Name: enrichment of bacterial lipoproteins and preparation of n-terminal lipopeptides for structural determination by mass spectrometry
Uploaded: 2018-05-21T12:30:00
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Pesquisa no laboratório de Meredith foi apoiada por fundos de inicialização fornecidos pela faculdade Eberly da ciência (Pennsylvania State University). Agradecemos o Dr. Tatiana Laremore para aconselhamento técnico e acesso aos equipamentos da proteômica do estado de Penn e massa espectrometria Core Facility, University Park, PA, onde realizaram-se análises de espectrometria de massa.

1. crescimento e Lysis da pilha
<ol><li>Cresce bactérias em 15 mL de caldo de tryptic soy (TSB) ou mídia similar ao final da fase exponencial (OD600 de 1.0-1.5). Colheita de células por centrifugação, lave uma vez com solução tampão salino/EDTA (TBSE) e continuar com protocolo ou congelar até o uso. Nota: TBSE: 20 mM Tris-cloridrato (HCl), pH 8.0, 130 mM de cloreto de sódio (NaCl) e 5 mM de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)). Modificação e expressão de lipoproteína podem ser influenci...

<ol>
	<li>Babu, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+database+of+bacterial+lipoproteins+(DOLOP)+with+functional+assignments+to+predicted+lipoproteins.">A database of bacterial lipoproteins (DOLOP) with functional assignments to predicted lipoproteins.</a> J Bacteriol. 188 (8), 2761-2773 (2006).</li><li>Narita, S., Tokuda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+lipoproteins;+biogenesis,+sorting+and+quality+control.">Bacterial lipoproteins; biogenesis, sorting and quality control.</a> Biochim Biophys Acta. 1862 (11), 1414-1423 (2016).</li><li>Kovacs-Simon, A., Titball, R. W., Michell, S. 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M., Meredith, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+Lyso-Form+N-Acyl+Intramolecular+Transferase+in+Low-GC+Firmicutes.">Identification of the Lyso-Form N-Acyl Intramolecular Transferase in Low-GC Firmicutes.</a> J Bacteriol. 199 (11), e00099-e00017 (2017).</li><li>Serebryakova, M. V., Demina, I. A., Galyamina, M. A., Kondratov, I. G., Ladygina, V. G., Govorun, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+acylation+state+of+surface+lipoproteins+of+Mollicute+Acholeplasma+laidlawii.">The acylation state of surface lipoproteins of Mollicute Acholeplasma laidlawii.</a> J Biol Chem. 286 (26), 22769-22776 (2011).</li><li>Feng, S. H., Lo, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+mouse+spleen+B-cell+proliferation+and+secretion+of+immunoglobulin+by+lipid-associated+membrane+proteins+of+Mycoplasma+fermentans+incognitus+and+Mycoplasma+penetrans.">Induced mouse spleen B-cell proliferation and secretion of immunoglobulin by lipid-associated membrane proteins of Mycoplasma fermentans incognitus and Mycoplasma penetrans.</a> Infect Immun. 62 (9), 3916-3921 (1994).</li><li>Feng, S. H., Lo, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+extract+of+Mycoplasma+penetrans+proteinase+K-digested+lipid-associated+membrane+proteins+rapidly+activates+NF-kappaB+and+activator+protein+1.">Lipid extract of Mycoplasma penetrans proteinase K-digested lipid-associated membrane proteins rapidly activates NF-kappaB and activator protein 1.</a> Infect Immun. 67 (6), 2951-2956 (1999).</li><li>Luque-Garcia, J. L., Zhou, G., Spellman, D. S., Sun, T. -. T., Neubert, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+electroblotted+proteins+by+mass+spectrometry:+protein+identification+after+Western+blotting.">Analysis of electroblotted proteins by mass spectrometry: protein identification after Western blotting.</a> Mol Cell Proteomics. 7 (2), 308-314 (2008).</li><li>Luque-Garcia, J. L., Zhou, G., Sun, T. -. T., Neubert, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Nitrocellulose+Membranes+for+Protein+Characterization+by+Matrix-Assisted+Laser+Desorption/Ionization+Mass+Spectrometry.">Use of Nitrocellulose Membranes for Protein Characterization by Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry.</a> Anal Chem. 78 (14), 5102-5108 (2006).</li><li>Kurokawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environment-mediated+accumulation+of+diacyl+lipoproteins+over+their+triacyl+counterparts+in+Staphylococcus+aureus.">Environment-mediated accumulation of diacyl lipoproteins over their triacyl counterparts in Staphylococcus aureus.</a> J Bacteriol. 194 (13), 3299-3306 (2012).</li><li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4.">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li><li>Sch&#1235;gger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tricine-SDS-PAGE.">Tricine-SDS-PAGE.</a> Nat Protoc. 1, 16-22 (2006).</li><li>Gravel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Blotting+by+the+Semidry+Method.">Protein Blotting by the Semidry Method.</a> The Protein Protocols Handbook. , 321-334 (2002).</li><li>Webster, J., Oxley, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Identification+by+Peptide+Mass+Fingerprinting+using+MALDI-TOF+Mass+Spectrometry.">Protein Identification by Peptide Mass Fingerprinting using MALDI-TOF Mass Spectrometry.</a> The Protein Protocols Handbook. , 1117-1129 (2009).</li><li>Wilkins, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detailed+peptide+characterization+using+PEPTIDEMASS+-+a+World-Wide-Web-accessible+tool.">Detailed peptide characterization using PEPTIDEMASS - a World-Wide-Web-accessible tool.</a> Electrophoresis. 18 (3-4), 403-408 (1997).</li><li>Gasteiger, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Identification+and+Analysis+Tools+on+the+ExPASy+Server.">Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server.</a> The Proteomics Protocols Handbook. , 571-607 (2005).</li><li>Perkins, D. N., Pappin, D. J. C., Creasy, D. M., Cottrell, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probability-based+protein+identification+by+searching+sequence+databases+using+mass+spectrometry+data.">Probability-based protein identification by searching sequence databases using mass spectrometry data.</a> Electrophoresis. 20 (18), 3551-3567 (1999).</li><li>Al-Saad, K. A., Zabrouskov, V., Siems, W. F., Knowles, N. R., Hannan, R. M., Hill, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix-assisted+laser+desorption/ionization+time-of-flight+mass+spectrometry+of+lipids:+ionization+and+prompt+fragmentation+patterns.">Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry of lipids: ionization and prompt fragmentation patterns.</a> Rapid Commun Mass Spectrom. 17 (1), 87-96 (2003).</li></ol>

O protocolo neste documento descreve dois estágios distintos de caracterização de lipoproteína: determinação estrutural e particionamento por MALDI-TOF MS de fase de enriquecimento por TX-114. Durante a extração de TX-114, centrifugação adicional remove proteínas contaminantes que precipitar durante este processo, seguido por precipitação de acetona para produzir altamente enriquecido de lipoproteínas. Limitando-se a escala de cada preparação para 15 mL no valor de células, várias amostras podem ser fac...

Lipoproteínas bacterianas são caracterizadas por uma cisteína conservada de lipídios-modificado N-terminal que ancora o domínio de proteínas globulares na superfície da membrana celular. Eles são universalmente distribuídos em bactérias, constituindo 2 a 5% de todos os genes celulares dentro de um genoma típico1. Lipoproteínas desempenham um papel crítico em uma ampla variedade de processos celulares, incluindo a absorção de nutrientes, transdução de sinal, montagem de complexos de proteínas, bem como na manutenção celular envelope integridade estrutural2. Em bactérias patogênicas, lipoproteínas servem como fatores de virulência3,4. Durante uma infecção, o reconhecimento do N-terminal lipopeptides pelos receptores do tipo Toll (TLR) 2 incita a uma resposta imune inata para remover patógenos invasores. Dependendo do estado de acilação do N-terminal, lipoproteínas são geralmente reconhecidas pelo alternativo TLR2 heterodimérica complexos. TLR2-TLR1 reconhece lipopeptides N-acylated, enquanto TLR2-TLR6 liga livre lipopeptide α-amino termini. Uma vez acoplado, as vias de sinalização convergem para induzir a secreção de proinflammatory cytokines3,4.
Anteriormente, pensava-se que as lipoproteínas de bactérias gram-positivas eram diacylated e os de bactérias Gram-negativas foram triacylated, diferenciando-se na ausência ou presença de um ácido graxo Amida-lig sobre os resíduos de cisteína conservados N-terminal. Esta hipótese foi apoiada pela falta de sequência orthologs em Gram-positivas genomas de Lnt, o transferase N-acil Gram-negativas que forma de lipoproteínas triacylated5. No entanto, estudos recentes têm revelado lipoproteína triacylation em Gram-positivas Firmicutes essa falta de lnt, bem como três estruturas romance de lipoproteína de N-terminal, denominadas o peptidyl, super e N -acetil formas6,7 ,8. Estas descobertas levantam questões sobre formas de lipoproteína possível para ser descoberto, ao lado de questões fundamentais sobre como estas lipoproteínas romance são feitas e que finalidade fisiológica ou vantagem das diversas formas transmitir. Além disso, eles demonstram claramente a incapacidade atual de genômica para prever a estrutura de lipoproteína. Com efeito, recentemente identificamos uma classe nova de transferases N-acil de lipoproteína, chamado Lit, de Enterococcus faecalis e Bacillus cereus que faz superformulário lipoproteínas9. Isto indica a necessidade de verificar experimentalmente a estrutura de lipoproteína, que pode ser um desafio devido à sua natureza extremamente hidrofóbica e limitados métodos disponíveis para caracterizar sua estrutura molecular.
Para facilitar estudos na indução de lipoproteína da resposta imune do hospedeiro, bem como a determinação estrutural N-terminal, adaptámos vários protocolos descritas anteriormente, a fim de purificar as lipoproteínas bacterianas e preparar o N-terminal tryptic lipopeptides para análise por MALDI-TOF MS6,10,11,12. As lipoproteínas são enriquecidas usando uma fase estabelecida de Triton X-114 (doravante referido como surfactante ou TX-114) método, com otimização para remover contaminantes não-lipoproteínas e aumentar o rendimento de lipoproteína de particionamento. Estas lipoproteínas são adequadas para uso direto em ensaios TLR ou mais purificação por SDS-PAGE. Para MALDI-TOF MS, transferência das lipoproteínas para membrana de nitrocelulose prevê um andaime eficiente em situ digestão do trypsin, lavagem e eluição subsequente da superfície da membrana, resultando no altamente purificado lipopeptides N-terminal. Nitrocelulose foi mostrado para facilitar o manuseio de amostras e melhorar a cobertura de sequência para peptídeos altamente hidrofóbicos das proteínas de membrana integrais13,14, bem como as lipoproteínas9,10 . O método tem a vantagem adicional de fracionamento peptídeos baseados na polaridade, para que soluções de lavagem intermediária podem ser analisadas para identificação de proteínas de alta confiança simultaneamente com determinação estrutural N-terminal em uma única experiência . Este protocolo exclusivamente intencional sódio características aduto formação para promover a fragmentação de íon de pai para dehydroalanyl íons durante MS/MS, auxiliando na atribuição estrutural do estado de - acilação N. N-terminal é ambos a característica mais variável e chave relacionada ao reconhecimento TLR de lipoproteínas. Tomados em conjunto, este protocolo tem permitido estudos intensivos e reprodutíveis sobre as lipoproteínas, com diferentes etapas de purificação e determinação estrutural por MALDI-TOF MS facilmente adaptado dependendo o objetivo geral do experimento.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.01 mm Zirconia/silica beads</td>
			<td>BioSpec Products</td>
			<td>110791012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>EMD</td>
			<td>AX0073-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>EMD</td>
			<td>AX0116-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>EMD</td>
			<td>AX0142-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Fluka Analytical</td>
			<td>09830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioTrace NT Nitrocellulose</td>
			<td>PALL Life Sciences</td>
			<td>66485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA) digest standard</td>
			<td>Protea</td>
			<td>PS-204-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>423550025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC Grade water</td>
			<td>EMD</td>
			<td>WX0008-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP535-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethyl sulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce trypsin protease</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>90057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ponceau S</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>161470100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein LoBind Tube 0.5mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022431064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>792519</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Macron Fine Chemicals</td>
			<td>7581-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid (TFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>299537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-hydrochloride (HCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-114</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>93422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic soy broth (TSB)</td>
			<td>BD</td>
			<td>211822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-cyano-4-hydroxycinnamic acid (MS Grade)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8982</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagNALyser</td>
			<td>Roche</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot Turbo Transfer System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MALDI-TOF target</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultraflextreme MALDI-TOF-TOF</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td></td>
			<td>Equipped with a 355 nm frequency-tripled Nd:YAG smartbeam-II laser</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enrichment of bacterial lipoproteins and preparation of n-terminal lipopeptides for structural determination by mass spectrometry

As lipoproteínas são importantes constituintes do envelope celular bacteriana e potentes ativadores da resposta imune inata dos mamíferos. Apesar de sua importância para a fisiologia celular e Imunologia, ainda muito para ser descoberto sobre formas de lipoproteína romance, como eles são sintetizados e o efeito das várias formas de imunidade do hospedeiro. Para habilitar estudos aprofundados sobre as lipoproteínas, este protocolo descreve um método para o enriquecimento de lipoproteína bacteriana e preparação do N-terminal tryptic lipopeptides de determinação estrutural por laser assistida por matriz desorção ionização-tempo de voo espectrometria de massa (MALDI-TOF-MS). Expandindo-se em uma fase de Triton X-114 estabelecida particionamento método para extração de lipoproteína e enriquecimento da membrana da célula bacteriana, o protocolo inclui etapas adicionais para remover contaminantes não-lipoproteína, aumentando o rendimento de lipoproteína e pureza. Desde que lipoproteínas são comumente utilizadas em ensaios de receptores do tipo Toll (TLR), é fundamental para primeiro caracterizar a estrutura do N-terminal por aquiem MALDI-TOF MS., um método é apresentado para isolar peptídeos hidrofóbicos concentrados, enriquecidos no N-terminal lipopeptides adequados para análise direta por MALDI-TOF MS/MS. lipoproteínas que foram separados por sódio Dodecil sulfato de Poly-Acrylamide electroforese do Gel (SDS-PAGE) são transferidos para uma membrana de nitrocelulose, digerido em situ com tripsina, sequencialmente lavado para remover peptídeos tryptic polares e finalmente eluída com clorofórmio-metanol. Quando acoplado com MS dos peptides mais polares trypsinized de soluções de lavagem, este método fornece a capacidade para identificar a lipoproteína e caracterizar seu N-terminal em uma única experiência. Sódio intencional aduto formação também podem ser empregados como uma ferramenta para promover mais espectros de fragmentação estruturalmente informativo. Em última análise, enriquecimento de lipoproteínas e determinação das suas estruturas de N-terminal permitirá estudos mais aprofundados sobre esta classe onipresente de proteínas bacterianas.

Um esquema do protocolo é fornecido na Figura 1. A fração de lipoproteína enriquecido extraída de Enterococcus faecalis ATCC 19433 por TX-114 é mostrada na Figura 2. Para comparação, o padrão de bandas da fração proteína precipitado também é mostrado. Proteínas dessa fração foram confirmadas por MALDI-MS para ser altamente abundante contaminando as proteínas além de lipoproteínas (tabela 1</st...

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Enrichment of Bacterial Lipoproteins and Preparation of N-terminal Lipopeptides for Structural Determination by Mass Spectrometry

Enriquecimento de lipoproteínas bacterianas e preparação do N-terminal Lipopeptides de determinação estrutural por espectrometria de massa

O enriquecimento de lipoproteínas bacterianas usando uma fase de tensoativo não-iônico, método de particionamento é descrito para utilização directa em ensaios TLR ou outras aplicações. Novos passos são detalhados para preparar tryptic lipopeptides N-terminal para caracterização estrutural por espectrometria de massa.

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