Name: evaluation of stem cell therapies in a bilateral patellar tendon injury model in rats
Uploaded: 2018-03-30T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Stem Cell Therapies in a Bilateral Patellar Tendon Injury Model in Rats at JoVE.com

Forfatterne ønsker å erkjenne Dr. Su, PhD, for hennes statistisk analyse av dataene. Forfatterne også takke Dr. McClure, DVM, PhD DACLAM, for hennes råd om anestesi og smerte behandling protokoller brukes i studien. Dette prosjektet ble støttet av tilskudd fra Western University of Health Sciences Office Vice President for forskning (12678v) og USDA delen 1433 midler (2090).

Alle metodene som er beskrevet her er godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk Committee (IACUC) av Western University of Health Sciences.
1. isolering og utvidelse av MSCs i Equine navlestreng matrisen
<ol><li>Få morkaken fra en voksen mare (gravid) når observert foaling og tas aseptisk isolere navlestrengen fra morkaken. Hold navlestrengen i fosfat bufret saltvann (PBS) med 1% penicillin-streptomycin (P/S) på 4 ° C under overføring til behandling.</li>
	<li>Vask navlestrengen t...

Equine celler ble valgt for dette prosjektet fordi vi til slutt skal teste kandidat tilnærminger i forvaltningen av naturlige tendinopathies i hester. Sene skader i hester er faktisk tiltalende som naturlig modeller av tendinopathy mann gitt biologiske likhet mellom equine overfladisk digital bøyer og akillessene i mennesker41. Cellen overflate markører CD44, CD90, CD105, CD34 og MHC-II ble valgt for immunophenotyping av celler, i samsvar med kriteriene anbefalt av internasjonale samfunnet for ...

Gjete skaden er en av de vanligste årsakene til betydelig smerte og muskelen atrofi over arter1. I veterinærmedisin er sene og ligament skader av spesiell interesse for hester, 82% av alle skader i hester involverer bevegelsesapparatet, og 46% av dem påvirke tendons og leddbånd2,3. Arrvev formasjon påvirker egenskapene biomekaniske helbredet sener og forklarer bevoktet prognosen for retur til atletisk bruk etter bøyer sene skader; Re-skader oppstår innen 2 år i opp til 67% av hestene behandlet konservativt4. Regenerativ medisin skaffer romanen alternativer til en tilstand som utfordrer tradisjonell behandlinger. Autologous stilk cellen terapi har produsert noen oppmuntrende resultater5,6 , men er begrenset av sykelighet forbundet med vev samling, forsinket administrasjon på grunn av behandling/omprogrammere celler og påvirkning av den pasientens helsetilstand (for eksempel alder) på egenskapene til stilk celler7,8. Disse begrensningene gir en begrunnelse for å undersøke allogene stamceller som en sokkel alternativ. Fosterets H59-avledet celler er tiltalende kandidater fordi de omgå Etiske bekymringene og risikoen for teratoma dannelse tilknyttet embryonale stamceller. Blant fosterets H59 er navlestreng matrix (UCM), også kalt Whartons gelé, rikelig og enkelt å samle.
Uavhengig celle kilden er styrke stemness viktig å etablere en cellen bank allogenic regenerativ medisin. Fra et funksjonelt synspunkt, kan stemness defineres som potensialet for selvtillit fornyelse og flere avstamning differensiering9. Bevis på stemness bruker spredning og differensiering analyser, sammen med uttrykk av genet markører Oct4, Sox2, og Nanog9. En strategi for å forbedre stemness, avhengig av bruk av biologisk materiale som ugyldige fyllstoff og bærere styrke spredning og differensiering av UCM-MSCs. Dette eliminerer angående manipulering av transcriptional faktorer å omprogrammere modne celler i indusert pluripotent celler. Biologisk materiale betraktet som potensielle stativer for stamceller, er chitosan tiltalende for biocompatibility og nedbrytbarhet10. Denne naturlige aminopolysaccharide er dannet av alkaliske deacetylation av chitin, det nest mest rikelig naturlig polysakkaridet, hovedsakelig fikk som en subproduct av skalldyr10. Vi har tidligere undersøkt interaksjoner mellom MSCs og chitosan stillaser og observert dannelsen av spheroids11,12,13,14,15, 16. vi også rapportert om overlegenhet chondrogenesis på chitosan matriser12,13,14,15,16,17, 18. Flere nylig, to uavhengige studier beskrevet spheroids dannelsen av fettvev og morkaken vev avledet MSCs kultivert på en chitosan filmen19,20. Denne dannelsen av spheroids ikke bare forbedret stemness, men også forbedret oppbevaring av stamceller etter i vivo implantasjon20.
Utbredelse og sykelighet av tendinopathy over arter har bedt om utvikling av eksperimentelle modeller å studere i Patofysiologien ved tendinopathies og teste nye behandlingsformer som stem cell injeksjoner. I hester er collagenase-indusert senebetennelse en felles modell å demonstrere effekt ved hjelp av MSCs i sene reparasjon21. Relevansen av denne tilnærmingen er begrenset, injeksjoner forårsake akutt inflammatoriske endringer, mens klinisk tendinopathies vanligvis resultat av kronisk overstrain22,23. I tillegg kjemiske induksjon av sene sykdom induserer en healing respons og replikerer ikke svekket helbredelsesprosessen i kliniske tilfeller22,23. Eksisjon av et segment i overfladisk digital bøyer senen har blitt beskrevet som en kirurgisk modell av senebetennelse i hester24. Nylig ble en minimal invasiv tilnærming brukt til å begrense det traumatic skaden til den sentrale kjernen av overfladiske digital bøyer sene25. Kirurgisk modeller ikke etterligne tretthet mekanismen som kan føre til naturlige sene sykdom, og pleier å mangler reproduserbarhet i omfanget av skaden opprettet25. Uansett modell, sykelighet og kostnader knyttet til equine modeller av sene er sykdommer flere begrensninger, som rettferdiggjør interesse gnager modeller som et første skritt i vivo evaluering av romanen terapi.
En av de viktigste fordelene med eksperimentelle modeller i gnagere består av kostnadene og muligheten til å kontrollere Inter-individuelle variasjon. Gnagere kan være standardisert med hensyn til ulike fysiologiske faktorer på grunn av deres raske vekst priser og korte relativt levetid, begrenser kilder til variasjon og derfor redusere antall dyr kreves for å gjenkjenne forskjellene. Strategier for å indusere sene sykdommer i Red har stolt på kjemiske induksjon, men også på kirurgisk etableringen av delvis sene defekter21. Kirurgisk modellene kan simulere naturlig tendinopathies bedre enn kjemiske modeller, men kan føre til høyere sykelighet og katastrofal svikt i skadet senen. I den forbindelse synes rotter bedre kandidater enn mus for disse modellene, som deres størrelse gjør etableringen av større feil, og dermed evaluere vev helbredelse. Sprague-Dawley rotter har blitt brukt i eksperimentelle studier av tendinopathies i fire store sene grupper: rotatorcuff, bøyer, Akilles og patellar sener26. Blant disse er modellene som involverer patellar senen spesielt attraktivt på grunn av større størrelsen på dette sene og enkel tilgang til den27. Patellarsenen festes quadriceps muskel til tibial tuberosity. I denne extensor mekanismen er patella en sesamoid bein som leder av quadriceps og delineates proksimale omfanget av patellar senen. Tilstedeværelsen av benete ankere på proksimale og distale omfanget av patellar senen forenkler biomekaniske tester. Modeller som involverer patellar senen vanligvis stole på ensidige kirurgisk feil, med en kontralateral intakt sene som en kontroll28,29. Den vanligste patellarsenen defekt modellen innebærer excising den sentrale delen (1 mm i bredde) av patellarsenen fra den distale toppen av patella for innsetting av tibial tuberosity, mens den kontralateral patellarsenen er intakt. Tiltak av resultatene har inkludert histology, ikke-destruktiv biomekaniske testing eller biomekaniske testing til svikt, ultralyd imaging, ex vivo fluorescens bildebehandling, brutto observasjon og funksjonelle tester28,30 ,31. Ensidig modeller tillater ikke sammenligning av en foreslått behandling med konservative ledelse av en lignende skader samme dyret. Tilsvarende krever sammenligning mellom flere behandlinger separate dyr. En bilaterale modell ville eliminere Inter enkeltvarianter og redusere antall dyr kreves for en studie32. Men bilaterale skader kan øke sykelighet og bilaterale klagesang kunne vanskeliggjøre behandling evaluering. Noen studier rapporterer kort bruk av bilaterale patellarsenen feil i rotter men fokus på effekten av behandlinger i stedet for peri-operative ledelse og sykelighet av modell33,34.
Denne studien langsiktige målet er å utvikle en strategi for å forbedre stemness og i vivo overlevelse av UCM-MSCs skal allogenic transplantasjon. For å oppnå dette målet, har vi nylig rapportert forbedret stemness av UCM-MSCs ved dannelsen av spheroids på chitosan film og inkubasjon under hypoxic miljø35. Disse i vitro egenskapene var assosiert med bedre biomekaniske egenskaper patellarsenen feil behandlet med betinget UCM-MSCs. basert på disse resultatene, rotte bilaterale patellarsenen feil modell synes egnet til å teste kandidat behandlinger for sene skader36. Formålet med studien rapporterte her er å gi detaljert protokoller for isolering og karakterisering av UCM-MSCs, utarbeidelse av en biologisk leveringssystem for stamceller, opprettelse og behandling av bilaterale patella sene feil og post-operativ utvinning og evaluering av vev helbredelse inne feil.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>PBS 10X</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30258.01</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type IA</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004197</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM low glucose</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30021.FS</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30910.03</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin 100X</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SV30010</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 0.25%</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30042.01</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Innovative Cell Technologies</td>
			<td>AT104</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SV30084.01</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chitosan</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3646</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8045</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30574.01</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round bottom polystyrene tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>149591A</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-horse CD44 (FITC)</td>
			<td>AbD serotec</td>
			<td>MCA1082F</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-rat CD90 (FITC)</td>
			<td>AbD serotec</td>
			<td>MCA47FT</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-horse MHC-II (FITC)</td>
			<td>AbD serotec</td>
			<td>MCA1085F</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG1 (FITC) - Isotype Control</td>
			<td>AbD serotec</td>
			<td>MCA928F</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal [SN6] to CD105 (FITC)</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab11415</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG1 (FITC) - Isotype Control</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab91356</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-human CD34 (FITC)</td>
			<td>BD</td>
			<td>BDB560942</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IdG1 kappa (FITC)</td>
			<td>BD</td>
			<td>BDB555748</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7-AAD</td>
			<td>BD</td>
			<td>BDB559925</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Accuri C6 Flow Cytometer</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacutainer 5ml</td>
			<td>Med Vet International</td>
			<td>RED5.0</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acid-citrate-dextrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3821</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5670</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sevoflurane</td>
			<td>JD Medical</td>
			<td>60307-320-25</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rats</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>Strain code: 400</td>
			<td>Experimental animal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat surgical kit</td>
			<td>Harvard apparatus</td>
			<td>728942</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Blade #15</td>
			<td>MEDLINE</td>
			<td>MDS15115</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat MD&#39;s Baytril (2 mg/Tablet), 
			Rimadyl (2 mg/Tablet)</td>
			<td>Bio Serv</td>
			<td>F06801</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyglactin 910, 5-0</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>J436G</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin alchol shandon</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>6766007</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harris Hematoxylin</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>143907</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of stem cell therapies in a bilateral patellar tendon injury model in rats

Regenerativ medisin skaffer romanen alternativer til forhold som utfordrer tradisjonell behandlinger. Utbredelse og sykelighet av tendinopathy over arter, har kombinert med begrenset helbredende egenskapene til dette vev, bedt om søk etter mobilnettet terapier og drevet utviklingen av eksperimentelle modeller å studere deres effekt. Navlestreng matrix-avledet mesenchymal stamceller (UCM-MSC) er tiltalende kandidater fordi de er rikelig, lett å samle, omgå Etiske bekymringene og risikoen for teratoma dannelse, men ligner primitive embryonale stamceller nærmere enn voksen vev-avledet MSCs. betydelig interesse har fokusert på chitosan som en strategi for å forbedre egenskapene til MSCs gjennom formet formasjon. Dette papiret detaljer teknikker å isolere UCM-MSCs, forberede spheroids på chitosan film, og analysere effekten av formet formasjon på overflaten markør uttrykk. Derfor er etableringen av bilaterale patellarsenen skade modell i rotter beskrevet for i vivo implantasjon av UCM-MSC spheroids dannet på chitosan film. Nei komplikasjon ble observert i studien forhold til sykelighet, stress stigende effekter eller vev infeksjon. Total funksjonelle score på styres rotter i 7 dager var lavere enn vanlig rotter, men tilbake til det normale innen 28 dager etter operasjonen. Histologiske scorene til vev-healing bekreftet tilstedeværelse av en blodpropp i behandlede defekter evalueres på 7 dager, fravær av fremmedlegemer reaksjon, og avansere helbredende på 28 dager. Denne bilaterale patella sene defekt modellen var styrer Inter individuell variasjon via etableringen av en intern kontroll i hver rotten forbundet med akseptabel sykelighet og tillatt påvisning av forskjellene mellom ubehandlet sener og behandlinger.

I denne studien, er resultatene presentert som betyr ± SD (standardavvik). Cellene ble isolert fra navle snorer av 6 mares, og andelen isolert cellelinjer uttrykke hver celle overflaten indikator under standard eller chitosan condition ble sammenlignet med en Friedman test, som en ikke-parametriske variansanalyse med gjentatt tiltak. For oppretting av sene feil modell 8 rotter brukes av 7 dager etter operasjonen vurdering og 12 rotter ble brukt til 28 dager vurdering. Resultatene av funk...

Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Stem Cell Therapies in a Bilateral Patellar Tendon Injury Model in Rats at JoVE.com

Evaluation of Stem Cell Therapies in a Bilateral Patellar Tendon Injury Model in Rats

Evaluering av stilk cellen terapi i bilaterale patellarsenen skade modell i rotter

Dette dokumentet beskriver forberedelse og evaluering av navlestreng matrix-avledet mesenchymal stamceller spheroids med bilaterale patellarsenen feil modell i rotte. Denne modellen ble var assosiert med en akseptabel sykelighet funnet for å oppdage forskjeller mellom ubehandlede og behandlet sener og mellom to behandlinger testet.

Regenerative medicine provides novel alternatives to conditions that challenge traditional treatments. The prevalence and morbidity of tendinopathy across ...

Research

JoVE Journal

Medicine

A Mouse Model of in Utero Transplantation

A Mouse Model of in Utero Transplantation

The transplantation of stem cells and viruses in utero has tremendous potential for treating congenital disorders in the human fetus.  For example, in ...

A Contusion Model of Severe Spinal Cord Injury in Rats

En Contusion modell av alvorlig ryggmargsskade i rotter

The translational potential of novel treatments should be investigated in severe spinal cord injury (SCI) contusion models. A detailed methodology is ...

A Radio-telemetric System to Monitor Cardiovascular Function in Rats with Spinal Cord Transection and Embryonic Neural Stem Cell Grafts

En Radio-telemetrisk system for å overvåke kardiovaskulær funksjon i rotter med ryggmargstran og Embryonic Neural Stem Cell Grafts

High thoracic or cervical spinal cord injury (SCI) can lead to cardiovascular dysfunction. To monitor cardiovascular parameters, we implanted a catheter ...

Neural Stem Cell Transplantation in Experimental Contusive Model of Spinal Cord Injury

Nevrale stamcelletransplantasjon i Experimental Contusive Modell av ryggmargsskade

Spinal cord injury is a devastating clinical condition, characterized by a complex of neurological dysfunctions. Animal models of spinal cord injury can ...

Evaluation of the Efficacy of the H. pylori Protein HP-NAP as a Therapeutic Tool for Treatment of Bladder Cancer in an Orthotopic Murine Model

Evaluation of the Efficacy of the H. pylori Protein HP-NAP as a Therapeutic Tool for Treatment of Bladder Cancer in an Orthotopic Murine Model

Vurdering av effektiviteten av<em&gt; H. pylori</em&gt; Protein HP-NAP som et terapeutisk verktøy for behandling av blærekreft i en ortotopiske Murine Model

Bladder cancer is one of the most common malignancies of the urogenital tract. Intravesical injection of Bacillus Calmette-Gu&#233;rin (BCG) is the gold ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Studerer Bukspyttkjertelkreft Stem Cell Kjennetegn for å utvikle nye behandlingsstrategier

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

A Neonatal Mouse Spinal Cord Compression Injury Model

En Neonatal Mouse ryggmargskompresjon Injury Model

Spinal cord injury (SCI) typically causes devastating neurological deficits, particularly through damage to fibers descending from the brain to the spinal ...

Murine Flexor Tendon Injury and Repair Surgery

Murine flexor sene skade og reparer Surgery

Tendon connects skeletal muscle and bone, facilitating movement of nearly the entire body. In the hand, flexor tendons (FTs) enable flexion of the fingers ...

Balloon-based Injury to Induce Myointimal Hyperplasia in the Mouse Abdominal Aorta

Ballong-baserte skade å indusere Myointimal Hyperplasia i musen Abdominal Aorta

The use of animal models is essential for a better understanding of MH, one major cause for arterial stenosis.In this article, we demonstrate a murine ...

Evaluation of Coronary Flow Reserve After Myocardial Ischemia Reperfusion in Rats

Evaluering av koronar Flow Reserve etter hjerteinfarkt ischemia reperfusion i rotter

Coronary artery disease is the leading cause of death worldwide. After an acute myocardial infarction, early and successful myocardial intervention via ...