Name: evaluation of stem cell therapies in a bilateral patellar tendon injury model in rats
Uploaded: 2018-03-30T14:00:00
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Os autores gostaria de reconhecer o Dr. Su, PhD, a análise estatística dos dados. Os autores também agradecer Dr. McClure, DVM, PhD DACLAM, seus conselhos sobre a anestesia e dor gestão protocolos usados no estudo. Este projecto foi apoiado por concessões do Western University of Health Sciences escritório do Vice-Presidente de pesquisa (12678v) e USDA seção 1433 fundos (2090).

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê de uso (IACUC) de Western University of Health Sciences e institucional Cuidado Animal.
1. isolamento e expansão de MSCs da matriz equina do Cordão Umbilical
<ol><li>Obter a placenta de uma égua adulta (grávida), depois observou parto e isolar assepticamente o cordão umbilical da placenta. Mantenha o cordão umbilical em solução salina tamponada fosfato (PBS) com 1% penicilina-estreptomicina (P/S) a 4 ° C durante a transfe...

Células de equinos foram Selecionadodas para este projeto porque pretendemos eventualmente testar abordagens de candidato na gestão de tendinopatias naturais em cavalos. De fato, lesões dos tendões em cavalos são atraentes como modelos naturais de tendinopatia no homem por causa da similaridade biológica entre os equino flexor digital superficial e tendão de Aquiles em seres humanos41. Marcadores superfície celular CD44, CD90, CD105, CD34 e MHC II foram selecionados para immunophenotyping ...

Lesão no tendão é uma das causas mais comuns de significativa atrofia muscular e dor em toda a espécie1. Em medicina veterinária, lesões de tendões e ligamentos são de especial interesse em cavalos, 82% de todas as lesões em cavalos de corrida envolvem o sistema músculo-esquelético, e 46% daqueles afetam os tendões e ligamentos2,3. Formação de tecido cicatricial afeta as propriedades biomecânicas dos tendões cicatrizadas e explica o prognóstico guardado para retorno ao Atlético uso após lesões dos tendões flexores; re-ferimento ocorre dentro de 2 anos em até 67% de cavalos tratados conservadoramente4. Medicina regenerativa fornece novas alternativas para uma condição que desafia os tratamentos tradicionais. Terapia de células-tronco autólogas produziu alguns animadores resultados5,6 , mas é limitada pela morbidade associada com a coleção de tecido, administração retardada devido ao processamento/reprogramação de células e a influência da Estado de saúde do paciente (tais como a idade) nas propriedades do tronco células7,8. Estas limitações fornecem uma lógica para a investigação de células-tronco alogênico como uma alternativa de prateleira. Células derivadas de seus anexos fetais são candidatos atraentes porque eles contornar as preocupações éticas e o risco de formação de teratoma associado com células-tronco embrionárias. Entre seus anexos fetais, matriz de cordão umbilical (UCM), também chamada geleia de Wharton, é abundante e fácil de coletar.
Independentemente da fonte da célula, aumentar stemness é essencial para estabelecer um banco de células para a medicina regenerativa alogênico. Do ponto de vista funcional, stemness pode ser definido como o potencial para diferenciação de auto-renovação e linhagem multi9. Provas de stemness se baseia em proliferação e diferenciação ensaios, juntamente com a expressão de genes marcadores Oct4, Sox2 e Nanog9. Uma estratégia para melhorar a stemness se baseia na utilização de biomateriais para servir como nulo enchimentos e transportadoras, realçando a proliferação e diferenciação de UCM-MSCs. Essa abordagem elimina preocupações em relação a manipulação de fatores transcricionais para reprogramar células maduras em células pluripotentes induzidas. Entre os biomateriais considerados como portadores de potenciais para as células-tronco, quitosana é atraente por sua biocompatibilidade e degradabilidade10. Este aminipolissacarídeo natural é formado por alcalina deacetilação da quitina, a segunda mais abundante polissacarídeo natural, principalmente obtida como um subproduto de marisco10. Temos anteriormente investigados interações entre MSCs e andaimes de quitosana e observou a formação de esferoides11,12,13,14,15, 16. também informamos sobre a superioridade da condrogênese em quitosana matrizes12,13,14,15,16,17, 18. Mais recentemente, dois estudos independentes descreveram formação de esferoides pelo tecido adiposo e tecido de placenta derivada MSCs cultivadas em um filme de quitosana19,20. Esta formação de esferoides não apenas reforçada stemness, mas também melhorou a retenção das células estaminais após na vivo implantação20.
A prevalência e morbidade de tendinopatia em toda espécie tem solicitado o desenvolvimento de modelos experimentais para estudar a fisiopatologia de tendinopatias e testar novas terapias tais como injeções de células-tronco. Em cavalos, tendinite induzida por colagenase é um modelo comum para demonstrar a eficácia usando MSCs no tendão reparação21. A relevância desta abordagem é limitada, como as injeções causam alterações inflamatórias agudas, Considerando que tendinopatias clínicas geralmente resultam de crônica overstrain22,23. Além disso, a indução química de doença do tendão induz uma resposta curativa e não replica o processo de cicatrização prejudicado presente em casos clínicos22,23. Excisão de um segmento do tendão flexor digital superficial tem sido descrito como um modelo cirúrgico da tendinite em cavalos24. Mais recentemente, uma abordagem minimamente invasiva foi usada para restringir o dano traumático para o núcleo central do tendão flexor digital superficial25. Modelos cirúrgicos não simular o mecanismo de fadiga que pode levar à doença natural do tendão e tendem a falta de reprodutibilidade na extensão do dano criado25. Independentemente do modelo, a morbidade e custo associado com equinos modelos do tendão doenças são limitações adicionais, que justificam o interesse em modelos de roedores como um primeiro passo na vivo avaliação de novas terapias.
Uma das principais vantagens de modelos experimentais em roedores consiste o custo e a capacidade de controlar a variabilidade inter-individual. Roedores podem ser padronizados em relação a vários fatores fisiológicos devido a suas taxas de crescimento rápido e relativamente curta expectativa de vida, limitando as fontes de variação e, portanto, reduzindo o número de animais necessários para detectar diferenças. Estratégias para induzir doenças tendão em roedores têm confiado na indução química, mas também na criação cirúrgica de tendão parcial defeitos21. Modelos cirúrgicos podem simular melhor do que os modelos químicos naturais tendinopatias, mas podem levar a maior morbidade e falha catastrófica do tendão danificado. A esse respeito, ratos parecem candidatos melhores do que os ratos para estes modelos, como seu tamanho permite a criação de defeitos maiores, facilitando a avaliação da cicatrização tecidual. Foram utilizados ratos Sprague Dawley em estudos experimentais de tendinopatias em quatro grupos principais do tendão: manguito rotador, flexor, Aquiles e tendões patelar26. Entre estes, modelos envolvendo o tendão patelar são especialmente atraentes por causa do tamanho maior deste tendão e a facilidade de acessá-lo27. O tendão patelar anexa o músculo quadríceps a tuberosidade tibial. No âmbito deste mecanismo extensor, a patela é um osso sesamoide que direciona a ação do quadríceps e delineia a extensão proximal do tendão patelar. A presença de âncoras ósseas nas extensões proximais e distais do tendão patelar facilita testes biomecânicos. Modelos envolvendo o tendão patelar normalmente dependem de defeitos cirúrgicos unilaterais, com um tendão intacto contralateral, servindo como um controle28,29. O modelo mais comum de defeito do tendão patelar envolve a excisão da porção central (1 mm de largura) do tendão patelar partir do ápice distal da patela para a inserção da tuberosidade da tíbia, enquanto o tendão patelar contralateral é deixado intacto. Medidas de resultados incluíram, histologia, testes biomecânicos não-destrutivos ou testes biomecânicos para falha, ultra-sonografia, ex vivo imagens de fluorescência, observação bruta e testes funcionais28,30 ,31. Modelos unilaterais não permitir a comparação de um tratamento proposto com tratamento conservador de lesão semelhante dentro do mesmo animal. Da mesma forma, a comparação entre os vários tratamentos requer animais separados. Um modelo bilateral seria eliminar variações inter individuais e reduzir o número de animais necessários para um estudo de32. No entanto, lesões bilaterais podem aumentar a morbidade e claudicação bilateral poderia comprometer a avaliação do tratamento. Alguns estudos relatam brevemente o uso do tendão patelar bilateral defeitos em ratos mas foco sobre os efeitos dos tratamentos, ao invés de gestão peri-operatório e morbidade do modelo33,34.
Objetivo a longo prazo do presente estudo é desenvolver uma estratégia para melhorar a sobrevivência de stemness e na vivo da UCM-MSCs destinado a transplante alogênico. Para atingir este objetivo, recentemente informamos stemness melhorada da UCM-MSCs por formação de esferoides em filme de quitosana e incubação sob ambiente hipóxico35. Essas propriedades em vitro foram associadas com melhoria propriedades biomecânicas do tendão patelar defeitos tratados com condicionado UCM-MSCs. com base nestes resultados, o modelo de defeito do tendão patelar bilateral de rato parece apropriado para testar o candidato tratamentos para lesões de tendão36. A finalidade do estudo relatado aqui é fornecer protocolos detalhados para isolamento e caracterização de UCM-MSCs, elaboração de um sistema biológico de células-tronco, criação e tratamento de defeitos de tendão patelar bilateral e pós-operatório recuperação e avaliação de cura dentro dos defeitos de tecido.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>PBS 10X</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30258.01</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type IA</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004197</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM low glucose</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30021.FS</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30910.03</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin 100X</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SV30010</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 0.25%</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30042.01</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Innovative Cell Technologies</td>
			<td>AT104</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SV30084.01</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chitosan</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3646</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8045</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30574.01</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round bottom polystyrene tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>149591A</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-horse CD44 (FITC)</td>
			<td>AbD serotec</td>
			<td>MCA1082F</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-rat CD90 (FITC)</td>
			<td>AbD serotec</td>
			<td>MCA47FT</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-horse MHC-II (FITC)</td>
			<td>AbD serotec</td>
			<td>MCA1085F</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG1 (FITC) - Isotype Control</td>
			<td>AbD serotec</td>
			<td>MCA928F</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal [SN6] to CD105 (FITC)</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab11415</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG1 (FITC) - Isotype Control</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab91356</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-human CD34 (FITC)</td>
			<td>BD</td>
			<td>BDB560942</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IdG1 kappa (FITC)</td>
			<td>BD</td>
			<td>BDB555748</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7-AAD</td>
			<td>BD</td>
			<td>BDB559925</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Accuri C6 Flow Cytometer</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacutainer 5ml</td>
			<td>Med Vet International</td>
			<td>RED5.0</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acid-citrate-dextrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3821</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5670</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sevoflurane</td>
			<td>JD Medical</td>
			<td>60307-320-25</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rats</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>Strain code: 400</td>
			<td>Experimental animal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat surgical kit</td>
			<td>Harvard apparatus</td>
			<td>728942</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Blade #15</td>
			<td>MEDLINE</td>
			<td>MDS15115</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat MD&#39;s Baytril (2 mg/Tablet), 
			Rimadyl (2 mg/Tablet)</td>
			<td>Bio Serv</td>
			<td>F06801</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyglactin 910, 5-0</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>J436G</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin alchol shandon</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>6766007</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harris Hematoxylin</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>143907</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of stem cell therapies in a bilateral patellar tendon injury model in rats

Medicina regenerativa fornece novas alternativas às condições que desafiam os tratamentos tradicionais. A prevalência e morbidade de tendinopatia em toda a espécie, combinada com as propriedades curativas limitadas deste tecido, ter solicitado a busca de terapias celulares e impulsionou o desenvolvimento de modelos experimentais para estudar a sua eficácia. Cordão umbilical matriz-derivados mesenquimais células-tronco (UCM-MSC) são candidatos atraentes porque eles são abundantes, fácil de coletar, contornar as preocupações éticas e o risco de formação de teratoma, ainda assemelham-se a células-tronco embrionárias primitivas mais pròxima do que adulto derivado de tecido MSCs. significativo interesse centrou-se na quitosana como uma estratégia para melhorar as propriedades do MSCs através da formação de esferoide. Este papel detalhes técnicas para isolar a UCM-MSCs, preparar esferoides no filme de quitosana e analisar o efeito da formação de esferoide na expressão do marcador de superfície. Consequentemente, a criação de um modelo de lesão do tendão patelar bilateral em ratos é descrita para implantação na vivo de esferoides UCM-MSC formada-se em filme de quitosana. Nenhuma complicação foi observada no estudo em relação a morbidade, estresse crescentes efeitos, ou infecção do tecido. O escore funcional total dos ratos operados em 7 dias foi menor do que ratos normais, mas retornou ao normal dentro de 28 dias após a cirurgia. Golo de histológico da cicatrização tecidual confirmou a presença de um coágulo em defeitos tratados avaliada em 7 dias, ausência de reação de corpo estranho e progredindo cura em 28 dias. Este modelo de defeito do tendão patelar bilateral controla variação inter-individual, através da criação de um controle interno em cada rato, foi associado com morbidade aceitável e permitiu a deteção das diferenças entre os tendões não tratados e tratamentos.

No estudo atual, os resultados são apresentados como média ± DP (desvio padrão). As células foram isoladas a partir do cordão umbilical de 6 mares e porcentagem de linhas de células isoladas expressando cada marcador de superfície celular sob condicionamento standard ou quitosana foram comparados com um teste de Friedman, como uma análise de variância não-paramétrica com repetidas medidas. Para a criação de modelo de defeito do tendão, 8 ratos foram utilizados para avaliaç...

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Evaluation of Stem Cell Therapies in a Bilateral Patellar Tendon Injury Model in Rats

Avaliação de terapias de células-tronco em um modelo de lesão do tendão patelar Bilateral em ratos

Este paper descreve a preparação e avaliação do cordão umbilical células-tronco mesenquimais derivadas de matriz de esferoides com um modelo de defeito bilateral do tendão patelar em um rato. Este modelo foi associado com uma morbilidade aceitável e foi encontrado para detectar diferenças entre tendões tratados e não tratados e entre os dois tratamentos testado.

Regenerative medicine provides novel alternatives to conditions that challenge traditional treatments. The prevalence and morbidity of tendinopathy across ...

Research

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