Name: evaluation of stem cell therapies in a bilateral patellar tendon injury model in rats
Uploaded: 2018-03-30T14:00:00
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Los autores desean reconocer Su Dr., PhD, para su análisis estadístico de los datos. Los autores también agradecen al Dr. McClure, DVM, PhD DACLAM, para su asesoramiento en la anestesia y protocolos de administración de dolor utilizan en el estudio. Este proyecto fue apoyado por becas del Western University of Health Sciences oficina del Vice Presidente de investigación (12678v) y fondos de USDA sección 1433 (2090).

Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por el institucional cuidado Animal y el Comité uso (IACUC) de la Western University of Health Sciences.
1. aislamiento y expansión de MSCs de matriz equina del cordón Umbilical
<ol><li>Obtener la placenta de una yegua adulta (embarazada) después de observado parir y aislarlo asépticamente el cordón umbilical de la placenta. Mantener el cordón umbilical en tampón fosfato salino (PBS) con 1% de penicilina-estreptomicina (P/S) a 4 ?...

Células equinas fueron seleccionadas para este proyecto porque finalmente vamos a prueba enfoques de candidato en el tratamiento de tendinopatías natural en caballos. De hecho, lesiones de los tendones en los caballos son atractivos como modelos naturales de tendinopathy en el hombre debido a la similitud biológica entre el equino flexor digital superficial y el tendón de Aquiles en los seres humanos41. Los célula marcadores de superficie CD44, CD90, CD105, CD34 y MHC II se seleccionaron para...

Lesión del tendón es una de las causas más comunes de atrofia muscular y dolor significativa de especies1. En medicina veterinaria, lesiones de tendones y ligamentos son de especial interés en los caballos, ya que 82% de las lesiones en caballos de carrera implican el sistema músculo-esquelético, 46% de los que afectan a los tendones y los ligamentos2,3. Formación de tejido cicatricial afecta las propiedades biomecánicas de los tendones curadas y explica el pronóstico guardado para volver a uso deportivo después de lesiones del tendón flexor; nueva lesión ocurre dentro de 2 años en hasta un 67% de los caballos tratados conservador4. Medicina regenerativa ofrece nuevas alternativas a una condición que desafía a los tratamientos tradicionales. Terapia de células madre autólogo ha producido algunos resultados alentadores5,6 pero está limitada por la morbilidad asociada con la colección de tejidos, administración retardada debido a procesamiento/reprogramación de las células y la influencia de la Estado de salud del paciente (como la edad) en las propiedades del tallo las células7,8. Estas limitaciones proporcionan un fundamento para la investigación de células madre alogénicas como alternativa inmediata. Células fetales derivados del adnexa son candidatos atractivos ya que eluden las preocupaciones éticas y el riesgo de formación de teratoma con células madre embrionarias. Entre los anejos fetales, matriz del cordón umbilical (UCM), también llamado gelatina de Wharton, es abundante y fácil de recoger.
Independientemente de la fuente de la célula, mejorando la troncalidad es esencial para establecer un banco de células para la medicina regenerativa alógeno. Desde un punto de vista funcional, la troncalidad puede definirse como la posibilidad de auto renovación y multilineal diferenciación9. Evidencia de la troncalidad basa en la proliferación y diferenciación ensayos, junto con la expresión de marcadores gen Oct4, Sox2 y Nanog9. Una estrategia para mejorar la troncalidad se basa en la utilización de Biomateriales para servir como vacíos rellenos y portadores, mejorar la proliferación y la diferenciación de MSCs de la UCM. Este enfoque elimina preocupaciones con respecto a la manipulación de factores transcripcionales para reprogramar las células maduras en células pluripotentes inducidas. Entre los biomateriales consideradas como posibles portadores de células madre, chitosan es atractiva por su biocompatibilidad y biodegradabilidad10. Este aminopolysaccharide natural está formado por desacetilación alcalina de la quitina, el polisacárido natural más abundante en segundo lugar, que principalmente se obtiene como un subproducto de mariscos10. Previamente hemos investigado las interacciones entre MSCs y andamios de quitosano y observó la formación de esferoides11,12,13,14,15, 16. también informó sobre la superioridad de la condrogénesis en quitosano matrices12,13,14,15,16,17, 18. Más recientemente, dos estudios independientes describen formación de esferoides por tejido adiposo y tejido de placenta derivados MSCs cultivadas en una película de quitosano19,20. Esta formación de esferoides no sólo había mejorado troncalidad, pero también mejora la retención de las células madre después de en vivo implantación20.
La prevalencia y morbilidad de la Tendinopatía entre especies han impulsado el desarrollo de modelos experimentales para estudiar la fisiopatología de las tendinopatías y probar nuevas terapias como las inyecciones de células madre. En los caballos, tendonitis colagenasa-inducido es un modelo común para demostrar la eficacia utilizando MSCs en reparación de tendón21. La relevancia de este enfoque es limitada, como las inyecciones provocan cambios inflamatorios agudos, mientras que clínica tendinopatías generalmente son el resultado de crónica agotamiento extremo22,23. Además, la inducción química de la enfermedad del tendón induce una respuesta curativa y no reproduce el proceso de curación deteriorado en casos clínicos22,23. Supresión de un segmento de tendón del flexor digital superficial ha sido descrita como un modelo quirúrgico de la tendinitis en caballos24. Más recientemente, se utilizó un acercamiento como mínimo invasor para restringir el daño traumático a la base central del tendón del flexor digital superficial25. Los modelos quirúrgicos no simulan el mecanismo de fatiga que puede conducir a la enfermedad natural del tendón y tienden a la falta de reproducibilidad en el grado de daño creado25. Sin importar el modelo, la morbilidad y costes asociados con modelos equinos del tendón enfermedades son limitaciones adicionales, que justifican un interés en modelos de roedores como un primer paso para la evaluación en vivo de nuevas terapias.
Una de las principales ventajas de los modelos experimentales en roedores consiste en el costo y la capacidad de controlar la variabilidad interindividual. Roedores pueden ser normalizados con respecto a varios factores fisiológicos debido a sus rápidas tasas de crecimiento y relativamente corta longevidad, limitando las fuentes de variación y por lo tanto reduciendo el número de animales necesarios para detectar diferencias. Estrategias para inducir enfermedades del tendón en roedores se han basado en inducción de la química, sino también en creación quirúrgica de defectos parciales del tendón21. Modelos quirúrgicos pueden simular tendinopatías natural mejor que los modelos químicos, pero pueden conducir a mayor morbilidad y fallas catastróficas del tendón dañado. En ese sentido, las ratas parecen mejores candidatos que los ratones para estos modelos, ya que su tamaño permite creación de defectos más grandes, facilitando la evaluación de la curación del tejido. Se han utilizado ratas Sprague-Dawley en estudios experimentales de tendinopatías en cuatro grupos principales del tendón: rotura del manguito rotador, flexor, Aquiles y tendones patelar26. Entre ellos, modelos que involucran el tendón rotuliano están especialmente atractivos debido al tamaño de este tendón y la facilidad de acceso a27. El tendón rotuliano fija el músculo cuádriceps a la tuberosidad tibial. Dentro de este mecanismo extensor, la rótula es un hueso sesamoideo que se dirige la acción de los cuádriceps y delinea la parte proximal del tendón rotuliano. La presencia de anclajes óseos en las extensiones proximales y distales del tendón rotuliano facilita pruebas biomecánicas. Modelos que involucran el tendón rotuliano típicamente dependen de defectos quirúrgicos unilaterales, con un tendón intacto contralateral que sirve como un control28,29. El modelo más común de defecto de tendón rotuliano consiste en suprimir la parte central (a 1 mm de ancho) del tendón rotuliano de la cúspide distal de la rótula a la inserción de la tuberosidad tibial, mientras que el tendón rotuliano contralateral quedo intacto. Medidas de resultados incluyen histología, no biomecánicos destructivos o ensayos biomecánicos al fracaso, proyección de imagen de ultrasonido, ex vivo imágenes de fluorescencia, bruto observación y pruebas funcionales28,30 ,31. Modelos unilaterales no permiten comparación de un tratamiento propuesto con la gerencia conservadora de una lesión similar en el mismo animal. Del mismo modo, comparación entre varios tratamientos requiere animales separados. Un modelo bilateral eliminaría las variaciones interindividuales y reducir el número de animales requeridos para un estudio de32. Sin embargo, lesiones bilaterales pueden aumentar la morbilidad, y cojera bilateral podría impedir la evaluación del tratamiento. Algunos estudios reportan brevemente el uso de defectos bilaterales del tendón patelar en ratas pero se centran sobre los efectos de los tratamientos en lugar de administración perioperatoria y la morbilidad del modelo33,34.
Objetivo a largo plazo de este estudio es desarrollar una estrategia para mejorar la supervivencia de la troncalidad celular e in vivo de la UCM-MSCs destinada a trasplante alógeno. Para lograr este objetivo, hemos informado recientemente mejorado troncalidad de MSCs UCM por formación de esferoides en la película de quitosano e incubación en ambiente hipóxico35. Estas propiedades en vitro se asociaron con mejores propiedades biomecánicas del tendón rotuliano defectos tratados con acondicionado UCM-MSCs. basado en estos resultados, el modelo de rata del tendón patelar bilateral defecto parece conveniente probar candidato tratamientos para lesiones de tendón36. El objetivo del estudio aquí reportado es proporcionar protocolos detallados para aislamiento y caracterización de la UCM-MSCs, preparación de un sistema biológico para las células de vástago, creación y tratamiento de defectos de tendón rotuliana bilateral y en el post-operatorio recuperación y evaluación de la curación dentro de los defectos del tejido.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>PBS 10X</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30258.01</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type IA</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004197</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM low glucose</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30021.FS</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30910.03</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin 100X</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SV30010</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 0.25%</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30042.01</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Innovative Cell Technologies</td>
			<td>AT104</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SV30084.01</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chitosan</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3646</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8045</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30574.01</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round bottom polystyrene tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>149591A</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-horse CD44 (FITC)</td>
			<td>AbD serotec</td>
			<td>MCA1082F</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-rat CD90 (FITC)</td>
			<td>AbD serotec</td>
			<td>MCA47FT</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-horse MHC-II (FITC)</td>
			<td>AbD serotec</td>
			<td>MCA1085F</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG1 (FITC) - Isotype Control</td>
			<td>AbD serotec</td>
			<td>MCA928F</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal [SN6] to CD105 (FITC)</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab11415</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG1 (FITC) - Isotype Control</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab91356</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-human CD34 (FITC)</td>
			<td>BD</td>
			<td>BDB560942</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IdG1 kappa (FITC)</td>
			<td>BD</td>
			<td>BDB555748</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7-AAD</td>
			<td>BD</td>
			<td>BDB559925</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Accuri C6 Flow Cytometer</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacutainer 5ml</td>
			<td>Med Vet International</td>
			<td>RED5.0</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acid-citrate-dextrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3821</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5670</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sevoflurane</td>
			<td>JD Medical</td>
			<td>60307-320-25</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rats</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>Strain code: 400</td>
			<td>Experimental animal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat surgical kit</td>
			<td>Harvard apparatus</td>
			<td>728942</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Blade #15</td>
			<td>MEDLINE</td>
			<td>MDS15115</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat MD&#39;s Baytril (2 mg/Tablet), 
			Rimadyl (2 mg/Tablet)</td>
			<td>Bio Serv</td>
			<td>F06801</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyglactin 910, 5-0</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>J436G</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin alchol shandon</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>6766007</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harris Hematoxylin</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>143907</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of stem cell therapies in a bilateral patellar tendon injury model in rats

Medicina regenerativa ofrece nuevas alternativas a las condiciones que desafían a los tratamientos tradicionales. La prevalencia y morbilidad de tendinopathy en especies, combinada con las limitadas propiedades curativas de este tejido, han promovido la búsqueda de terapias celulares y propulsó el desarrollo de modelos experimentales para el estudio de su eficacia. Cordón umbilical derivados de matriz células madre mesenquimales (MSC-UCM) son candidatos atractivos porque son abundantes, fáciles de recoger, eludir las preocupaciones éticas y el riesgo de formación de teratoma, sin embargo, se asemejan a las células madre embrionarias primitivas más estrechamente que interés de MSCs. significativas derivadas de tejido adulto se ha centrado en quitosano como una estrategia para mejorar las propiedades de MSCs mediante formación esferoide. Estas técnicas de información de papel para aislar UCM-MSCs, preparar esferoides en la película de quitosano y analizar el efecto de formación esferoide en expresión superficial del marcador. En consecuencia, creación de un modelo de lesión del tendón patelar bilateral en ratas se describe para la implantación de en vivo de esferoides UCM-MSC formado en la película de quitosano. Ninguna complicación se observó en el estudio con respecto a la morbilidad, estrés aumento de efectos, o infección del tejido. La puntuación total funcional de las ratas operadas a los 7 días fue más baja que la de las ratas normales, pero volvió a la normalidad dentro de 28 días después de la cirugía. Resultados histológicos de curación de tejido confirman la presencia de un coágulo en defectos tratados evaluados a los 7 días, ausencia de reacción del cuerpo extranjero y progresiva curación a los 28 días. Este modelo de defecto del tendón rotuliana bilateral controla variación interindividual mediante la creación de un control interno en cada rata fue asociado con morbilidad aceptable y permitieron la detección de diferencias entre los tendones no tratados y tratamientos.

En el estudio actual, los resultados se presentan como media ± SD (desviación estándar). Las células fueron aisladas de los cordones umbilicales de 6 yeguas, y porcentaje de líneas celulares aisladas de expresar cada marcador superficial de la célula bajo acondicionado estándar o quitosano se compararon con una prueba de Friedman, como un análisis no paramétrico de varianza con repetidos medidas. Para la creación de modelo de defecto del tendón, se utilizaron 8 ratas para la ev...

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Evaluation of Stem Cell Therapies in a Bilateral Patellar Tendon Injury Model in Rats

Evaluación de terapias con células madre en un modelo de lesión del tendón patelar Bilateral en ratas

Este papel describe la preparación y la evaluación del cordón umbilical células madre mesenquimales derivadas de matriz esferoides con un modelo de defecto del tendón patelar bilateral en una rata. Este modelo se asocia con una morbilidad aceptable y encontraron para detectar diferencias entre los tendones no tratados y tratados y entre los dos tratamientos probado.

Regenerative medicine provides novel alternatives to conditions that challenge traditional treatments. The prevalence and morbidity of tendinopathy across ...

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JoVE Journal

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