Name: enrichment of bacterial lipoproteins and preparation of n-terminal lipopeptides for structural determination by mass spectrometry
Uploaded: 2018-05-21T12:30:00
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메러디스 랩에서 연구 비 과학 대학 (펜실베니아 주립 대학)에서 제공 하는 시작 기금에 의해 지원 되었다. 우리는 전문적인 기술 조언과 펜 스테이트 Proteomics와 질량 분석 핵심 시설, 대학 공원, PA, 대량 spectrometric 분석 수행 된 장비에 대 한 액세스에 대 한 박사 타 Laremore 감사 합니다.

1. 세포 성장 및 세포
<ol><li>후반 지 수 단계 (OD600 1.0-1.5의) 15 mL tryptic 간장 국물 (TSB) 또는 유사한 리치 미디어에 박테리아를 성장. 원심 분리에 의해 세포를 수확, Tris 버퍼 식 염 수/EDTA (: TBSE)로 한 번 씻어 프로토콜을 계속 하거나 사용까지 동결. 참고:: TBSE: 20 mM Tris-염 산 (HCl), pH 8.0, 130 m m 염화 나트륨 (NaCl), 그리고 5 mM ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA)). 단백 식 수정 성장 조건 (예: ?...

<ol>
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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+extract+of+Mycoplasma+penetrans+proteinase+K-digested+lipid-associated+membrane+proteins+rapidly+activates+NF-kappaB+and+activator+protein+1.">Lipid extract of Mycoplasma penetrans proteinase K-digested lipid-associated membrane proteins rapidly activates NF-kappaB and activator protein 1.</a> Infect Immun. 67 (6), 2951-2956 (1999).</li><li>Luque-Garcia, J. L., Zhou, G., Spellman, D. S., Sun, T. -. T., Neubert, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+electroblotted+proteins+by+mass+spectrometry:+protein+identification+after+Western+blotting.">Analysis of electroblotted proteins by mass spectrometry: protein identification after Western blotting.</a> Mol Cell Proteomics. 7 (2), 308-314 (2008).</li><li>Luque-Garcia, J. 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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probability-based+protein+identification+by+searching+sequence+databases+using+mass+spectrometry+data.">Probability-based protein identification by searching sequence databases using mass spectrometry data.</a> Electrophoresis. 20 (18), 3551-3567 (1999).</li><li>Al-Saad, K. A., Zabrouskov, V., Siems, W. F., Knowles, N. R., Hannan, R. M., Hill, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix-assisted+laser+desorption/ionization+time-of-flight+mass+spectrometry+of+lipids:+ionization+and+prompt+fragmentation+patterns.">Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry of lipids: ionization and prompt fragmentation patterns.</a> Rapid Commun Mass Spectrom. 17 (1), 87-96 (2003).</li></ol>

지 단백질 특성의 2 단계로 여기 프로토콜에 설명 합니다: TX-114에 의해 농축 단계 MALDI TOF MS에 의해 분할 및 구조 결정. TX-114 추출 하는 동안 추가 원심 아세톤 강수량 수익률 높은 농축된 단백질 이어서이 과정 침전 오염 단백질을 제거 합니다. 셀의 15 mL 가치에 각 준비의 규모를 제한 하 여 몇 가지 샘플 수 쉽게 병렬로 처리 되며 원하는 경우, 프로토콜의 끝에 풀링된.
MS 구조 ...

세균성 단백질을 보존된 N 맨끝 지질 수정 시스테인 그 앵커 세포 막 표면에 구형 단백질 도메인 특징입니다. 그들은 보편적으로 박테리아에 일반적인 게놈1내의 모든 세포질 유전자의 2 ~ 5%를 구성 배포 됩니다. 지 단백질 등 양분 통풍 관, 신호 변환 세포질 과정의 광범위 한에 중요 한 역할 단백질 복합물의 및 유지 세포 봉투 구조적 무결성2. 병원 성 박테리아, 단백질 독성 요인3,4로 제공합니다. 감염, 동안 N 맨끝 lipopeptides 수용 체 통행세 같이 (TLR) 2에 의해의 인식 incites 침입 병원 체를 제거 하는 타고 난 면역 반응. N 맨끝 acylation 상태에 따라 단백질 대체 TLR2 heterodimeric 복합물에 의해 일반적으로 인식 된다. TLR2 TLR1 TLR2 TLR6 바인딩 무료 lipopeptide α-아미노 termini 동안 N-acylated lipopeptides를 인식합니다. 한 번 바운드, 신호 경로 proinflammatory cytokines3,4의 분 비를 유도 하기 위해 수렴.
그것은 이전 줄 알았는데 그 그람 양성 박테리아에서 단백질 diacylated 및 그램 음성 박테리아에서 보존된 N 맨끝 시스테인 잔류물에는 아 미드 연결 지방산의 존재 또는 부재에 다른 triacylated를 했다. 이 가정은 Lnt, 형성 하는 triacylated 단백질5그람 음성 N acyl 전이 효소를 그람 양성 게놈에서 순서 orthologs의 부족에 의해 지원 되었다. 그러나, 최근 연구 3 소설 N 맨끝 단백 구조, peptidyl, lyso와 N-아 세 틸 형태6,7 뿐 아니라 단백 triacylation 그람 양성 Firmicutes 그 부족 lnt에 계시 했다 ,8. 이러한 결과 소설 단백질이 어떻게 만들어에 대 한 근본적인 질문 어떤 생리 적 목적이 나 장점은 다양 한 형태의 얻으며 함께 가능한 아직---발견 지 형태에 대 한 질문을 제기. 또한, 그들은 명확 하 게 지 단백질 구조 예측 유전체학의 현재 무 능력을 보여 줍니다. 실제로, 우리는 최근 단백 N acyl transferases, Lit, Enterococcus faecalis 균 cereus 만드는 lyso 형태의 지 단백질9에서 라는의 소설 클래스 식별. 이 매우 소수 성 성격 및 특성을 그들의 분자 구조를 사용할 수 있는 제한 된 방법 때문에 도전적 일 수 있다 지 단백질 구조를 실험적으로 확인 하는 필요를 나타냅니다.
우리 세균 단백질을 순화 하 고 N-터미널 tryptic 준비 몇 가지 이전에 설명한 프로토콜 호스트 면역 반응 뿐만 아니라 N-터미널 구조 결정의 단백 유도 대 한 연구를 촉진 하기 위하여 적응 MALDI TOF MS6,10,,1112에 의해 분석을 위해 lipopeptides. 지 단백질 오염 비 단백질을 제거 하 고 단백 수확량을 증가 하는 최적화 메서드를 분할 설립된 트리톤 X-114 (이제부터 계면 활성 제 또는 TX-114 참조) 단계를 사용 하 여 농축입니다. 이러한 단백질은 SDS 페이지 더 정화 또는 TLR 분석 실험에 직접 사용 하기 위해 적합 합니다. MALDI TOF ms, 니트로 막에는 단백질의 양도 비 계 트립 신 소화 효율적인 현장에 대 한 세척, 하며 매우 인 멤브레인 표면에서 후속 차입 정화 N 맨끝 lipopeptides. 니트로 샘플 처리를 용이 하 게 하 고 완전 한 막 단백질13,14, 지 단백질9,10에서 높은 소수 성 펩 티 드에 대 한 시퀀스 범위를 향상을 보여줘 왔다 . 메서드는 중간 세척 솔루션은 단일 실험에서 N-터미널 구조 결심과 동시에 높은 자신감 단백질 식별을 위해 분석 될 수 있다 그래야 펩 티 드, 극성에 따라 분별의 추가 이점이 있다 . 이 프로토콜 고유 기능 의도적인 나트륨 adduct MS/MS, N-acylation 상태의 구조 지정에 은닉 하는 동안 dehydroalanyl 이온으로 부모 이온 조각화를 홍보 하는 대형. N-말단은 모두 가장 변수 및 주요 기능 단백질의 TLR 인식에 관련 된. 함께 찍은,이 프로토콜 정화 및 TOF MALDI MS 실험의 전반적인 목표에 따라 쉽게 적응 하 여 구조 결정의 각 단계와, 지 단백질에 집중 하 고 재현할 수 연구를 허용 했다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.01 mm Zirconia/silica beads</td>
			<td>BioSpec Products</td>
			<td>110791012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>EMD</td>
			<td>AX0073-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>EMD</td>
			<td>AX0116-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>EMD</td>
			<td>AX0142-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Fluka Analytical</td>
			<td>09830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioTrace NT Nitrocellulose</td>
			<td>PALL Life Sciences</td>
			<td>66485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA) digest standard</td>
			<td>Protea</td>
			<td>PS-204-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>423550025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC Grade water</td>
			<td>EMD</td>
			<td>WX0008-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP535-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethyl sulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce trypsin protease</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>90057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ponceau S</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>161470100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein LoBind Tube 0.5mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022431064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>792519</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Macron Fine Chemicals</td>
			<td>7581-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid (TFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>299537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-hydrochloride (HCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-114</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>93422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic soy broth (TSB)</td>
			<td>BD</td>
			<td>211822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-cyano-4-hydroxycinnamic acid (MS Grade)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8982</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagNALyser</td>
			<td>Roche</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot Turbo Transfer System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MALDI-TOF target</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultraflextreme MALDI-TOF-TOF</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td></td>
			<td>Equipped with a 355 nm frequency-tripled Nd:YAG smartbeam-II laser</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enrichment of bacterial lipoproteins and preparation of n-terminal lipopeptides for structural determination by mass spectrometry

지 단백질 세균성 세포 봉투의 중요 한 성분 이며 포유류 타고 난 면역 반응의 강력한 활성 제입니다. 세포 생리학과 면역학에 그들의 중요성에도 불구 하 고 많은 소설 지, 어떻게 그들은 합성은, 양식과 호스트 면역에 다양 한 형태의 효과 대 한 발견 되 고 남아 있다. 지 단백질에 대 한 철저 한 연구를 활성화 하려면이 프로토콜 세균 단백 농축 하는 방법에 설명 합니다 및 매트릭스 지원 레이저에 의하여 구조 결심에 대 한 N 맨끝 tryptic lipopeptides의 준비 desorption 이온화 시간의 비행 질량 분석기 (MALDI TOF MS)입니다. 단백 추출 및 세균성 세포 막에서 농축 방법 분할 설립된 트리톤 X-114 단계에 확대, 프로토콜 단백 수확량 증가 비 지 오염 물질을 제거 하기 위한 추가 단계를 포함 하 고 순도입니다. 먼저 MALDI TOF 양 여기에 의해 N-터미널 구조 특성에 중요 한 단백질은 수용 체 통행세 같이 (TLR) 분석 실험 일반적으로 사용 됩니다, 이후, 메서드 N 맨끝에 농축 하는 집중된 소수 성 펩 티 드를 분리 하 여 lipopeptides 나트륨 라우릴 황산 염 폴 리 아크릴 아 미드 젤 전기 이동 법 (SDS 페이지)에 의해 분리 된 TOF MALDI MS/양 지 단백질에 의해 직접 분석에 적합 니트로 막 전송 현장에 와 소화 트립 신, 순차적으로 북극 tryptic 펩 티 드, 제거 하기 위하여 세척 그리고 클로 프롬-메탄올을 가진 마지막으로 eluted. 세척 솔루션에서 더 극 trypsinized 펩 티 드의 MS와 결합,이 메서드는 둘 다 식별 하는 단백 단일 실험에서의 N-말단의 특성 기능을 제공 합니다. 의도적인 나트륨 adduct 형성 더 구조적으로 유익한 조각화 스펙트럼을 홍보 하는 도구로 채택 될 수 있다. 궁극적으로, 단백질의 농축 및 그들의 N 맨끝 구조의 세균성 단백질의이 유비 쿼터 스 클래스에 더 광범위 한 연구 수 있도록 합니다.

프로토콜의 회로도 그림 1에 제공 됩니다. TX-114 Enterococcus faecalis ATCC 19433에서에서 추출한 단백 농축 분수는 그림 2에 표시 됩니다. 비교를 위해 침전 된 단백질 분수의 밴딩 패턴도 표시 됩니다. 이 분수에서 단백질은 MALDI MS는 매우 풍부한 단백질 (표 1) 이외의 단백질 오염 수에 의해 확인 되었다. <strong class="x...

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Enrichment of Bacterial Lipoproteins and Preparation of N-terminal Lipopeptides for Structural Determination by Mass Spectrometry

세균성 단백질 질량 분석에 의하여 구조 결심에 대 한 N 맨끝 Lipopeptides의 준비의 농축

비 이온 계면 활성 제 단계 분할 메서드를 사용 하 여 세균성 단백질의 농축 TLR 분석 실험에 직접 사용 또는 다른 응용 프로그램에 대 한 설명 합니다. 추가 단계 구조 특성에 대 한 N 맨끝 tryptic lipopeptides를 준비 하는 질량 분석에 의해 자세히 나와 있습니다.

Lipoproteins are important constituents of the bacterial cell envelope and potent activators of the mammalian innate immune response. Despite their ...

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대체 체 외에 바이러스 성 Capsid 구조적 무결성의 결정에 대 한 방법

Human norovirus exacts considerable public health and economic losses worldwide. Emerging in vitro cultivation advances are not yet applicable for routine ...

Identification of Nucleolar Factors During HIV-1 Replication Through Rev Immunoprecipitation and Mass Spectrometry

레브 면역 침전 및 질량 분광법을 통한 HIV-1 복제 중 핵균 요인 식별

The HIV-1 infectious cycle requires viral protein interactions with host factors to facilitate viral replication, packaging, and release. The infectious ...