Name: functional imaging of viral transcription factories using 3d fluorescence microscopy
Uploaded: 2018-01-18T14:00:00
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이 연구는 미국의 암 사회 연구 학술 상 (RSG-13-383-MPC)와 건강의 국가 학회 교부 금 (R01-DE025985)에 의해 지원 되었다. 이 작품 또한 지원 되었다 미국 농 무부 (2015-67015-23268 및 2014-67015-21787) 및 캘리포니아 대학에서에서 새로운 연구 이니셔티브 부여에서 교부 금에 의해 데이비스.

주의:이 절차에 사용 된 셀 라인 전염 성 바이러스를 포함, 조심 하 고만 레벨 2 BSL 시설 이상 진행.
1. 세포 준비 및 유지 보수
<ol><li>문화 체육-K-RTA BCBL-1 셀 (또는 다른 KSHV 감염 PEL 셀 라인) 15% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 1% 페니실린 스 글루타민 솔루션 보충 RPMI1640 매체에.</li>
	<li>지속적으로 성장 하 고 2-4 일 마다 1: 4의 비율에 의해 셀을 분할 하려면 확인 하 고 5% 이산화탄소 ...

<ol>
	<li>de Laat, W., Grosveld, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Grosveld+Spatial+organization+of+gene+expression:+the+active+chromatin+hub.">Grosveld Spatial organization of gene expression: the active chromatin hub.</a> Chromosome Res. 11 (5), 447-459 (2003).</li><li>Misteli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+dynamics:+implications+for+nuclear+architecture+and+gene+expression.">Protein dynamics: implications for nuclear architecture and gene expression.</a> Science. 291 (5505), 843-847 (2001).</li><li>Bernardi, R., Pandolfi, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure,+dynamics+and+functions+of+promyelocytic+leukaemia+nuclear+bodies.">Structure, dynamics and functions of promyelocytic leukaemia nuclear bodies.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (12), 1006-1016 (2007).</li><li>Cioce, M., Lamond, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cajal+bodies:+a+long+history+of+discovery.">Cajal bodies: a long history of discovery.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 21, 105-131 (2005).</li><li>Boisvert, F. M., van Koningsbruggen, S., Navascues, J., Lamond, A. 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P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kaposi's+Sarcoma-Associated+Herpesvirus+Hijacks+RNA+Polymerase+II+To+Create+a+Viral+Transcriptional+Factory.">Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus Hijacks RNA Polymerase II To Create a Viral Transcriptional Factory.</a> J Virol. 91 (11), (2017).</li><li>Ganem, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KSHV+and+the+pathogenesis+of+Kaposi+sarcoma:+listening+to+human+biology+and+medicine.">KSHV and the pathogenesis of Kaposi sarcoma: listening to human biology and medicine.</a> J Clin Invest. 120 (4), 939-949 (2010).</li><li>Mesri, E. A., Cesarman, E., Boshoff, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kaposi's+sarcoma+and+its+associated+herpesvirus.">Kaposi's sarcoma and its associated herpesvirus.</a> Nat Rev Cancer. 10 (10), 707-719 (2010).</li><li>Campbell, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+arginine+methyltransferase+1-directed+methylation+of+Kaposi+sarcoma-associated+herpesvirus+latency-associated+nuclear+antigen.">Protein arginine methyltransferase 1-directed methylation of Kaposi sarcoma-associated herpesvirus latency-associated nuclear antigen.</a> J Biol Chem. 287 (8), 5806-5818 (2012).</li><li>Guito, J., Lukac, D. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myc+dynamically+and+preferentially+relocates+to+a+transcription+factory+occupied+by+Igh.">Myc dynamically and preferentially relocates to a transcription factory occupied by Igh.</a> PLoS Biol. 5 (8), 192 (2007).</li><li>Fanucchi, S., Shibayama, Y., Burd, S., Weinberg, M. S., Mhlanga, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+contact+permits+transcription+between+coregulated+genes.">Chromosomal contact permits transcription between coregulated genes.</a> Cell. 155 (3), 606-620 (2013).</li><li>Borah, S., Darricarrere, N., Darnell, A., Myoung, J., Steitz, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+viral+nuclear+noncoding+RNA+binds+re-localized+poly(A)+binding+protein+and+is+required+for+late+KSHV+gene+expression.">A viral nuclear noncoding RNA binds re-localized poly(A) binding protein and is required for late KSHV gene expression.</a> PLoS Pathog. 7 (10), 1002300 (2011).</li><li>Chang, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+demethylase+JMJD2A+regulates+Kaposi's+sarcoma-associated+herpesvirus+replication+and+is+targeted+by+a+viral+transcriptional+factor.">Histone demethylase JMJD2A regulates Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus replication and is targeted by a viral transcriptional factor.</a> J Virol. 85 (7), 3283-3293 (2011).</li><li>McAllister, S. C., Hansen, S. G., Messaoudi, I., Nikolich-Zugich, J., Moses, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+efficiency+of+phorbol+ester-induced+lytic+reactivation+of+Kaposi's+sarcoma-associated+herpesvirus+during+S+phase.">Increased efficiency of phorbol ester-induced lytic reactivation of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus during S phase.</a> J Virol. 79 (4), 2626-2630 (2005).</li><li>Miller, G., El-Guindy, A., Countryman, J., Ye, J., Gradoville, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lytic+cycle+switches+of+oncogenic+human+gammaherpesviruses.">Lytic cycle switches of oncogenic human gammaherpesviruses.</a> Adv Cancer Res. 97, 81-109 (2007).</li><li>Guito, J., Lukac, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KSHV+Rta+Promoter+Specification+and+Viral+Reactivation.">KSHV Rta Promoter Specification and Viral Reactivation.</a> Front Microbiol. 3, 30 (2012).</li></ol>

특이 한 상황에 맞게 변경 될 수 있는 프로토콜의 몇 가지 측면을 확인 하 고 있습니다. 고정 및 permeabilization 버퍼의 선택 또한 변경 될 수 있습니다. 고정 버퍼에 대 한 paraformaldehyde도 효과적 이며 에탄올 permeabilization 사용할 수 있습니다.
PBS는 것이 좋습니다 그것 포름알데히드 소 혈 청 알 부 민 (BSA)의 부재에 항 체를 사용 하지 않도록 설정 하지만 글리신 PBS 단계를 건너뛸 ?...

그것은 점점 더 분명 핵의 spatiotemporal 조직 진핵생물에서 정밀 하 게 조정 된 유전자 발현 조절에 중요 한 역할을 담당 하 게 되었다. 대부분 조직의 특정 유전자 많은 염색체를 통해 배포 됩니다 하 고 동기적으로 조정된 방식으로1특정 자극에 반응 하기 위하여 통제 될 필요가 있다. 셀 활성화 chromatin 허브 (ACH)을 함께 데리고의 유전자 및 그들의 cis 규정 구성 요소 특정 핵 공간1방법으로 생성 합니다.
그것은 또한 입증 되었습니다 다양 한 연구에 의해 그 핵 보이지만 매우 조밀 하 고 점성, 생물학적 활성 분자 통과할 수 핵 오히려 신속 하 게 보급2를 통해. 이 임시 속성 때문 대부분 DNA 의무적인 단백질 ' 점프 '를 그들의 길은 매우 적응 하 고 다양 한 핵2수 있는 핵 공간 느낌 사이트 바인딩 사이트 바인딩에서.
생체 내에서 핵의이 동적 동작에도 불구 하 고 핵 기관 막 없이 같은 (하지만에 국한 되지 않음) 핵소체 Cajal 몸과 promyelocytic 백혈병 핵 시체 (PML-NB) 여전히 존재. 그것은 탠덤 DNA 반복 (핵소체), rRNA (핵소체) 및 coilin (Cajal 몸) 또는 PML 등 구조 단백질 같은 메커니즘의 다양 한 통해 단백질 (PML-NB)는 이러한 구문을 함께3,4,5 . 이러한 구조와 전사 공장 등 다른 교회 역할 뿐만 아니라 필수 구성 요소의 현지 농도 증가 하지만 단백질 및 궁극적으로 만들 그들 내에서 핵 산의 구성 조절 건설 기계는 효율적인 세포 기능6중앙 사이트입니다.
머릿속으로 하는 핵 구조 형태 epigenetics 공부 하는 연구원에 게 풍부한 정보를 제공 언제, 어디. 바이러스학의 관점에서 KSHV, 같은 latently 감염된 바이러스의 재 활성화 크게 변경 핵의 풍경과 전사 세포 유전자에서 주로 바이러스 성 유전자, 궁극적으로 이동 핵 효소의 분포를 완전 한 기능 바이러스 자손7,8생산. KSHV는 바이러스 성 유전자 발현을 촉진 하기 위하여 세포 유전자 식 기계를 어떻게 조작 합니까? 이러한 정보에는 일시적인 세포 유전자 규제 메커니즘에 빛 창 고 수 있습니다.
다른 모든 herpesviruses KSHV는 용균성 복제 및 지연 시간 이라는 두 개의 라이프 사이클. KSHV는 주로 대기 시간 관련 유전자9,10를 제외 하 고는 대부분의 바이러스 성 유전자의 식 입 막 음, 대기 시간 단계에 상주 합니다. KSHV 생산 대기 시간 동안 대기 핵 항 원 (라 나), constitutively 바이러스 성 게놈을 결속 하 고 인간 염색체11에 바이러스 chromatin tethers 관련. 바이러스 성 게놈과 라 나의 친밀 한 관계 때문에 IFA와 DAPI를 사용 하 여 얼룩을 바이러스 성 episomes 호스트 chromatin 관계 했다 찾을 수 있다.
공부 하 고 단일 episome 수준과 감염 된 세포에 바이러스 성 다른 episomes와 협회에 KSHV 재 활성화, 적극적으로 베 끼 기 바이러스 chromatin에 제자리에 찾을 전략 설립 되었습니다. 따라서, 라 나 및 RNAPII IFA intron RNA-물고기와 결합 했다, KSHV K Rta는 주요 바이러스 성 단백질의 intron 지역 (정확한 프로브 시퀀스 이즈미 야 연구소의 최신 간행물8에서 찾을 수 있습니다)에 바인딩되는 RNA-물고기 프로브를 생성 하 여 필수 고 KSHV 다시 활성화-그것은 식별 가능한 충분 한 전사 찍고 실제로 어디 장소8,11,12,,1314,15 . 이 intron RNA-물고기 기술 연구원을 어디 mRNA 접합 이며 세포질16,17수출 직전 변하게 되는 시각화 수 있습니다.
KSHV phorbol 에스테 르 12-O-Tetradeconoyl-phorbol-13acetate (TPA) 등을 포함 한 다양 한 화학적 자극에 의해 활성화 될 수 있습니다 및 또한 KSHV 낙 산 염 나트륨 같은 히스톤 deacetylase 억제 물의 overexpression에 의해 활성화 유도 될 수 있다 바이러스 성 녹음 방송 인수, K-Rta19입니다. 연구원은 성공적으로 다시 활성화18유도 전에 셀의 사이클을 동기화 하 여 KSHV 재 활성화의 효율성 증가. 따라서, 이러한 특정 연구에 대 한 셀 더블 티 미 딘 블록 (아래에 설명 된 프로토콜)를 사용 하 여 및 짧은 시간에 대 한 TPA와 아목시실린과 (Dox) 알을 품을 동기화 했다. Doxycyline는 이러한 실험에 활용 셀 라인 doxycycline 유도할 수 있는 K-Rta 카세트 cDNA에서 복제 했다 하 고 K-Rta의 intron 지역에 포함 되지 않습니다 때문에 사용 되었다. 다시 활성화할 수 있지만 K-Rta 식 유도 KSHV 사용 하 여, 그것은 입증 된 다른 연구자는 다양 한 다른 생 화 확 적인 요인으로 인해 K-Rta 식 혼자 판명 미약한 재 자극20. 이들의 모두를 결합 하 여, 시간의 짧은 기간에 마약 외피를 제한 하 여 강력한 하지만 지나치게 인공 KSHV 재 이미징 달성 되었다.
라 나, RNAPII, 라벨링 후 K-Rta introns 그리고 DNA로이 문서에 설명 된, 3D 형광 이미징 widefield deconvolution 현미경을 사용 하 여 수행 되었다. 이미징 소프트웨어와 처리 후 활성 바이러스 episomes의 공간적 분포는 제대로 평가할 수 있습니다. 이 기술을 사용 하 여, 활성 chromatin 허브 및 다른 핵 구조 형성의 근본적인 성격에 관한 중앙 질문 공부 될 수 있다. 동일한 규제 요소를 처리 하는 단일 셀에 있는 동일한 바이러스 episomes spatiotemporal 유전자 규제 메커니즘의 이해를 깊게 하는 독특한 연구 도구를 나타낼 수 있습니다.
이미징 여러 세포 표본을 다른 시간 지점에서 고정 본질적으로 동적 분자 과정의 특성의 한계는 형광 분포에서 미묘한 또는 소규모 변화 감지 되지 않습니다 또는 하 찮은 것으로 간주. 희소 한 경우에 모든 세포 관찰 같은 미묘한 변화를 표시 하지 않는 한 이것은 사실 이다. 따라서, 활성 바이러스 성 전사 및 다른 핵 구조의 전체 spatiotemporal 관계 비판적으로 계산 해야 고정 된 이미지를 사용 하 여 합니다. 이러한 기술적 과제를 해결 하기 위해 가장 좋은 방법은 이미지 라이브 세포 바이러스 episomes을 표시 하 고 시간이 지남에 주요 세포질 효소의 위치에 따라입니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:572px;" width="573">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:216px;">RPMI medium 1650 GlutaMAX</td>
			<td style="width:71px;">Gibco by Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">61870-036</td>
			<td style="width:167px;">Needs to be warmed to 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:71px;">Omega Scientific Inc.</td>
			<td style="width:119px;">FB-11</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:216px;">Pen Strep Glutamine (100x)</td>
			<td style="width:71px;">Gibco by Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">10378-016</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Thymidine&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T9250</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:216px;">Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Solution</td>
			<td style="width:71px;">Gibco by Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">14190-144</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">TPA</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P1585</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Sodium Butyrate&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">B5887</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Formaldehyde Solution&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">252549</td>
			<td style="width:167px;">Corrosive, toxic, health hazard</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Diethyl Pyrocarbonate</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D-5758</td>
			<td style="width:167px;">Acute toxicity&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Glycine</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">410225</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Acetone</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">179124</td>
			<td style="width:167px;">Flammable, toxic</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Methanol</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Chemical&#160;</td>
			<td style="width:119px;">67-56-1</td>
			<td style="width:167px;">Flammable, toxic, health hazard</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Rat monoclonal antibody to KSHV/HHV-8 ORF73</td>
			<td style="width:71px;">Advanced Biotechnologies</td>
			<td style="width:119px;">13-210-100</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Anti-RNA Polymerase II Antibody clone CTD4H8</td>
			<td style="width:71px;">EMD Milipore</td>
			<td style="width:119px;">05-623</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Ribonucleic acid, transfer from baker&#8217;s yeast (S. cerevisiae)&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">9014-25-9</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Saline sodium citrate buffer 20x (SSC)</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td align="right" style="width:119px;">15557044</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Formamide&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">295876</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Omnipur Dextran Sulfate, 50% solution</td>
			<td style="width:71px;">EMD Milipore</td>
			<td style="width:119px;">1916C093</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">DAPI (4&#8217;,6-diamindino-2-phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:119px;">D1306</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">slowFade Gold antifade reagent</td>
			<td style="width:71px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">S36936</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Micro cover glass 22x22</td>
			<td style="width:71px;">Matsunami</td>
			<td style="width:119px;">C022221</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;">VoloCITY</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;">3D imaging software</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">DeltaVision microscope</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Superfrost/Plus microscope slides</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-550-15</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

functional imaging of viral transcription factories using 3d fluorescence microscopy

그것은 잘 알려진 유전자의 공간과 일시적인 규칙 경 세 적절 한 유전자 발현의 중요 한 부분입니다. 따라서, 어디 고 때 전사 일어나 핵 공간 내에서 이해 하 고 episomes 같은 세포의 핵 내에서 감염 사이 관계를 시각화 하기 위해 중요 한 아니다. 여기, 면역 형광 검사 (IFA)와 RNA-물고기 왔다 combinedto 식별 적극적으로 속기 Kaposi의 육 종 관련 herpesvirus (KSHV) episomes. KSHV 대기 시간 관련 핵 항 원 (라 나), 얼룩이 지기에 의해 바이러스 episomes는 핵 내에서 존재 하는 곳을 찾을 수입니다. 또한, 생산적인 감염 동안에 표시 됩니다, 바이러스 성 유전자의 intron 지역 대상으로 RNA-물고기 프로브를 설계 하 여 초기 RNA 사본 있을 수 있습니다. 이 조합의 분자 프로브를 사용 하 여, 큰 바이러스 성 녹음 방송 공장 조립 시각화 하 고 분석 KSHV 다시 활성화 하는 동안 바이러스 성 유전자 발현의 공간 규정 가능 하다. 포함 하 여 안티-RNA 중 합 효소 II 항 체 얼룩이 지기, 하나 또한 RNA 중 합 효소 II (RNAPII) 집계 및 재 활성화 하는 동안 KSHV 전사 사이 협회를 시각화할 수 있습니다.

BCBL-1 셀 사용 되 고 라 나와 K-Rta RNA (그림 1) 스테인드 했다 약간 요약된 프로토콜 수행 되었다. 이 실험 검사 바이러스 episomes 적극적으로 베 끼고는 및 셀의 인구에 KSHV 재 자극에 응답의이를 수 있습니다. 그림 1에서 화살표로 표시 된 셀에 밀접 하 게 일치 (로 표시 라 나) 바이러스 episomes의 분포 지역에 고유 K Rta 형광 KSHV 게놈 ...

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Functional Imaging of Viral Transcription Factories Using 3D Fluorescence Microscopy

바이러스 성 transcriptional 팩터리는 세포질 RNA 중 합 효소 II 다시 활성화 하는 동안 바이러스 성 유전자 전사를 증가 함께 풍성 하 게 이산 구조. 여기, 적극적으로 면역 형광 얼룩이 지 고 제자리에서 RNA 교 잡의 조합에 의해 3D 핵 공간에서 바이러스 성 염색 질을 속기의 사이트를 찾을 하는 방법을 설명 합니다.

기능 이미징 3D 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 바이러스 성 녹음 방송 공장

It is well known that spatial and temporal regulation of genes is an integral part of governing proper gene expression. Consequently, it is invaluable to ...

The overall goal of combining nascent RNA-FISH with amino staining of viral latent proteins is to visualize active transcription coupled to viral transcription factory formation. This method can be used to help answer key questions in the fields of genetics, cell biology, virology, and cell biology virology. The main advantage of this technique is it utilizes an inducible viral mini-chromosome model to study the molecular details behind genomic architectural alterations.Collect cells in a 1.5 milliliter micro-centrifuge tube. Centrifuge the cells for two minutes at 200 Volt gravity. Wash the cells three times with one milliliter of sterile DEPC PBS.Next, re-suspend the cells in 1.2 milliliters of DEPC PBS. Place the cover slips into the bottoms of a six-well plate. Pipette 200 microliters of the cell DEPC PBS mixture onto each cover slip.After the cells have settled for two minutes, aspirate excess DEPC PBS, leaving only a thin layer of cells. Carefully add one milliliter of fixing solution to each cover slip. Allow the cells to fix for 10 minutes.Wash the cover slips three times with DEPC PBS. After washing, carefully add one milliliter of glycine DEPC PBS to a final concentration of glycine of 100 millimolar to each cover slip. Allow the cells to quench for five minutes.Add 1.5 milliliters of DEPC PBS and place on a shaker for five minutes, and shake firmly but gently in hand for one minute. Aspirate the excess DEPC PBS and be careful not to disrupt the cells. Carefully add one milliliter of permeabilizing solution to each cover slip.Allow the cells to permeabilize for 15 minutes. Add 1.5 milliliters of DEPC PBS. Place the cells on a shaker for five minutes, and shake firmly but gently in hand for one minute.Aspirate the excess DEPC PBS and be careful not to disrupt the cells. Label the microscope slides, and moisten a paper towel then line the bottom of a sealable plastic container with the towel. Next, prepare the primary antibody solution and multiply the recipe for each cover slip present.Place 30 microliters of primary antibody solution onto each labeled microscope slide. Ensure the primary antibody concentration is correct by holding the corner of the cover slip and gently flicking it. Additionally, the corner of a tissue can be used to wick excess moisture.Then place the cover slip onto the labeled microscope slides, being careful not to introduce bubbles. Cover the exterior of the container with plastic wrap. Move the container into an incubator set to 37 degrees Celsius for one hour.During incubation, prepare the necessary reagents. After incubation, wash the cells three times with DEPC PBS in a six-well plate for five minutes each. Then, wash the cells with FISH wash buffer three times for five minutes each.And keep the cover slip in FISH wash buffer until the secondary antibody, an intron probe mixture has been prepared. Next, clean the glass slides for primary antibody incubation for hybridization with soapy water. After they're dry, clean them with ethanol and a lab tissue.Place 40 microliters of the secondary antibody and FISH intron probe with solution onto each glass slide. Place the cover slips with the cells onto the slides with the cells side facing down on top of the buffer. And be careful not to introduce bubbles.Place the slides into a plastic container with a moist paper towel on the bottom. Wrap the plastic container in first plastic wrap, and then aluminum foil. And incubate the container with the slides.After incubation, carefully slide the cover slip from the edge of the glass slide and place it back into six-well plates, facing up. Wash the cells with FISH wash buffer three times in a six-well plate for five minutes each. Next, wash the cells two times with two-fold SSC.Add DAPI at one to 1000 concentration into the two-fold SSC and allow the solution to sit for five minutes at room temperature. Wash the cells twice with two-fold SSC. Clean the glass slides used for hybridization and add 10 microliters of mounting solution onto the glass slides.Place the cover slips face down onto the mounting solution. With a laboratory tissue, gently remove the excess mounting solution, being careful not to squash the cells. Using nail polish, apply an ample layer around the edge of the cover slips and allow the polish to dry.The sample is now ready for fluorescence microscopy. BCBL-1 cells were stained for LANA and K-Rta RNA to examine where actively transcribing viral episomes are and the heterogeneity of response to Kaposi's Sarcoma-associated Herpesvirus, or KSHV reactivation stimuli. The distinct K-Rta fluorescence in regions that closely match the distribution of viral episomes is evidence for active transcription taking place close to KSHV genomes.In the same sample, cells can be observed which exhibit much weaker and diffuse K-Rta fluorescence that does not significantly overlap with LANA, illustrating the considerable variation and the degree of response to reactivation stimuli within a population of cells. Next, the effectiveness of thymidine synchronization was examined by visualizing the expression of viral protein which clearly demonstrated that synchronized cells responded more to the reactivation stimuli than the unsynchronized population. DAPI staining can serve several functions, this example clearly shows that there are three separate cells instead of one.3D microscopy alongside this technique revealed ring-like RNA PII structures seen with KSHV genomes dotted on the periphery. With its development, the mini viral chromosome would provide unique tools for researchers to explore the special temporal organization of gene-expression and the regression of the cell nucleus.

Research

JoVE Journal

Biology

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

siRNA Transfection 후의 유사 분열의 시간 저속 영상

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

연구

생물학

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

라이브 세포의 저장소로 작동하는 칼슘 항목의 형광 기반의 측정 : 교양 암 세포에서 골격근 섬유에

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

형광에 의한 바이러스성 RNA의 탐지<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드화 (물고기)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy

고급 3D 형광 현미경을 사용하여 자식 작용의 정량 분석

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, ...

Simultaneous Multicolor Imaging of Biological Structures with Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

신속한 분석 및 형광 현미경 이미지의 탐사

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

Implementing Patch Clamp and Live Fluorescence Microscopy to Monitor Functional Properties of Freshly Isolated PKD Epithelium

패치 클램프 및 라이브 형광 현미경을 구현 갓 고립 PKD 상피 세포의 기능적 특성을 모니터링하려면

Cyst initiation and expansion during polycystic kidney disease is a complex process characterized by abnormalities in tubular cell proliferation, luminal ...

Identification of Kinesin-1 Cargos Using Fluorescence Microscopy

형광 현미경을 사용 키네신 -1-화물 식별

Fluorescence microscopy is employed to identify Kinesin-1 cargos. Recently, the heavy chain of Kinesin-1 (KIF5B) was shown to transport the nuclear ...

Open Source High Content Analysis Utilizing Automated Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

자동 형광 수명 이미징 현미경을 활용하여 오픈 소스 높은 콘텐츠 분석

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions ...