Name: enrichment of bacterial lipoproteins and preparation of n-terminal lipopeptides for structural determination by mass spectrometry
Uploaded: 2018-05-21T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Enrichment of Bacterial Lipoproteins and Preparation of N-terminal Lipopeptides for Structural Determination by Mass Spectrometry at JoVE.com

وأيد البحث في مختبر ميريديث أموال بدء التشغيل المقدمة من "كلية العلوم ابيرلي" (جامعة ولاية بنسلفانيا). ونشكر الدكتور تاتيانا لاريموري على الخبراء تقديم المشورة التقنية والحصول على المعدات في بنسلفانيا الدولة البروتيوميات ووسائل قياس الطيف الكتلي الأساسية مرفق، جامعة بارك، السلطة الفلسطينية، حيث أجريت التحاليل والمطيافيه الجماعية.

1-النمو وتحلل الخلية
<ol><li>تنمو البكتيريا في 15 مل مرق الصويا تريبتيك (TSB) أو الوسائط الغنية مماثلة في أواخر المرحلة الأسية (OD600 من 1.0-1.5). حصاد الخلايا باستخدام الطرد المركزي، وتغسل مرة واحدة مع تريس مخزنة المالحة/يدتا (تبسي) وتواصل مع بروتوكول أو تجميد حتى الاستخدام. ملاحظة: تبسي: 20 مم ت?...

<ol>
	<li>Babu, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+database+of+bacterial+lipoproteins+(DOLOP)+with+functional+assignments+to+predicted+lipoproteins.">A database of bacterial lipoproteins (DOLOP) with functional assignments to predicted lipoproteins.</a> J Bacteriol. 188 (8), 2761-2773 (2006).</li><li>Narita, S., Tokuda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+lipoproteins;+biogenesis,+sorting+and+quality+control.">Bacterial lipoproteins; biogenesis, sorting and quality control.</a> Biochim Biophys Acta. 1862 (11), 1414-1423 (2016).</li><li>Kovacs-Simon, A., Titball, R. W., Michell, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipoproteins+of+bacterial+pathogens.">Lipoproteins of bacterial pathogens.</a> Infect Immun. 79 (2), 548-561 (2011).</li><li>Nguyen, M. T., G&#246;tz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipoproteins+of+Gram-Positive+Bacteria:+Key+Players+in+the+Immune+Response+and+Virulence.">Lipoproteins of Gram-Positive Bacteria: Key Players in the Immune Response and Virulence.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 80 (3), 891-903 (2016).</li><li>Nakayama, H., Kurokawa, K., Lee, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipoproteins+in+bacteria:+structures+and+biosynthetic+pathways.">Lipoproteins in bacteria: structures and biosynthetic pathways.</a> FEBS J. 279 (23), 4247-4268 (2012).</li><li>Kurokawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+bacterial+lipoprotein+structures+conserved+in+low-GC+content+Gram-positive+bacteria+are+recognized+by+Toll-like+receptor+2.">Novel bacterial lipoprotein structures conserved in low-GC content Gram-positive bacteria are recognized by Toll-like receptor 2.</a> J Biol Chem. 287 (16), 13170-13181 (2012).</li><li>Kurokawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Triacylated+ATP+Binding+Cluster+Transporter+Substrate-binding+Lipoprotein+of+Staphylococcus+aureus+Functions+as+a+Native+Ligand+for+Toll-like+Receptor+2.">The Triacylated ATP Binding Cluster Transporter Substrate-binding Lipoprotein of Staphylococcus aureus Functions as a Native Ligand for Toll-like Receptor 2.</a> J Biol Chem. 284 (13), 8406-8411 (2009).</li><li>Asanuma, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+evidence+of+&#945;-aminoacylated+lipoproteins+of+Staphylococcus+aureus.">Structural evidence of &#945;-aminoacylated lipoproteins of Staphylococcus aureus.</a> FEBS J. 278 (5), 716-728 (2011).</li><li>Armbruster, K. M., Meredith, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+Lyso-Form+N-Acyl+Intramolecular+Transferase+in+Low-GC+Firmicutes.">Identification of the Lyso-Form N-Acyl Intramolecular Transferase in Low-GC Firmicutes.</a> J Bacteriol. 199 (11), e00099-e00017 (2017).</li><li>Serebryakova, M. V., Demina, I. A., Galyamina, M. A., Kondratov, I. G., Ladygina, V. G., Govorun, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+acylation+state+of+surface+lipoproteins+of+Mollicute+Acholeplasma+laidlawii.">The acylation state of surface lipoproteins of Mollicute Acholeplasma laidlawii.</a> J Biol Chem. 286 (26), 22769-22776 (2011).</li><li>Feng, S. H., Lo, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+mouse+spleen+B-cell+proliferation+and+secretion+of+immunoglobulin+by+lipid-associated+membrane+proteins+of+Mycoplasma+fermentans+incognitus+and+Mycoplasma+penetrans.">Induced mouse spleen B-cell proliferation and secretion of immunoglobulin by lipid-associated membrane proteins of Mycoplasma fermentans incognitus and Mycoplasma penetrans.</a> Infect Immun. 62 (9), 3916-3921 (1994).</li><li>Feng, S. H., Lo, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+extract+of+Mycoplasma+penetrans+proteinase+K-digested+lipid-associated+membrane+proteins+rapidly+activates+NF-kappaB+and+activator+protein+1.">Lipid extract of Mycoplasma penetrans proteinase K-digested lipid-associated membrane proteins rapidly activates NF-kappaB and activator protein 1.</a> Infect Immun. 67 (6), 2951-2956 (1999).</li><li>Luque-Garcia, J. L., Zhou, G., Spellman, D. S., Sun, T. -. T., Neubert, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+electroblotted+proteins+by+mass+spectrometry:+protein+identification+after+Western+blotting.">Analysis of electroblotted proteins by mass spectrometry: protein identification after Western blotting.</a> Mol Cell Proteomics. 7 (2), 308-314 (2008).</li><li>Luque-Garcia, J. L., Zhou, G., Sun, T. -. T., Neubert, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Nitrocellulose+Membranes+for+Protein+Characterization+by+Matrix-Assisted+Laser+Desorption/Ionization+Mass+Spectrometry.">Use of Nitrocellulose Membranes for Protein Characterization by Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry.</a> Anal Chem. 78 (14), 5102-5108 (2006).</li><li>Kurokawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environment-mediated+accumulation+of+diacyl+lipoproteins+over+their+triacyl+counterparts+in+Staphylococcus+aureus.">Environment-mediated accumulation of diacyl lipoproteins over their triacyl counterparts in Staphylococcus aureus.</a> J Bacteriol. 194 (13), 3299-3306 (2012).</li><li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4.">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li><li>Sch&#1235;gger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tricine-SDS-PAGE.">Tricine-SDS-PAGE.</a> Nat Protoc. 1, 16-22 (2006).</li><li>Gravel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Blotting+by+the+Semidry+Method.">Protein Blotting by the Semidry Method.</a> The Protein Protocols Handbook. , 321-334 (2002).</li><li>Webster, J., Oxley, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Identification+by+Peptide+Mass+Fingerprinting+using+MALDI-TOF+Mass+Spectrometry.">Protein Identification by Peptide Mass Fingerprinting using MALDI-TOF Mass Spectrometry.</a> The Protein Protocols Handbook. , 1117-1129 (2009).</li><li>Wilkins, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detailed+peptide+characterization+using+PEPTIDEMASS+-+a+World-Wide-Web-accessible+tool.">Detailed peptide characterization using PEPTIDEMASS - a World-Wide-Web-accessible tool.</a> Electrophoresis. 18 (3-4), 403-408 (1997).</li><li>Gasteiger, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Identification+and+Analysis+Tools+on+the+ExPASy+Server.">Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server.</a> The Proteomics Protocols Handbook. , 571-607 (2005).</li><li>Perkins, D. N., Pappin, D. J. C., Creasy, D. M., Cottrell, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probability-based+protein+identification+by+searching+sequence+databases+using+mass+spectrometry+data.">Probability-based protein identification by searching sequence databases using mass spectrometry data.</a> Electrophoresis. 20 (18), 3551-3567 (1999).</li><li>Al-Saad, K. A., Zabrouskov, V., Siems, W. F., Knowles, N. R., Hannan, R. M., Hill, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix-assisted+laser+desorption/ionization+time-of-flight+mass+spectrometry+of+lipids:+ionization+and+prompt+fragmentation+patterns.">Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry of lipids: ionization and prompt fragmentation patterns.</a> Rapid Commun Mass Spectrom. 17 (1), 87-96 (2003).</li></ol>

البروتوكول هنا يصف اثنان مراحل متميزة لتوصيف البروتين الدهني: الإثراء بتكساس-114 المرحلة تحديد التقسيم والهيكلية باستخدام TOF مرض التصلب العصبي المتعدد. أثناء استخراج TX-114، يزيل الطرد المركزي الإضافية تلويث البروتينات التي تتسبب في أثناء هذه العملية، تليها الأسيتون هطول الأمطار لإنتاج الب...

البكتيرية من البروتينات الدهنية تتميز حفظت الطرفي ن تعديل المادة الدهنية سيستين أن المراسي المجال بروتين كروي على سطح غشاء الخلية. وتوزع عالمياً في البكتيريا، والتي تشكل 2 إلى 5 في المائة من جميع الجينات الخلوية داخل جينوم نموذجية1. البروتينات الدهنية تلعب أدواراً حاسمة في مجموعة واسعة من العمليات الخلوية، بما في ذلك امتصاص المغذيات، توصيل الإشارة، الجمعية من البروتين المجمعات، وفي الحفاظ على الخلية المغلف السلامة الهيكلية2. البكتيريا المسببة للأمراض، والبروتينات الدهنية بمثابة عوامل الفوعة3،4. خلال عدوى، الاعتراف ليبوبيبتيديس الطرفي ن بعدد القتلى مثل مستقبلات (TLR) 2 تحرض استجابة مناعية فطرية لإزالة مسببات الأمراض الغازية. البروتينات الدهنية اعتماداً على الطرفي ن الدولة أسيليشن، والمعترف بها عموما بالمجمعات هيتيروديميريك TLR2 البديل. تسلم TLR2-TLR1 ليبوبيبتيديس أسيلاتيد ن، بينما يربط TLR2 TLR6 ليبوبيبتيدي حرة α الأمينية تيرميني. مرة ملزمة، تتلاقى مسارات إرسال الإشارات للحث على إفراز السيتوكينات proinflammatory3،4.
أنه كان يعتقد في السابق أن البروتينات الدهنية من البكتيريا إيجابية كانت دياسيلاتيد وتلك من البكتيريا سلبية الغرام كانت ترياسيلاتيد، متباينة في غياب أو وجود حمض الدهنية مرتبطة أميد على بقايا سيستين الطرفي ن مصانة. وأيد هذا الافتراض عدم وجود تسلسل أورثولوجس في جينومات إيجابية لخاصة، ترانسفيراز اشيل ن الغرام التي تشكل البروتينات الدهنية ترياسيلاتيد5. ومع ذلك، فقد كشفت الدراسات الأخيرة ترياسيليشن البروتين الدهني في Firmicutes إيجابية أن نقص خاصة، فضلا عن ثلاثة رواية الطرفي ن بروتين دهني الهياكل، ووصف بيبتيديل و lyso ن-أسيتيل أشكال6،7 ،8. هذه الاستنتاجات تثير تساؤلات بشأن الأشكال المحتملة بعد اكتشاف بروتين دهني، جنبا إلى جنب مع أسئلة أساسية حول كيفية إجراء هذه الرواية من البروتينات الدهنية وما الغرض الفسيولوجية أو ميزة نقل الأشكال المختلفة. وعلاوة على ذلك، أنها تبين بوضوح عجز الجينوم الحالية للتنبؤ ببنية البروتين الدهني. وفي الواقع، حددنا مؤخرا فئة رواية من البروتين الدهني ن-اشيل ترانسفيراسيس، تسمى يره، من فايكاليس البرازية و العصوية الشمعية التي تجعل من النموذج lyso البروتينات الدهنية9. وهذا يشير إلى ضرورة التحقق تجريبيا من هيكل البروتين الدهني، الذي يمكن أن تكون صعبة بسبب طبيعتها الغاية مسعور ومحدودية الأساليب المتاحة لتميز بنيتها الجزيئية.
لتسهيل الدراسات على بروتين دهني تحريض الاستجابة المناعية المضيفة، فضلا عن التصميم الهيكلي الطرفي ن، أننا قد تكيفت العديد من البروتوكولات المذكورة سابقا من أجل تنقية البروتينات الدهنية البكتيرية وإعداد تريبتيك N-المحطة ليبوبيبتيديس للتحليل باستخدام TOF MS6،10،،من1112. يتم إثراء البروتينات الدهنية باستخدام مرحلة X-114 تريتون (يشار إليه من الآن فصاعدا بالفاعل أو TX-114) أنشئت تقسيم الأسلوب الأمثل إزالة تلويث غير البروتينات الدهنية وزيادة غلة بروتين دهني. هذه البروتينات الدهنية مناسبة للاستخدام المباشر في فحوصات TLR أو لتنقية المزيد من الحزب الديمقراطي الصربي صفحة. TOF استخدام مرض التصلب العصبي المتعدد، يوفر نقل البروتينات الدهنية غشاء النيتروسليلوز سقالة للكفاءة في الموقع الهضم التربسين، غسل وشطف اللاحقة من سطح الغشاء، مما أدى إلى حد كبير تنقية ليبوبيبتيديس الطرفي ن. لقد ثبت النيتروسليلوز لتسهيل معالجة العينة وتحسين التغطية تسلسل للغاية مسعور الببتيدات من الغشاء لا يتجزأ البروتينات13،14، فضلا عن البروتينات الدهنية9،10 . يحتوي الأسلوب على ميزة إضافية لتجزئة الببتيدات استناداً إلى قطبية، حيث أن الحلول المتوسطة يغسل يمكن تحليلها لتحديد ثقة عالية البروتين في نفس الوقت مع التصميم الهيكلي الطرفي ن في تجربة واحدة . هذا البروتوكول فريد ميزات المتعمد الصوديوم adduct تكوين الرامية إلى تجزئة أيون الأصل نحو ديهيدروالانيل الأيونات خلال MS/MS، تساعد في تعيين الهيكلية للدولة-أسيليشن ن. ن-المحطة هو ميزة أكثر من متغير والرئيسية المتصلة باعتراف TLR البروتينات الدهنية. أخذت معا، سمح هذا البروتوكول دراسات مكثفة واستنساخه في البروتينات الدهنية، مع المراحل الفردية لتنقية والتصميم الهيكلي قبل استخدام TOF MS بسهولة تكييفها تبعاً للهدف العام لهذه التجربة.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.01 mm Zirconia/silica beads</td>
			<td>BioSpec Products</td>
			<td>110791012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>EMD</td>
			<td>AX0073-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>EMD</td>
			<td>AX0116-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>EMD</td>
			<td>AX0142-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Fluka Analytical</td>
			<td>09830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioTrace NT Nitrocellulose</td>
			<td>PALL Life Sciences</td>
			<td>66485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA) digest standard</td>
			<td>Protea</td>
			<td>PS-204-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>423550025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC Grade water</td>
			<td>EMD</td>
			<td>WX0008-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP535-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethyl sulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce trypsin protease</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>90057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ponceau S</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>161470100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein LoBind Tube 0.5mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022431064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>792519</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Macron Fine Chemicals</td>
			<td>7581-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid (TFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>299537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-hydrochloride (HCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-114</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>93422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic soy broth (TSB)</td>
			<td>BD</td>
			<td>211822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-cyano-4-hydroxycinnamic acid (MS Grade)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8982</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagNALyser</td>
			<td>Roche</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot Turbo Transfer System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MALDI-TOF target</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultraflextreme MALDI-TOF-TOF</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td></td>
			<td>Equipped with a 355 nm frequency-tripled Nd:YAG smartbeam-II laser</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enrichment of bacterial lipoproteins and preparation of n-terminal lipopeptides for structural determination by mass spectrometry

البروتينات الدهنية هي مكونات هامة في المغلف الخلية البكتيرية والمنشطات القوية للاستجابة المناعية الفطرية الثدييات. على الرغم من أهميتها لخلية علم وظائف الأعضاء وعلم المناعة، ما زال يمكن اكتشافها حول أشكال البروتين الدهني الرواية، وكيف أنها يتم تصنيعه وتأثير مختلف أشكال على الحصانة المضيف. لتمكين دراسات مستفيضة عن البروتينات الدهنية، يصف هذا البروتوكول وسيلة للإثراء بروتين دهني البكتيرية وإعداد ليبوبيبتيديس تريبتيك الطرفي ن للتصميم الهيكلي بالليزر ساعد مصفوفة الامتزاز التأين-وقت الرحلة الطيف الكتلي (TOF استخدام MS). التوسع في مرحلة X-114 تريتون المنشأة تقسيم أسلوب لاستخراج البروتين الدهني والإثراء من غشاء الخلية البكتيرية، يتضمن البروتوكول خطوات إضافية لإزالة الملوثات غير البروتين الدهني، زيادة إنتاج البروتين الدهني و النقاء. منذ البروتينات الدهنية تستخدم عادة في فحوصات مثل عدد القتلى مستقبلات (TLR)، من المهم أولاً وصف الهيكل الطرفي ن باستخدام TOF السيدة هيرين، يقدم أسلوب عزل الببتيدات مسعور تتركز المخصب الطرفي ن تنقل إلى غشاء النيتروسليلوز ليبوبيبتيديس مناسبة للتحليل المباشر باستخدام TOF MS/السيدة "البروتينات الدهنية" التي فصلت بالصوديوم دوديسيل كبريتات بولي اكريلاميد "هلام استشراد" (الحزب الديمقراطي الصربي صفحة)، وهضمها في الموقع مع التربسين، التتابع غسلها لإزالة الببتيدات تريبتيك القطبية، وأخيراً التيد مع كلوروفورم-الميثانول. عندما يقترن مع مرض التصلب العصبي المتعدد من الببتيدات تريبسينيزيد القطبية أكثر من الحلول الغسيل، هذا الأسلوب يوفر القدرة على التعرف بروتين دهني وتميز ن نهايته في تجربة واحدة. الصوديوم المتعمد adduct تكوين يمكن أن تستخدم أيضا كأداة لتعزيز أكثر تجزئة المعلومات هيكلياً الأطياف. في نهاية المطاف، سوف تسمح الإثراء من البروتينات الدهنية وتحديد هياكلها الطرفي ن دراسات مستفيضة أكثر في هذه الفئة في كل مكان من البروتينات البكتيرية.

ويرد في الشكل 1تخطيطي للبروتوكول. ويبين الشكل 2الكسر بروتين دهني عالي التخصيب المستخرج من فايكاليس البرازية ATCC 19433 بتكساس-114. للمقارنة، وربط نمط الكسر البروتين سرع يرد أيضا. وتأكدت البروتينات من هذا الكسر باستخدام--مايكروسوفت أن تكون ?...

Watch this Scientific Journal Video about Enrichment of Bacterial Lipoproteins and Preparation of N-terminal Lipopeptides for Structural Determination by Mass Spectrometry at JoVE.com

Enrichment of Bacterial Lipoproteins and Preparation of N-terminal Lipopeptides for Structural Determination by Mass Spectrometry

الإثراء من البروتينات الدهنية البكتيرية وإعداد ليبوبيبتيديس الطرفي ن للتصميم الهيكلي بالطيف الكتلي

ويرد في إثراء البكتيرية البروتينات الدهنية باستخدام مرحلة السطح غير الأيونية تقسيم الأسلوب للاستخدام المباشر في فحوصات TLR أو التطبيقات الأخرى. ترد تفاصيل اتخاذ مزيد من الخطوات لإعداد ليبوبيبتيديس تريبتيك الطرفي ن لتوصيف الهيكلية بالطيف الكتلي.

Lipoproteins are important constituents of the bacterial cell envelope and potent activators of the mammalian innate immune response. Despite their ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Invasion of Human Cells by a Bacterial Pathogen

غزو ​​الخلايا البشرية من قبل الممرض الجرثومي

Here we will describe how we study the invasion of human endothelial cells by bacterial pathogen Staphylococcus aureus . The general protocol can be ...

Structure of HIV-1 Capsid Assemblies by Cryo-electron Microscopy and Iterative Helical Real-space Reconstruction

هيكل HIV - 1 بواسطة جمعيات قفيصة البرد المجهر الإلكتروني وتكرارية حلزوني الإعمار الحقيقي الفضاء

Cryo-electron microscopy (cryo-EM), combined with image processing, is an increasingly powerful tool for structure determination of macromolecular protein ...

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

اللعاب، الغدد اللعابية، وجمع اللمف الدموي من القراد اللبود الكتفي

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne ...

Discovery of New Intracellular Pathogens by Amoebal Coculture and Amoebal Enrichment Approaches

اكتشاف جديد بين الخلايا مسببات الأمراض عن طريق Amoebal Coculture والمناهج Amoebal التخصيب

Intracellular pathogens such as legionella, mycobacteria and Chlamydia-like organisms are difficult to isolate because they often grow poorly or not at ...

Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

التعرف السريع على البكتيريا سالبة الجرام من ثقافة الدم في مرق عن طريق MALDI-TOF الطيف الكتلي

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional ...

Preparation of a Blood Culture Pellet for Rapid Bacterial Identification and Antibiotic Susceptibility Testing

إعداد ثقافة بيليه الدم الجرثومي السريع لتحديد واختبار حساسية المضادات الحيوية

Bloodstream infections and sepsis are a major cause of morbidity and mortality. The successful outcome of patients suffering from bacteremia depends on a ...

Electroporation of Functional Bacterial Effectors into Mammalian Cells

Electroporation للمن المستجيبات البكتيرية وظيفية في خلايا الثدييات

The study of protein interactions in the context of living cells can generate critical information about localization, dynamics, and interacting partners. ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

جيل ومتعدد المظهري فحص عالية المحتوى من<em&gt; الكوكسيلا البورنيتية</em&gt; المسوخ ينقول

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Alternative In Vitro Methods for the Determination of Viral Capsid Structural Integrity

Alternative In Vitro Methods for the Determination of Viral Capsid Structural Integrity

أساليب بديلة في المختبر لتحديد السلامة الهيكلية قفيصه الفيروسية

Human norovirus exacts considerable public health and economic losses worldwide. Emerging in vitro cultivation advances are not yet applicable for routine ...

Identification of Nucleolar Factors During HIV-1 Replication Through Rev Immunoprecipitation and Mass Spectrometry

تحديد العوامل النيوكليولار أثناء النسخ المتماثل لفيروس نقص المناعة البشرية-1 من خلال الترسيب المناعي القس والقياس الطيفي الكتلي

The HIV-1 infectious cycle requires viral protein interactions with host factors to facilitate viral replication, packaging, and release. The infectious ...