Name: enrichment of bacterial lipoproteins and preparation of n-terminal lipopeptides for structural determination by mass spectrometry
Uploaded: 2018-05-21T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Enrichment of Bacterial Lipoproteins and Preparation of N-terminal Lipopeptides for Structural Determination by Mass Spectrometry at JoVE.com

Onderzoek in het laboratorium van Meredith werd gesteund door opstarten middelen die door de Eberly College of Science (Pennsylvania State University). Wij danken Dr. Tatiana Laremore voor deskundig technisch advies en toegang tot de apparatuur op de Penn State Proteomics en massaspectrometrie Core faciliteit, University Park, PA, waar de massaspectrometrische analyses werden uitgevoerd.

1. groei en Lysis van de cel
<ol><li>Groeien bacteriën in 15 mL al soja broth (TSB) of soortgelijke rijke media tot laat-exponentiële groeifase (OD600 van 1.0-1.5). Oogsten van cellen door middel van centrifugeren, een keer wassen met Tris-gebufferde zoutoplossing/EDTA (TBSE) en blijven met protocol of bevriezen tot gebruik. Opmerking: TBSE: 20 mM Tris-waterstofchloride (HCl), pH 8,0 130 mM natriumchloride (NaCl), en 5 mM ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA)). Lipoproteïne expressie en wi...

<ol>
	<li>Babu, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+database+of+bacterial+lipoproteins+(DOLOP)+with+functional+assignments+to+predicted+lipoproteins.">A database of bacterial lipoproteins (DOLOP) with functional assignments to predicted lipoproteins.</a> J Bacteriol. 188 (8), 2761-2773 (2006).</li><li>Narita, S., Tokuda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+lipoproteins;+biogenesis,+sorting+and+quality+control.">Bacterial lipoproteins; biogenesis, sorting and quality control.</a> Biochim Biophys Acta. 1862 (11), 1414-1423 (2016).</li><li>Kovacs-Simon, A., Titball, R. W., Michell, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipoproteins+of+bacterial+pathogens.">Lipoproteins of bacterial pathogens.</a> Infect Immun. 79 (2), 548-561 (2011).</li><li>Nguyen, M. T., G&#246;tz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipoproteins+of+Gram-Positive+Bacteria:+Key+Players+in+the+Immune+Response+and+Virulence.">Lipoproteins of Gram-Positive Bacteria: Key Players in the Immune Response and Virulence.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 80 (3), 891-903 (2016).</li><li>Nakayama, H., Kurokawa, K., Lee, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipoproteins+in+bacteria:+structures+and+biosynthetic+pathways.">Lipoproteins in bacteria: structures and biosynthetic pathways.</a> FEBS J. 279 (23), 4247-4268 (2012).</li><li>Kurokawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+bacterial+lipoprotein+structures+conserved+in+low-GC+content+Gram-positive+bacteria+are+recognized+by+Toll-like+receptor+2.">Novel bacterial lipoprotein structures conserved in low-GC content Gram-positive bacteria are recognized by Toll-like receptor 2.</a> J Biol Chem. 287 (16), 13170-13181 (2012).</li><li>Kurokawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Triacylated+ATP+Binding+Cluster+Transporter+Substrate-binding+Lipoprotein+of+Staphylococcus+aureus+Functions+as+a+Native+Ligand+for+Toll-like+Receptor+2.">The Triacylated ATP Binding Cluster Transporter Substrate-binding Lipoprotein of Staphylococcus aureus Functions as a Native Ligand for Toll-like Receptor 2.</a> J Biol Chem. 284 (13), 8406-8411 (2009).</li><li>Asanuma, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+evidence+of+&#945;-aminoacylated+lipoproteins+of+Staphylococcus+aureus.">Structural evidence of &#945;-aminoacylated lipoproteins of Staphylococcus aureus.</a> FEBS J. 278 (5), 716-728 (2011).</li><li>Armbruster, K. M., Meredith, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+Lyso-Form+N-Acyl+Intramolecular+Transferase+in+Low-GC+Firmicutes.">Identification of the Lyso-Form N-Acyl Intramolecular Transferase in Low-GC Firmicutes.</a> J Bacteriol. 199 (11), e00099-e00017 (2017).</li><li>Serebryakova, M. V., Demina, I. A., Galyamina, M. A., Kondratov, I. G., Ladygina, V. G., Govorun, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+acylation+state+of+surface+lipoproteins+of+Mollicute+Acholeplasma+laidlawii.">The acylation state of surface lipoproteins of Mollicute Acholeplasma laidlawii.</a> J Biol Chem. 286 (26), 22769-22776 (2011).</li><li>Feng, S. H., Lo, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+mouse+spleen+B-cell+proliferation+and+secretion+of+immunoglobulin+by+lipid-associated+membrane+proteins+of+Mycoplasma+fermentans+incognitus+and+Mycoplasma+penetrans.">Induced mouse spleen B-cell proliferation and secretion of immunoglobulin by lipid-associated membrane proteins of Mycoplasma fermentans incognitus and Mycoplasma penetrans.</a> Infect Immun. 62 (9), 3916-3921 (1994).</li><li>Feng, S. H., Lo, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+extract+of+Mycoplasma+penetrans+proteinase+K-digested+lipid-associated+membrane+proteins+rapidly+activates+NF-kappaB+and+activator+protein+1.">Lipid extract of Mycoplasma penetrans proteinase K-digested lipid-associated membrane proteins rapidly activates NF-kappaB and activator protein 1.</a> Infect Immun. 67 (6), 2951-2956 (1999).</li><li>Luque-Garcia, J. L., Zhou, G., Spellman, D. S., Sun, T. -. T., Neubert, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+electroblotted+proteins+by+mass+spectrometry:+protein+identification+after+Western+blotting.">Analysis of electroblotted proteins by mass spectrometry: protein identification after Western blotting.</a> Mol Cell Proteomics. 7 (2), 308-314 (2008).</li><li>Luque-Garcia, J. L., Zhou, G., Sun, T. -. T., Neubert, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Nitrocellulose+Membranes+for+Protein+Characterization+by+Matrix-Assisted+Laser+Desorption/Ionization+Mass+Spectrometry.">Use of Nitrocellulose Membranes for Protein Characterization by Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry.</a> Anal Chem. 78 (14), 5102-5108 (2006).</li><li>Kurokawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environment-mediated+accumulation+of+diacyl+lipoproteins+over+their+triacyl+counterparts+in+Staphylococcus+aureus.">Environment-mediated accumulation of diacyl lipoproteins over their triacyl counterparts in Staphylococcus aureus.</a> J Bacteriol. 194 (13), 3299-3306 (2012).</li><li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4.">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li><li>Sch&#1235;gger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tricine-SDS-PAGE.">Tricine-SDS-PAGE.</a> Nat Protoc. 1, 16-22 (2006).</li><li>Gravel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Blotting+by+the+Semidry+Method.">Protein Blotting by the Semidry Method.</a> The Protein Protocols Handbook. , 321-334 (2002).</li><li>Webster, J., Oxley, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Identification+by+Peptide+Mass+Fingerprinting+using+MALDI-TOF+Mass+Spectrometry.">Protein Identification by Peptide Mass Fingerprinting using MALDI-TOF Mass Spectrometry.</a> The Protein Protocols Handbook. , 1117-1129 (2009).</li><li>Wilkins, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detailed+peptide+characterization+using+PEPTIDEMASS+-+a+World-Wide-Web-accessible+tool.">Detailed peptide characterization using PEPTIDEMASS - a World-Wide-Web-accessible tool.</a> Electrophoresis. 18 (3-4), 403-408 (1997).</li><li>Gasteiger, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Identification+and+Analysis+Tools+on+the+ExPASy+Server.">Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server.</a> The Proteomics Protocols Handbook. , 571-607 (2005).</li><li>Perkins, D. N., Pappin, D. J. C., Creasy, D. M., Cottrell, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probability-based+protein+identification+by+searching+sequence+databases+using+mass+spectrometry+data.">Probability-based protein identification by searching sequence databases using mass spectrometry data.</a> Electrophoresis. 20 (18), 3551-3567 (1999).</li><li>Al-Saad, K. A., Zabrouskov, V., Siems, W. F., Knowles, N. R., Hannan, R. M., Hill, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix-assisted+laser+desorption/ionization+time-of-flight+mass+spectrometry+of+lipids:+ionization+and+prompt+fragmentation+patterns.">Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry of lipids: ionization and prompt fragmentation patterns.</a> Rapid Commun Mass Spectrom. 17 (1), 87-96 (2003).</li></ol>

Het protocol hierin beschrijft twee verschillende fasen van de karakterisering van het lipoproteïne: verrijking door TX-114 fase partitionering en structurele bepaling door MALDI-TOF MS. Tijdens de extractie van de TX-114 verwijdert extra centrifugeren contaminerende eiwitten die tijdens dit proces precipiteren, gevolgd door aceton neerslag hoogverrijkt lipoproteïnen opleveren. Door de omvang van elk preparaat aan 15 mL waarde van cellen te beperken, kunnen verschillende monsters worden gemakkelijk verwerkt parallel en...

Lipoproteins van de bacteriële worden gekenmerkt door een geconserveerde N-terminale lipide gemodificeerde cysteïne die ankers van het domein van de bolvormige eiwit op het oppervlak van de celmembraan. Ze zijn universeel verspreid in bacteriën, die 2 tot 5% van alle cellulaire genen binnen een typisch genoom1. Lipoproteins van de spelen een kritieke rol in een grote verscheidenheid van cellulaire processen, waaronder de opname van de voedingsstoffen, signaaltransductie, vergadering van eiwitcomplexen, en ter handhaving cel envelop structurele integriteit2. Pathogene bacteriën dienen lipoproteïnen als virulentie factoren3,4. Erkenning van N-terminal lipopeptides door Toll-like receptor (TLR) 2 aanzet tijdens een infectie, een aangeboren immune reactie op het verwijderen van de invasie ziekteverwekkers. Afhankelijk van de N-terminale acylering staat, zijn de lipoproteïnen algemeen erkend door alternatieve TLR2 heterodimeric complexen. TLR2-TLR1 herkent N-GEACYLEERDE lipopeptides, terwijl TLR2-TLR6 bindt gratis lipopeptide α-amino termini. Eenmaal gebonden, samenkomen de signaalroutes om te induceren secretie van proinflammatoire cytokines3,4.
Eerder werd gedacht dat lipoproteins van gram-positieve bacteriën waren diacylated en die van gram-negatieve bacteriën triacylated, die verschillen in de afwezigheid of de aanwezigheid van een vetzuur amide-linked op het geconserveerde N-terminale cysteine residu. Deze veronderstelling werd gesteund door het ontbreken van reeks orthologs in gram-positieve genoom te Lnt, de gram-negatieve N-acyl-transferase die triacylated lipoproteïnen5vormt. Echter, recente studies is gebleken dat lipoproteïne triacylation in gram-positieve Firmicutes die ontbreken lnt, evenals drie nieuwe N-terminale lipoproteïne structuren, genoemd de peptide, lyso en N -acetyl vormen6,7 ,8. Deze bevindingen stellen vragen over mogelijk nog-te-worden-ontdekt lipoproteïne vormen, naast het fundamentele vragen over de manier waarop deze roman lipoproteins worden gemaakt en welke fysiologische doel of voordeel de verschillende vormen geven. Bovendien tonen zij duidelijk aan het huidige onvermogen van de genomica te voorspellen lipoproteïne structuur. Inderdaad, we onlangs geïdentificeerd een nieuwe klasse van lipoproteïne N-acyl enzym, genaamd Lit, van Enterococcus faecalis en Bacillus cereus , dat lyso-formulier lipoproteïnen9 maakt. Dit wijst op de noodzaak om het experimenteel verifiëren lipoproteïne structuur, die uitdagend vanwege hun zeer hydrofobe aard en de beperkte methoden beschikbaar worden kan voor het karakteriseren van hun moleculaire structuur.
Ter vergemakkelijking van studies over lipoproteïne inductie van de immuunrespons van de gastheer, alsook de structurele vaststelling van N-terminale, hebben we verschillende eerder beschreven protocollen om te zuiveren lipoproteins van de bacteriële en de voorbereiding van de N-terminale al aangepast lipopeptides voor analyse door MALDI-TOF MS6,10,11,12. Lipoproteïnen zijn verrijkt met behulp van een gevestigde Triton X-114 (voortaan aangeduid als oppervlakteactieve stof of TX-114) fase partitioneren methode, met optimalisatie lipoproteïne opbrengst te verwijderen van contaminerende niet-lipoproteïnen. Deze lipoproteins zijn geschikt voor direct gebruik in TLR testen of voor verdere zuivering door SDS-PAGE. Voor MALDI-TOF MS, overdracht van de lipoproteïnen aan het membraan van het nitrocellulose voorziet een steiger efficiënt in situ de spijsvertering van de trypsine, wassen en latere elutie van het oppervlak van de membraan, resulterend in sterk gezuiverd N-terminal lipopeptides. Nitrocellulose is aangetoond dat het oog op het hanteren van de steekproef en verbetering van de reeks dekking voor zeer hydrofobe peptides van integraal membraan eiwitten13,14, evenals lipoproteïnen9,10 . De methode heeft als extra voordeel van peptiden op basis van polariteit, zodat de tussenliggende wassen oplossingen kunnen worden geanalyseerd voor hoge vertrouwen eiwit identificatie gelijktijdig met N-terminale structurele bepaling in een enkele experiment . Dit protocol een unieke functies opzettelijke natrium adduct vorming te bevorderen van bovenliggende ion fragmentatie naar dehydroalanyl ionen tijdens MS/MS, helpend in structurele toewijzing van de N- acylering staat. De N-terminus is zowel de meest variabele en belangrijke functie gerelateerde TLR erkenning van lipoproteïnen. Tezamen, hebben dit protocol intensieve en reproduceerbare studies op lipoproteïnen, met de afzonderlijke fasen van zuivering en bepaling van de structurele door MALDI-TOF MS gemakkelijk aangepast afhankelijk van het algemene doel van het experiment.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.01 mm Zirconia/silica beads</td>
			<td>BioSpec Products</td>
			<td>110791012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>EMD</td>
			<td>AX0073-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>EMD</td>
			<td>AX0116-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>EMD</td>
			<td>AX0142-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Fluka Analytical</td>
			<td>09830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioTrace NT Nitrocellulose</td>
			<td>PALL Life Sciences</td>
			<td>66485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA) digest standard</td>
			<td>Protea</td>
			<td>PS-204-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>423550025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC Grade water</td>
			<td>EMD</td>
			<td>WX0008-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP535-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethyl sulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce trypsin protease</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>90057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ponceau S</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>161470100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein LoBind Tube 0.5mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022431064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>792519</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Macron Fine Chemicals</td>
			<td>7581-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid (TFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>299537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-hydrochloride (HCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-114</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>93422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic soy broth (TSB)</td>
			<td>BD</td>
			<td>211822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-cyano-4-hydroxycinnamic acid (MS Grade)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8982</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagNALyser</td>
			<td>Roche</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot Turbo Transfer System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MALDI-TOF target</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultraflextreme MALDI-TOF-TOF</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td></td>
			<td>Equipped with a 355 nm frequency-tripled Nd:YAG smartbeam-II laser</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enrichment of bacterial lipoproteins and preparation of n-terminal lipopeptides for structural determination by mass spectrometry

Lipoproteïnen zijn belangrijke bestanddelen van de bacteriële celenvelop en krachtige activators van de zoogdieren aangeboren immuunrespons. Ondanks hun belang voor zowel celfysiologie en immunologie, moet nog veel worden ontdekt over roman lipoproteïne formulieren, hoe ze worden gesynthetiseerd en het effect van de verschillende vormen op de immuniteit van de gastheer. Opdat de grondige studies over lipoproteïnen, dit protocol beschrijft een methode voor bacteriële lipoproteïne verrijking en voorbereiding van N-terminale al lipopeptides voor structurele bepaling door laser matrix-bijgewoonde desorptie ionisatie-tijd van de vlucht massaspectrometrie (MALDI-TOF MS). Uitbreiding op een gevestigde Triton X-114 fase partitioneren methode voor lipoproteïne winning en de verrijking van de bacteriële cel membraan, het protocol bevat aanvullende stappen om te verwijderen van niet-lipoproteïne contaminanten, lipoproteïne rendement verhogen en zuiverheid. Aangezien lipoproteïnen worden vaak gebruikt in Toll-like receptor (TLR) testen, is het essentieel om eerst het karakteriseren van de structuur van de N-terminal door MALDI-TOF MS. Herein, een methode is bedoeld om te isoleren van geconcentreerde hydrofobe peptiden verrijkt met N-terminal lipopeptides geschikt voor een directe analyse door Lipoproteins van de MALDI-TOF-MS/MS. die zijn gescheiden door Poly-Acrylamide gelelektroforese (SDS-pagina) voor natrium Dodecyl Sulfaat worden overgedragen aan een membraan van het nitrocellulose, verteerd in situ met Trypsine, opeenvolgend gewassen om te verwijderen van polar al peptiden, en ten slotte met chloroform-methanol geëlueerd. Wanneer gekoppeld aan MS van de meer polar trypsinized peptiden van wassen oplossingen, biedt deze methode de mogelijkheid om zowel het lipoproteïne te identificeren en te karakteriseren zijn N-terminus in een enkele experiment. Opzettelijke natrium adduct vorming kan ook worden gebruikt als een instrument ter bevordering van meer structureel informatieve fragmentatie spectra. Uiteindelijk, verrijking van lipoproteins en bepaling van hun structuren van N-terminale toestaat meer uitgebreide studies op deze alomtegenwoordige klasse van bacteriële eiwitten.

Een schematische voorstelling van het protocol wordt gegeven in Figuur 1. Het lipoproteïne-verrijkt breuk Enterococcus faecalis ATCC 19433 onttrokken door TX-114 is afgebeeld in Figuur 2. Ter vergelijking: de banding patroon van de neergeslagen eiwitoplossing blijkt ook. Eiwitten uit dit gedeelte werden bevestigd door MALDI-MS te zijn zeer overvloedig besmetten van eiwitten dan lipoproteïnen (tabel 1)....

Watch this Scientific Journal Video about Enrichment of Bacterial Lipoproteins and Preparation of N-terminal Lipopeptides for Structural Determination by Mass Spectrometry at JoVE.com

Enrichment of Bacterial Lipoproteins and Preparation of N-terminal Lipopeptides for Structural Determination by Mass Spectrometry

Verrijking van Lipoproteins van de bacteriële en de bereiding van N-terminal Lipopeptides voor structurele bepaling door massaspectrometrie

De verrijking van bacteriële lipoproteins met behulp van een fase van de niet-ionogene oppervlakteactieve stof partitioneren methode wordt beschreven voor direct gebruik in TLR testen of andere toepassingen. Verdere stappen zijn gedetailleerd voor te bereiden al lipopeptides van N-terminale structurele karakterisering door massaspectrometrie.

Lipoproteins are important constituents of the bacterial cell envelope and potent activators of the mammalian innate immune response. Despite their ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Invasion of Human Cells by a Bacterial Pathogen

Invasie van menselijke cellen door een bacteriële pathogenen

Here we will describe how we study the invasion of human endothelial cells by bacterial pathogen Staphylococcus aureus . The general protocol can be ...

Structure of HIV-1 Capsid Assemblies by Cryo-electron Microscopy and Iterative Helical Real-space Reconstruction

Structuur van HIV-1 capside Assemblies van cryo-elektronenmicroscopie en iteratief Helical Real-ruimte Wederopbouw

Cryo-electron microscopy (cryo-EM), combined with image processing, is an increasingly powerful tool for structure determination of macromolecular protein ...

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Speeksel, speekselklieren en hemolymfe Collectie van Ixodes scapularis Teken

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne ...

Discovery of New Intracellular Pathogens by Amoebal Coculture and Amoebal Enrichment Approaches

Ontdekking van nieuwe intracellulaire pathogenen door Amoebal Coculture en Amoebal Verrijking benaderingen

Intracellular pathogens such as legionella, mycobacteria and Chlamydia-like organisms are difficult to isolate because they often grow poorly or not at ...

Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

Snelle identificatie van Gram-negatieve bacteriën van Blood Culture Bouillon Met behulp van MALDI-TOF massaspectrometrie

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional ...

Preparation of a Blood Culture Pellet for Rapid Bacterial Identification and Antibiotic Susceptibility Testing

Voorbereiding van een Bloed Cultuur Pellet voor snelle identificatie van bacteriën en antibiotica gevoeligheid testen

Bloodstream infections and sepsis are a major cause of morbidity and mortality. The successful outcome of patients suffering from bacteremia depends on a ...

Electroporation of Functional Bacterial Effectors into Mammalian Cells

Elektroporatie van functionele bacteriële effectoren in zoogdiercellen

The study of protein interactions in the context of living cells can generate critical information about localization, dynamics, and interacting partners. ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generatie en Multi-fenotypische High-inhoud Screening van<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Transposon Mutants

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Alternative In Vitro Methods for the Determination of Viral Capsid Structural Integrity

Alternative In Vitro Methods for the Determination of Viral Capsid Structural Integrity

Alternatieve In Vitro methoden voor de bepaling van de structurele integriteit van virale Eiwitmantel

Human norovirus exacts considerable public health and economic losses worldwide. Emerging in vitro cultivation advances are not yet applicable for routine ...

Identification of Nucleolar Factors During HIV-1 Replication Through Rev Immunoprecipitation and Mass Spectrometry

Identificatie van Nucleollaire factoren tijdens de HIV-1-replicatie via Rev-immunoprecipitatie en massaspectrometrie

The HIV-1 infectious cycle requires viral protein interactions with host factors to facilitate viral replication, packaging, and release. The infectious ...