Name: evaluation of stem cell therapies in a bilateral patellar tendon injury model in rats
Uploaded: 2018-03-30T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Stem Cell Therapies in a Bilateral Patellar Tendon Injury Model in Rats at JoVE.com

Författarna vill erkänna Dr Su, PhD, för hennes statistisk analys av data. Författarna också tacka Dr McClure, DVM, PhD DACLAM, för hennes råd på anestesi och smärta hanteringsprotokoll används i studien. Projektet stöddes av bidrag från Western University of Health Sciences kontoret av Vice President för forskning (12678v) och USDA avsnitt 1433 medel (2090).

Alla metoderna som beskrivs här har godkänts av den institutionella djur vård och användning kommittén (IACUC) av Western University of Health Sciences.
1. isolering och Expansion av MSCs från Equine navelsträngen matris
<ol><li>Erhålla moderkakan från en vuxen mare (gravid) efter observerade fölning och aseptiskt isolera navelsträngen från moderkakan. Håll navelsträngen i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) med 1% penicillin-streptomycin (P/S) vid 4 ° C under överföringen till...

Equine celler valdes för detta projekt eftersom vi så småningom tänker testa kandidat metoder i hanteringen av naturliga tendinopathies hos hästar. Sena skador hos hästar är verkligen lockande som naturliga modeller av tendinopathy i mannen på grund av biologiska likheten mellan equine ytliga digitala flexor och hälsenan i människor41. De cell ytmarkörer CD44, CD90, CD105, CD34 och MHC II valdes för immunophenotyping av celler, enligt de kriterier som rekommenderas av den internationel...

Senan skada är en av de vanligaste orsakerna till betydande smärta och muskel atrofi över arter1. Inom veterinärmedicinen är senor och ligament skador av särskilt intresse för hästar, som 82% av alla skador i kapplöpningshästar involverar rörelseapparaten, och 46 procent av dem påverkar senor och ligament2,3. Ärrvävnad bildas påverkar läkta senor biomekaniska egenskaper och förklarar bevakad prognosen för återgång till athletic användning efter flexor sena skador; Re-skadan uppstår inom 2 år i upp till 67% av hästar behandlades konservativt4. Regenerativ medicin ger romanen alternativ till ett tillstånd som utmanar traditionella behandlingar. Terapi med autologa stamceller har producerat några uppmuntrande resultat5,6 men begränsas av den sjuklighet som är associerad med vävnad insamling, fördröjd administrering på grund av bearbetning/omprogrammering av celler och påverkan av den patientens hälsotillstånd (såsom ålder) i egenskaperna för stem cells7,8. Dessa begränsningar ge en motivering för att utreda allogena stamceller som ett off-the-shelf alternativ. Fostrets adnexa-derived celler är tilltalande kandidater eftersom de kringgå etiska betänkligheter och risk för teratoma bildning förknippas med embryonala stamceller. Bland fostrets adnexa är navelsträngen matrix (UCM), också heter Whartons gelé, riklig och lätt att samla in.
Oavsett cell källa är det nödvändigt att upprätta en cell bank för prövningar regenerativ medicin att förbättra stemness. Ur en funktionell synvinkel, kan stemness definieras som risken för självförnyelse och flera härstamning differentiering9. Bevis på stemness beroende proliferation och differentiering analyser, tillsammans med uttrycket av genen markörer Oct4, Sox2, och Nanog9. En strategi för att förbättra stemness är beroende av användningen av biomaterial som ogiltiga fyllmedel och bärare ökad proliferation och differentiering av UCM-MSCs. Denna strategi eliminerar oro för manipulation av transkriptionell faktorer att omprogrammera mogna celler i inducerade pluripotenta celler. Bland biomaterial betraktas som potentiella bärare för stamceller, är chitosan tilltalande för sina biokompatibilitet och nedbrytbarhet10. Detta naturliga aminopolysaccharide bildas av alkaliska deacetylering av chitinen, den näst vanligaste naturliga polysackarid, primärt erhålls som en minimiimportpriserna skaldjur10. Vi har tidigare undersökt samspelet mellan MSCs och chitosan ställningar, och observerade bildandet av spheroids11,12,13,14,15, 16. vi rapporterade också om överlägsenhet av kondrogenes om chitosan matriser12,13,14,15,16,17, 18. Mer nyligen, två oberoende studier beskrivs spheroids bildandet av fettvävnad och moderkakan vävnad härrör MSCs odlade på en chitosan film19,20. Denna formation av spheroids inte bara förbättrat stemness, men också förbättrat lagring av stamceller efter i vivo implantation20.
Prevalens och sjuklighet av tendinopathy över arter har föranlett utvecklingen av experimentella modeller för att studera patofysiologin bakom tendinopathies och testa nya terapier såsom stamceller injektioner. Hästar är kollagenas-inducerad tendinit en gemensam modell för att demonstrera effekten använder MSCs i senan reparation21. Relevansen av detta tillvägagångssätt är begränsad, eftersom injektioner orsaka akut inflammatoriska förändringar, medan kliniska tendinopathies brukar resultera från kronisk överansträngning22,23. Dessutom kemisk inducering av senan sjukdom inducerar en helande svar och replikerar inte nedsatt läkningsprocessen närvarande i kliniska fall22,23. Excision av ett segment av ytliga digitala flexor senan har beskrivits som en kirurgisk modell av tendinit i hästar24. Mer nyligen, användes en minimalt invasiv metod att begränsa de traumatiska skador till den centrala kärnan i de ytliga digitala flexor tendon25. Kirurgiska modeller gör inte simulera den trötthet mekanism som kan leda till naturliga senan sjukdom, och tenderar att saknar reproducerbarhet i omfattningen av skada skapade25. Oavsett modell, sjuklighet och kostnaden i samband med höstdagjämningen modeller av senan finns sjukdomar ytterligare begränsningar, som motiverar ett intresse för gnagare modeller som ett första steg i vivo utvärdering av nya behandlingar.
En av de främsta fördelarna med experimentella modeller hos gnagare består av kostnaden och möjligheten att styra interindividuell variabilitet. Gnagare kan vara standardiserat med avseende på olika fysiologiska faktorer på grund av deras snabba tillväxt och kort relativt livslängd, begränsa källor till variation och därför minska antalet djur som krävs för att upptäcka skillnader. Strategier för att framkalla senan sjukdomar hos gnagare har förlitat sig på kemiska induktion, men också på kirurgiska skapandet av partiell senor defekter21. Kirurgiska modeller kan simulera naturlig tendinopathies bättre än kemiska modeller, men kan leda till högre sjuklighet och totalhavererar den skadada senan. I det avseendet verkar råttor bättre kandidater än möss för dessa modeller, eftersom deras storlek tillåter skapandet av större defekter, därigenom underlätta utvärderingen av vävnad healing. Sprague-Dawley-råttor har använts i experimentella studier av tendinopathies i fyra stora senan grupper: rotatorkuffen, flexor, Achilles och patellar senor26. Bland dessa är modeller som innebär att knäskålssenan särskilt tilltalande på grund av den större storleken av denna senan och enkel åtkomst till den27. Knäskålssenan fäster i quadriceps-muskeln vid tibial ischii. Inom denna extensor mekanismen är patella en sesamoid ben som leder handlingen av quadriceps och skisserar proximala omfattningen av knäskålssenan. Förekomsten av beniga ankare på proximala och distala graderna av knäskålssenan underlättar biomekaniska tester. Modeller som involverar knäskålssenan vanligtvis lita på ensidiga kirurgiska defekter, med en kontralateral intakt sena tjänstgör som en kontroll28,29. Den vanligaste knäskålssenan defekt modellen innebär excising den centrala delen (1 mm i bredd) av knäskålssenan från distala spetsen av knäskålen till införandet av den tibial ischii, medan den kontralaterala knäskålssenan lämnas intakt. Åtgärder av utfall har inkluderat histologi, icke-förstörande biomekanisk testning eller biomekaniska tester till misslyckande, ultraljudsundersökningar, ex vivo fluorescens imaging, brutto observation och funktionella tester28,30 ,31. Unilaterala modeller tillåter inte jämförelse av en föreslagen behandling med konservativ behandling av en liknande skada inom samma djur. Likaså kräver jämförelse mellan flera behandlingar separat djur. En bilaterala modell skulle eliminera Inter-individuella variationer och minska antalet djur som krävs för en studie32. Men bilaterala skador kan öka sjuklighet och bilaterala hälta kunde hindra behandling utvärdering. Ett fåtal studier kort rapportera användning av bilaterala knäskålssenan defekter i råttor men fokus på effekterna av behandlingar i stället för perioperativ hantering och sjuklighet av den modell33,34.
Denna studie långsiktiga mål är att utveckla en strategi för att förbättra stemness och i vivo överlevnad av UCM-MSCs avsett att prövningar transplantation. För att uppnå detta mål, har vi nyligen rapporterade förbättrad stemness av UCM-MSCs genom bildandet av spheroids på chitosan film och inkubering under hypoxiska miljö35. Dessa in vitro- egenskaper var associerade med förbättrade biomekaniska egenskaper av knäskålssenan defekter behandlas med luftkonditionerade UCM-MSCs. baserat på dessa resultat, råtta bilaterala knäskålssenan defekt modellen verkar lämplig att testa kandidaten behandlingar för sena skador36. Syftet med studien rapporterade här är att ge detaljerade protokoll för isolering och karakterisering av UCM-MSCs, utarbetandet av ett biologiska leveranssystem för stamceller, skapande och behandling av bilaterala patella senan defekter och postoperativ återhämtning och utvärdering av vävnad healing inom defekterna.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>PBS 10X</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30258.01</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type IA</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004197</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM low glucose</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30021.FS</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30910.03</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin 100X</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SV30010</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 0.25%</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30042.01</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Innovative Cell Technologies</td>
			<td>AT104</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SV30084.01</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chitosan</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3646</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8045</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30574.01</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round bottom polystyrene tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>149591A</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-horse CD44 (FITC)</td>
			<td>AbD serotec</td>
			<td>MCA1082F</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-rat CD90 (FITC)</td>
			<td>AbD serotec</td>
			<td>MCA47FT</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-horse MHC-II (FITC)</td>
			<td>AbD serotec</td>
			<td>MCA1085F</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG1 (FITC) - Isotype Control</td>
			<td>AbD serotec</td>
			<td>MCA928F</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal [SN6] to CD105 (FITC)</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab11415</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG1 (FITC) - Isotype Control</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab91356</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-human CD34 (FITC)</td>
			<td>BD</td>
			<td>BDB560942</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IdG1 kappa (FITC)</td>
			<td>BD</td>
			<td>BDB555748</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7-AAD</td>
			<td>BD</td>
			<td>BDB559925</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Accuri C6 Flow Cytometer</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacutainer 5ml</td>
			<td>Med Vet International</td>
			<td>RED5.0</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acid-citrate-dextrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3821</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5670</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sevoflurane</td>
			<td>JD Medical</td>
			<td>60307-320-25</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rats</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>Strain code: 400</td>
			<td>Experimental animal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat surgical kit</td>
			<td>Harvard apparatus</td>
			<td>728942</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Blade #15</td>
			<td>MEDLINE</td>
			<td>MDS15115</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat MD&#39;s Baytril (2 mg/Tablet), 
			Rimadyl (2 mg/Tablet)</td>
			<td>Bio Serv</td>
			<td>F06801</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyglactin 910, 5-0</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>J436G</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin alchol shandon</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>6766007</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harris Hematoxylin</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>143907</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of stem cell therapies in a bilateral patellar tendon injury model in rats

Regenerativ medicin ger romanen alternativ till villkor som utmanar traditionella behandlingar. Prevalens och sjuklighet av tendinopathy mellan arter, har kombinerat med begränsad helande egenskaper av denna vävnad, du uppmanas sökandet för cellulära behandlingar och drivs utvecklingen av experimentella modeller för att studera deras effekt. Navelsträngen matrix-derived mesenkymala stamceller (UCM-MSC) är tilltalande kandidater eftersom de är riklig, lätt att samla, kringgå de etiska farhågor och risk för teratoma bildning, ändå likna primitiva embryonala stamceller närmare än Adult vävnad-derived MSCs. betydande intresse har fokuserat på kitosan som en strategi för att förbättra egenskaperna för MSCs genom sfäroid bildas. Detta papper Detaljer tekniker att isolera UCM-MSCs förbereda spheroids på chitosan film och analysera effekten av sfäroid bildas på ytan markör uttryck. Därför beskrivs skapa en bilaterala knäskålssenan skada modell råttor för i vivo implantation av UCM-MSC spheroids bildas på chitosan film. Inga komplikationer observerades i studien avseende sjuklighet, betona stigande effekter eller vävnad infektion. Funktionella poängsumman av de opererade råttorna på 7 dagar var lägre än för normala råttor, men återgick till det normala inom 28 dagar efter operation. Histologiska noter av vävnad-healing bekräftat förekomsten av en propp i behandlade defekter utvärderade på 7 dagar, frånvaron av främmande kropp reaktion och framåt helande i 28 dagar. Denna bilaterala patella senan defekt modell var styr interindividuell variation via skapandet av en intern kontroll i varje råtta, associerade med acceptabel sjuklighet, och tillät detektering av skillnaderna mellan obehandlade senor och behandlingar.

I den aktuella studien presenteras resultat som genomsnitt ± SD (standardavvikelse). Cellerna var isolerade från navelsträngar av 6 ston, och andelen isolerade cellinjer som uttrycker varje cell surface markör under standard eller chitosan luftkonditionering jämfördes med en Friedman test, som en icke-parametrisk variansanalys med upprepade åtgärder. För senan defekt modellskapande, 8 råttor användes för 7 dagar efter operation bedömning och 12 råttor användes för 28 dagar...

Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Stem Cell Therapies in a Bilateral Patellar Tendon Injury Model in Rats at JoVE.com

Evaluation of Stem Cell Therapies in a Bilateral Patellar Tendon Injury Model in Rats

Utvärdering av stamceller terapier i bilaterala knäskålssenan skada modell hos råttor

Detta dokument beskriver utarbetande och utvärdering av navelsträngen matrix-derived mesenkymala stamceller spheroids med bilaterala knäskålssenan defekt modell i en råtta. Denna modell var var en godtagbar hälsoförsämring och hittade för att identifiera skillnader mellan obehandlade och behandlade senor, och mellan de två behandlingarna testas.

Regenerative medicine provides novel alternatives to conditions that challenge traditional treatments. The prevalence and morbidity of tendinopathy across ...

Research

JoVE Journal

Medicine

A Mouse Model of in Utero Transplantation

A Mouse Model of in Utero Transplantation

En musmodell av I livmodern Transplantation

The transplantation of stem cells and viruses in utero has tremendous potential for treating congenital disorders in the human fetus.  For example, in ...

A Contusion Model of Severe Spinal Cord Injury in Rats

En Contusion Modell av svår ryggmärgsskada hos råttor

The translational potential of novel treatments should be investigated in severe spinal cord injury (SCI) contusion models. A detailed methodology is ...

A Radio-telemetric System to Monitor Cardiovascular Function in Rats with Spinal Cord Transection and Embryonic Neural Stem Cell Grafts

En radio-telemetri system för att övervaka hjärtfunktionen hos råttor med ryggmärgstransection och embryonala Neural Stem Cell Transplantat

High thoracic or cervical spinal cord injury (SCI) can lead to cardiovascular dysfunction. To monitor cardiovascular parameters, we implanted a catheter ...

Neural Stem Cell Transplantation in Experimental Contusive Model of Spinal Cord Injury

Neural stamcellstransplantation i experimentell Contusive Modell av ryggmärgsskada

Spinal cord injury is a devastating clinical condition, characterized by a complex of neurological dysfunctions. Animal models of spinal cord injury can ...

Evaluation of the Efficacy of the H. pylori Protein HP-NAP as a Therapeutic Tool for Treatment of Bladder Cancer in an Orthotopic Murine Model

Evaluation of the Efficacy of the H. pylori Protein HP-NAP as a Therapeutic Tool for Treatment of Bladder Cancer in an Orthotopic Murine Model

Utvärdering av effektiviteten hos de<em&gt; H. pylori</em&gt; Protein HP-NAP som ett terapeutiskt verktyg för behandling av cancer i urinblåsan i en Orthotopic musmodell

Bladder cancer is one of the most common malignancies of the urogenital tract. Intravesical injection of Bacillus Calmette-Gu&#233;rin (BCG) is the gold ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Studera bukspottkörtelcancer Stem Cell egenskaper för att utveckla nya behandlingsstrategier

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

A Neonatal Mouse Spinal Cord Compression Injury Model

En neonatal mus ryggmärgskompression skada Modell

Spinal cord injury (SCI) typically causes devastating neurological deficits, particularly through damage to fibers descending from the brain to the spinal ...

Murine Flexor Tendon Injury and Repair Surgery

Murin Flexor senskada och reparation kirurgi

Tendon connects skeletal muscle and bone, facilitating movement of nearly the entire body. In the hand, flexor tendons (FTs) enable flexion of the fingers ...

Balloon-based Injury to Induce Myointimal Hyperplasia in the Mouse Abdominal Aorta

Ballong-baserade skada att inducera Myointimal hyperplasi i mus bukaorta

The use of animal models is essential for a better understanding of MH, one major cause for arterial stenosis.In this article, we demonstrate a murine ...

Evaluation of Coronary Flow Reserve After Myocardial Ischemia Reperfusion in Rats

Utvärdering av Koronarflödesreserv efter myokardischemi Refusion hos råttor

Coronary artery disease is the leading cause of death worldwide. After an acute myocardial infarction, early and successful myocardial intervention via ...