt sich auf die Proliferation und Differenzierung Assays, zusammen mit Ausdruck des Gens Marker Oct4, Sox2, und Nanog9. Eine Strategie zur Verbesserung der Stemness beruht auf der Verwendung von Biomaterialien als nichtig Füllstoffe und Verbesserung der Proliferation und Differenzierung der UCM-MSCs Träger dienen. Dieser Ansatz verhindert Bedenken in Bezug auf Manipulation der transcriptional Faktoren Reife Zellen in induzierte pluripotente Zellen umzuprogrammieren. Unter Biomaterialien als mögliche Träger Stammzellen zu gewinnen ist Chitosan attraktiv für seine Biokompatibilität und Abbaubarkeit10. Diese natürlichen Aminopolysaccharide bildet alkalischen Deacetylation von Chitin, das zweithäufigste natürliches Polysaccharid in erster Linie als eine Subproduct der Schalentiere10erhalten. Wir haben zuvor untersucht Wechselwirkungen zwischen MSCs und Chitosan Gerüste und beobachtet die Bildung von Sphäroide11,12,13,14,15, 16. berichteten wir auch über die Überlegenheit des werden auf Chitosan Matrizen12,13,14,15,16,17, 18. In jüngerer Zeit, zwei unabhängige Studien beschrieben Sphäroide Bildung von Fettgewebe und Plazenta-Gewebe abgeleitet MSCs auf einem Chitosan Film19,20kultiviert. Diese Formation der Sphäroide nicht nur verbesserte Stemness, sondern verbessert auch die Aufbewahrung von Stammzellen nach in-Vivo Implantation20.
Die Prävalenz und die Morbidität der Sehnenerkrankung Arten haben die Entwicklung der experimentellen Modellen zu studieren die Pathophysiologie der Sehnenpathologien und testen neue Therapien wie Stammzellinjektionen aufgefordert. Bei Pferden ist Kollagenase-induzierten Sehnenentzündungen ein gemeinsames Modell mit MSCs in Sehne Reparatur21Wirksamkeit zu demonstrieren. Die Relevanz dieses Ansatzes ist begrenzt, da Injektionen akute entzündliche Veränderungen verursachen, während klinischen Sehnenpathologien führen in der Regel aus chronische Überforderung22,23. Darüber hinaus chemische Induktion der Sehne Krankheit induziert eine heilende Reaktion und repliziert nicht beeinträchtigten Heilungsprozess im klinischen Fällen22,23. Exzision eines Segments der oberflächlichen Beugesehne Sehne wurde als chirurgische Modell von Tendinitis bei Pferden24beschrieben. In jüngerer Zeit, war ein minimal-invasive Ansatz verwendet, um die traumatischen Schäden an den zentralen Kern der oberflächlichen Beugesehne Sehne25einzuschränken. Chirurgische Modelle simuliert nicht die Müdigkeit-Mechanismus, der zu natürlichen Sehne Krankheit führen, und neigen dazu, Reproduzierbarkeit in das Ausmaß des Schadens25erstellt. Unabhängig von dem Modell, die Morbidität und Kosten im Zusammenhang mit equine Modelle der Sehne sind Krankheiten zusätzliche Einschränkungen, die ein Interesse an Nager-Modelle als ein erster Schritt für in Vivo Evaluation neuartiger Therapien zu rechtfertigen.
Einer der Hauptvorteile der experimentellen Modellen bei Nagetieren besteht aus die Kosten und die Fähigkeit, interindividuelle Variabilität zu kontrollieren. Nagetiere können in Bezug auf verschiedene physiologische Faktoren aufgrund ihrer rasanten Wachstumsraten standardisiert werden und relativ kurzen Lebensspanne und Abweichungen zu begrenzen und somit Verringerung der Zahl der Tiere erforderlich, Unterschiede zu erkennen. Strategien zur Sehne Krankheiten bei Nagetieren induzieren haben chemische Induktion, sondern auch über chirurgische Einrichtung teilweise Sehne Defekte21verlassen. Chirurgische Modelle können natürliche Sehnenpathologien besser als chemische Modelle simulieren, sondern zu höheren Morbidität und Totalausfall der beschädigten Sehne führen können. In dieser Hinsicht scheinen Ratten bessere Kandidaten als Mäuse für diese Modelle, da ihre Größe größere Defekte, wodurch Bewertung der Heilung des Gewebes ermöglicht. Sprague-Dawley Ratten wurden in experimentellen Studien der Sehnenpathologien in vier großen Sehne Gruppen verwendet: Rotatorenmanschette, Flexor, Achilles und Patella sehnen26. Unter diesen sind die Modelle mit der Patellasehne aufgrund der Größe dieser Sehne und die Leichtigkeit des Zugriffs auf es27besonders reizvoll. Die Patellasehne misst die Quadrizeps tibiale Tuber. Innerhalb dieser Beinstrecker-Mechanismus ist die Patella eine sesamoid Knochen, der leitet der Aktion des Quadrizeps und umreißt das proximale Ausmaß der Patellasehne. Das Vorhandensein von knöchernen Ankern an den proximalen und distalen Ausdehnungen der der Patellasehne erleichtert biomechanische Tests. Modelle mit der Patellasehne in der Regel verlassen sich auf einseitige operative Mängel mit einer kontralateralen intakte Sehne dient als ein Steuerelement28,29. Die häufigsten Patellasehne defekt-Modell umfasst den zentralen Teil der Patellasehne von der distalen Spitze der Patella, die Einfügung der tibiale Tuber (1 mm in der Breite) besteuert, während der kontralateralen Patellasehne intakt bleibt. Maßnahmen der Ergebnisse enthalten Histologie, zerstörungsfreie biomechanische Tests oder biomechanische Tests zu scheitern, Ultraschall-Bildgebung, ex Vivo Fluoreszenz-Bildgebung, grobe Beobachtung und Funktionstests28,30 ,31. Einseitige Modelle erlauben keine Vergleich einer vorgeschlagenen Behandlung mit konservativen Management einer ähnlichen Verletzung innerhalb der selben Tier. Vergleich zwischen mehreren Behandlungen erfordert ebenso eigene Tiere. Eine bilaterale Modell würde interindividuelle Unterschiede beseitigen und reduzieren Sie die Anzahl der Tiere, die für eine Studie32erforderlich. Jedoch bilaterale Verletzungen können Morbidität erhöhen und bilaterale Lahmheit Behandlung Bewertung behindern könnte. Einige Studien berichten kurz die Verwendung von bilateralen Patellasehne Mängel in Ratten sondern konzentrieren sich auf die Auswirkungen der Behandlungen statt Peri-operativen Management und Morbidität der das Modell33,34.
Langfristiges Ziel dieser Studie ist zur Entwicklung einer Strategie zur Verbesserung der Stemness und in Vivo Überleben der UCM-MSCs bestimmt zur allogenen Transplantation. Um dieses Ziel zu erreichen, haben wir vor kurzem verbesserten Stemness der UCM-MSCs durch Bildung der Sphäroide auf Chitosan Film- und Inkubation unter hypoxischen Umwelt35berichtet. Diese in-vitro- Eigenschaften waren verbunden mit verbesserten biomechanischen Eigenschaften der Patellasehne Mängel behandelt mit konditionierten UCM-MSCs. basierend auf diesen Ergebnissen, die bilateralen Patellasehne defekt Rattenmodell scheint geeignet, um Kandidaten zu testen Behandlungen für Sehne Verletzungen36. Der Zweck der Studie berichtet hier ist die ausführliche Protokolle für Isolierung und Charakterisierung von UCM-MSCs, Vorbereitung eines biologischen Liefersysteme für Stammzellen, Entstehung und Behandlung von bilateralen Patella Sehne Defekte und Post-operative Erholung und Bewertung der Gewebe, die Heilung innerhalb der Mängel.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>PBS 10X</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30258.01</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type IA</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004197</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM low glucose</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30021.FS</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30910.03</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin 100X</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SV30010</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 0.25%</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30042.01</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Innovative Cell Technologies</td>
			<td>AT104</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SV30084.01</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chitosan</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3646</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8045</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30574.01</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round bottom polystyrene tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>149591A</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-horse CD44 (FITC)</td>
			<td>AbD serotec</td>
			<td>MCA1082F</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-rat CD90 (FITC)</td>
			<td>AbD serotec</td>
			<td>MCA47FT</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-horse MHC-II (FITC)</td>
			<td>AbD serotec</td>
			<td>MCA1085F</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG1 (FITC) - Isotype Control</td>
			<td>AbD serotec</td>
			<td>MCA928F</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal [SN6] to CD105 (FITC)</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab11415</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG1 (FITC) - Isotype Control</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab91356</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-human CD34 (FITC)</td>
			<td>BD</td>
			<td>BDB560942</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IdG1 kappa (FITC)</td>
			<td>BD</td>
			<td>BDB555748</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7-AAD</td>
			<td>BD</td>
			<td>BDB559925</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Accuri C6 Flow Cytometer</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacutainer 5ml</td>
			<td>Med Vet International</td>
			<td>RED5.0</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acid-citrate-dextrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3821</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5670</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sevoflurane</td>
			<td>JD Medical</td>
			<td>60307-320-25</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rats</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>Strain code: 400</td>
			<td>Experimental animal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat surgical kit</td>
			<td>Harvard apparatus</td>
			<td>728942</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Blade #15</td>
			<td>MEDLINE</td>
			<td>MDS15115</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat MD&#39;s Baytril (2 mg/Tablet), 
			Rimadyl (2 mg/Tablet)</td>
			<td>Bio Serv</td>
			<td>F06801</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyglactin 910, 5-0</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>J436G</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin alchol shandon</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>6766007</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harris Hematoxylin</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>143907</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of stem cell therapies in a bilateral patellar tendon injury model in rats

Regenerativer Medizin bietet neuartige Alternativen zu Bedingungen, die traditionelle Behandlungen herausfordern. Die Prävalenz und die Morbidität der Sehnenerkrankung Arten, kombiniert mit den begrenzten heilenden Eigenschaften dieses Gewebes, aufgefordert, die Suche nach Zelltherapien und trieb die Entwicklung der experimentellen Modellen, deren Wirksamkeit zu studieren. Nabelschnur Matrix mesenchymaler Stammzellen (UCM-MSC) sind ansprechende Kandidaten, weil sie sind reichlich vorhanden, leicht zu sammeln, zu umgehen, die ethische Bedenken und das Risiko von Teratom Bildung noch primitiven embryonalen Stammzellen mehr ähneln als Erwachsenen Gewebe abgeleitet MSCs. signifikante Interesse konzentriert sich auf Chitosan als Strategie, um die Eigenschaften des MSCs durch Sphäroid Bildung zu verbessern. Dieses Papier Details Techniken UCM-MSCs isolieren Sphäroide auf Chitosan Film vorzubereiten und analysieren die Wirkung der Sphäroid Bildung auf Surface Marker Ausdruck. Erstellung eines bilateralen Patellasehne Verletzungen Modells bei Ratten wird folglich für in Vivo Implantation der UCM-MSC Sphäroide auf Chitosan Film gebildet beschrieben. Ohne Komplikationen beobachtet wurde in der Studie in Bezug auf Morbidität, steigenden Effekte oder Gewebe Infektion zu betonen. Funktionale Gesamtpunktzahl der betriebenen Ratten nach 7 Tagen war niedriger als die von normalen Ratten, aber innerhalb von 28 Tagen nach der Operation zur Normalität zurückgekehrt. Histologischen Resultate von Heilung des Gewebes bestätigte das Vorhandensein eines Gerinnsels in behandelten Mängel 7 Tage ausgewertet aufgrund fehlender Fremdkörperreaktion und mit 28 Tagen Heilung voran. Dieses bilaterale Patella Sehne defekt Modell war steuert interindividuelle Variation durch Erstellung einer internen Kontrolle in jede Ratte mit akzeptablen Morbidität verbunden und erlaubt die Erkennung von Unterschieden zwischen unbehandelten Sehnen und Behandlungen.

In der aktuellen Studie werden Ergebnisse präsentiert, da ± SD (Standardabweichung) bedeuten. Zellen wurden isoliert von der Nabelschnur 6 Stuten und Prozentsatz der isolierten Zelllinien mit dem Ausdruck jeder Zelle Oberfläche Marker unter Standard- oder Chitosan Klimaanlage verglichen mit Friedman-Test als eine nicht-parametrische Varianzanalyse mit wiederholt Maßnahmen. Für die Sehne defekt Modellerstellung 8 Ratten dienten für 7 Tage nach der Operation Bewertung und 12 Ratten wu...

Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Stem Cell Therapies in a Bilateral Patellar Tendon Injury Model in Rats at JoVE.com

Evaluation of Stem Cell Therapies in a Bilateral Patellar Tendon Injury Model in Rats

Bewertung von Stammzelltherapien in einem bilateralen Patellasehne Verletzungen Modell bei Ratten

Dieses Papier beschreibt die Vorbereitung und Auswertung der Nabelschnur Matrix-mesenchymale Stammzellen Sphäroide mit einem bilateralen Patellasehne defekt-Modell in eine Ratte. Dieses Modell wurde wurde mit einer akzeptablen Morbidität verbunden festgestellt, dass die Unterschiede zwischen unbehandelten und behandelten sehnen erkennen und zwischen den beiden Behandlungen getestet.

Regenerative medicine provides novel alternatives to conditions that challenge traditional treatments. The prevalence and morbidity of tendinopathy across ...

Research

JoVE Journal

Medicine

A Mouse Model of in Utero Transplantation

A Mouse Model of in Utero Transplantation

Einem Mausmodell der In Utero Transplantation

The transplantation of stem cells and viruses in utero has tremendous potential for treating congenital disorders in the human fetus.  For example, in ...

Forschung

Medizin

A Contusion Model of Severe Spinal Cord Injury in Rats

Eine Prellung Model of Severe Spinal Cord Injury in Rats

The translational potential of novel treatments should be investigated in severe spinal cord injury (SCI) contusion models. A detailed methodology is ...

A Radio-telemetric System to Monitor Cardiovascular Function in Rats with Spinal Cord Transection and Embryonic Neural Stem Cell Grafts

Ein Radio-Telemetrie-System zur Herz-Kreislauf-Funktion bei Ratten mit Rückenmarksdurchtrennung und embryonalen Neural Stem Cell Grafts überwachen

High thoracic or cervical spinal cord injury (SCI) can lead to cardiovascular dysfunction. To monitor cardiovascular parameters, we implanted a catheter ...

Neural Stem Cell Transplantation in Experimental Contusive Model of Spinal Cord Injury

Neural Stem Cell Transplantation in Experimental Gequetscht Modell von Rückenmarksverletzungen

Spinal cord injury is a devastating clinical condition, characterized by a complex of neurological dysfunctions. Animal models of spinal cord injury can ...

Evaluation of the Efficacy of the H. pylori Protein HP-NAP as a Therapeutic Tool for Treatment of Bladder Cancer in an Orthotopic Murine Model

Evaluation of the Efficacy of the H. pylori Protein HP-NAP as a Therapeutic Tool for Treatment of Bladder Cancer in an Orthotopic Murine Model

Bewertung der Wirksamkeit der<em&gt; H. pylori</em&gt; Protein HP-NAP als therapeutisches Werkzeug zur Behandlung von Blasenkrebs in einem orthotopen Mausmodell

Bladder cancer is one of the most common malignancies of the urogenital tract. Intravesical injection of Bacillus Calmette-Gu&#233;rin (BCG) is the gold ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Studieren Bauchspeicheldrüsenkrebs Stammzelleigenschaften für die Entwicklung neuer Behandlungsstrategien

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

A Neonatal Mouse Spinal Cord Compression Injury Model

Ein Neonatal Maus Spinal Cord Injury Kompression Modell

Spinal cord injury (SCI) typically causes devastating neurological deficits, particularly through damage to fibers descending from the brain to the spinal ...

Murine Flexor Tendon Injury and Repair Surgery

Murine Beugersehne Verletzung und Reparatur Chirurgie

Tendon connects skeletal muscle and bone, facilitating movement of nearly the entire body. In the hand, flexor tendons (FTs) enable flexion of the fingers ...

Balloon-based Injury to Induce Myointimal Hyperplasia in the Mouse Abdominal Aorta

Ballon-basierte Verletzungen induzieren Myointimal Hyperplasie in der Bauchschlagader Maus

The use of animal models is essential for a better understanding of MH, one major cause for arterial stenosis.In this article, we demonstrate a murine ...

Evaluation of Coronary Flow Reserve After Myocardial Ischemia Reperfusion in Rats

Bewertung des koronaren Flussreservats nach Myokard-Ischämie-Reperfusion bei Ratten

Coronary artery disease is the leading cause of death worldwide. After an acute myocardial infarction, early and successful myocardial intervention via ...