Name: enrichment of bacterial lipoproteins and preparation of n-terminal lipopeptides for structural determination by mass spectrometry
Uploaded: 2018-05-21T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Enrichment of Bacterial Lipoproteins and Preparation of N-terminal Lipopeptides for Structural Determination by Mass Spectrometry at JoVE.com

Исследования в лаборатории Мередит был поддержан запуска средств, предоставленных Эберли Колледж естественных наук (Университет штата Пенсильвания). Мы благодарим д-р Татьяна Laremore для технических экспертов и доступа к оборудованию на Пенн государства протеомики и масс спектрометрии основного фонда, Юниверсити-Парк, штат Пенсильвания, где Массовый спектрометрический анализы.

1. рост и Lysis клетки
<ol><li>Растут бактерий в 15 мл tryptic соевый бульон (TSB) или аналогичные богатые средства массовой информации к поздней экспоненциальной фазе (OD600 1,0-1,5). Урожай клетки центрифугированием, раз промойте трис амортизированное saline/ЭДТА (TBSE) и продолжить с протоколом или за?...

<ol>
	<li>Babu, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+database+of+bacterial+lipoproteins+(DOLOP)+with+functional+assignments+to+predicted+lipoproteins.">A database of bacterial lipoproteins (DOLOP) with functional assignments to predicted lipoproteins.</a> J Bacteriol. 188 (8), 2761-2773 (2006).</li><li>Narita, S., Tokuda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+lipoproteins;+biogenesis,+sorting+and+quality+control.">Bacterial lipoproteins; biogenesis, sorting and quality control.</a> Biochim Biophys Acta. 1862 (11), 1414-1423 (2016).</li><li>Kovacs-Simon, A., Titball, R. W., Michell, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipoproteins+of+bacterial+pathogens.">Lipoproteins of bacterial pathogens.</a> Infect Immun. 79 (2), 548-561 (2011).</li><li>Nguyen, M. T., G&#246;tz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipoproteins+of+Gram-Positive+Bacteria:+Key+Players+in+the+Immune+Response+and+Virulence.">Lipoproteins of Gram-Positive Bacteria: Key Players in the Immune Response and Virulence.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 80 (3), 891-903 (2016).</li><li>Nakayama, H., Kurokawa, K., Lee, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipoproteins+in+bacteria:+structures+and+biosynthetic+pathways.">Lipoproteins in bacteria: structures and biosynthetic pathways.</a> FEBS J. 279 (23), 4247-4268 (2012).</li><li>Kurokawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+bacterial+lipoprotein+structures+conserved+in+low-GC+content+Gram-positive+bacteria+are+recognized+by+Toll-like+receptor+2.">Novel bacterial lipoprotein structures conserved in low-GC content Gram-positive bacteria are recognized by Toll-like receptor 2.</a> J Biol Chem. 287 (16), 13170-13181 (2012).</li><li>Kurokawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Triacylated+ATP+Binding+Cluster+Transporter+Substrate-binding+Lipoprotein+of+Staphylococcus+aureus+Functions+as+a+Native+Ligand+for+Toll-like+Receptor+2.">The Triacylated ATP Binding Cluster Transporter Substrate-binding Lipoprotein of Staphylococcus aureus Functions as a Native Ligand for Toll-like Receptor 2.</a> J Biol Chem. 284 (13), 8406-8411 (2009).</li><li>Asanuma, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+evidence+of+&#945;-aminoacylated+lipoproteins+of+Staphylococcus+aureus.">Structural evidence of &#945;-aminoacylated lipoproteins of Staphylococcus aureus.</a> FEBS J. 278 (5), 716-728 (2011).</li><li>Armbruster, K. M., Meredith, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+Lyso-Form+N-Acyl+Intramolecular+Transferase+in+Low-GC+Firmicutes.">Identification of the Lyso-Form N-Acyl Intramolecular Transferase in Low-GC Firmicutes.</a> J Bacteriol. 199 (11), e00099-e00017 (2017).</li><li>Serebryakova, M. V., Demina, I. A., Galyamina, M. A., Kondratov, I. G., Ladygina, V. G., Govorun, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+acylation+state+of+surface+lipoproteins+of+Mollicute+Acholeplasma+laidlawii.">The acylation state of surface lipoproteins of Mollicute Acholeplasma laidlawii.</a> J Biol Chem. 286 (26), 22769-22776 (2011).</li><li>Feng, S. H., Lo, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+mouse+spleen+B-cell+proliferation+and+secretion+of+immunoglobulin+by+lipid-associated+membrane+proteins+of+Mycoplasma+fermentans+incognitus+and+Mycoplasma+penetrans.">Induced mouse spleen B-cell proliferation and secretion of immunoglobulin by lipid-associated membrane proteins of Mycoplasma fermentans incognitus and Mycoplasma penetrans.</a> Infect Immun. 62 (9), 3916-3921 (1994).</li><li>Feng, S. H., Lo, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+extract+of+Mycoplasma+penetrans+proteinase+K-digested+lipid-associated+membrane+proteins+rapidly+activates+NF-kappaB+and+activator+protein+1.">Lipid extract of Mycoplasma penetrans proteinase K-digested lipid-associated membrane proteins rapidly activates NF-kappaB and activator protein 1.</a> Infect Immun. 67 (6), 2951-2956 (1999).</li><li>Luque-Garcia, J. L., Zhou, G., Spellman, D. S., Sun, T. -. T., Neubert, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+electroblotted+proteins+by+mass+spectrometry:+protein+identification+after+Western+blotting.">Analysis of electroblotted proteins by mass spectrometry: protein identification after Western blotting.</a> Mol Cell Proteomics. 7 (2), 308-314 (2008).</li><li>Luque-Garcia, J. L., Zhou, G., Sun, T. -. T., Neubert, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Nitrocellulose+Membranes+for+Protein+Characterization+by+Matrix-Assisted+Laser+Desorption/Ionization+Mass+Spectrometry.">Use of Nitrocellulose Membranes for Protein Characterization by Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry.</a> Anal Chem. 78 (14), 5102-5108 (2006).</li><li>Kurokawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environment-mediated+accumulation+of+diacyl+lipoproteins+over+their+triacyl+counterparts+in+Staphylococcus+aureus.">Environment-mediated accumulation of diacyl lipoproteins over their triacyl counterparts in Staphylococcus aureus.</a> J Bacteriol. 194 (13), 3299-3306 (2012).</li><li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4.">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li><li>Sch&#1235;gger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tricine-SDS-PAGE.">Tricine-SDS-PAGE.</a> Nat Protoc. 1, 16-22 (2006).</li><li>Gravel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Blotting+by+the+Semidry+Method.">Protein Blotting by the Semidry Method.</a> The Protein Protocols Handbook. , 321-334 (2002).</li><li>Webster, J., Oxley, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Identification+by+Peptide+Mass+Fingerprinting+using+MALDI-TOF+Mass+Spectrometry.">Protein Identification by Peptide Mass Fingerprinting using MALDI-TOF Mass Spectrometry.</a> The Protein Protocols Handbook. , 1117-1129 (2009).</li><li>Wilkins, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detailed+peptide+characterization+using+PEPTIDEMASS+-+a+World-Wide-Web-accessible+tool.">Detailed peptide characterization using PEPTIDEMASS - a World-Wide-Web-accessible tool.</a> Electrophoresis. 18 (3-4), 403-408 (1997).</li><li>Gasteiger, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Identification+and+Analysis+Tools+on+the+ExPASy+Server.">Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server.</a> The Proteomics Protocols Handbook. , 571-607 (2005).</li><li>Perkins, D. N., Pappin, D. J. C., Creasy, D. M., Cottrell, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probability-based+protein+identification+by+searching+sequence+databases+using+mass+spectrometry+data.">Probability-based protein identification by searching sequence databases using mass spectrometry data.</a> Electrophoresis. 20 (18), 3551-3567 (1999).</li><li>Al-Saad, K. A., Zabrouskov, V., Siems, W. F., Knowles, N. R., Hannan, R. M., Hill, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix-assisted+laser+desorption/ionization+time-of-flight+mass+spectrometry+of+lipids:+ionization+and+prompt+fragmentation+patterns.">Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry of lipids: ionization and prompt fragmentation patterns.</a> Rapid Commun Mass Spectrom. 17 (1), 87-96 (2003).</li></ol>

Здесь протокол описывает два отдельных этапов липопротеинов характеристика: обогащение TX-114 фаза перегородки и структурные определения MALDI-TOF MS. Во время извлечения TX-114 дополнительные центрифугирования удаляет загрязняясь протеины, которые осадок во время этого процесса, следуют ацет...

Бактериальные липопротеинов характеризуются сохранены N-терминальный липидного изменено хвоща, который закрепляет домена глобулярных белков на поверхности клеточной мембраны. Они распределены повсеместно в бактерии, составляют 2-5% всех клеточных генов в течение типичного генома1. Липопротеиды играют решающую роль в самых разнообразных клеточных процессов, включая поглощение питательных веществ, сигнальной трансдукции телефоны, Ассамблея белковых комплексов и в поддержании конверт структурной целостности2. В патогенных бактерий липопротеинов служат факторы вирулентности3,4. Во время инфекции признание lipopeptides N-стержня, Толл подобный рецептор (TLR) 2 подстрекает врожденный иммунный ответ для удаления вторжение патогенов. В зависимости от состояния ацилирования N-стержня липопротеинов распознаются как правило альтернативные TLR2 гетеродимерная комплексов. TLR2-TLR1 признает N-ацилированных lipopeptides, хотя TLR2-TLR6 связывает свободный липопептиды α-аминокислоты Термини. Один раз связанный, сигнальные пути сходятся побудить секрецию провоспалительных цитокинов3,4.
Ранее считалось, что липопротеинов от грамположительные бактерии были diacylated и те от грамотрицательных бактерий triacylated, отличаясь в отсутствие или наличие связаны Амида жирной кислоты на сохранившихся остатков цистеина N-терминала. Это предположение было поддержано отсутствие последовательности Ортологи в грамположительных геномы Lnt, трансферазы грамотрицательные N-ацил, которая формирует triacylated липопротеины5. Однако недавние исследования показали, triacylation липопротеинов в грамположительных Фирмикуты что отсутствие lnt, а также три романа структуры N-терминальный липопротеинов, называют peptidyl, lyso и N -ацетил формы6,7 ,8. Эти результаты поднимают вопросы о формах можно еще к быть обнаружил липопротеинов, наряду с основополагающие вопросы о том, как эти Роман липопротеинов и какие физиологические цели или преимущество распространять различные формы. Кроме того они наглядно демонстрируют геномики текущего невозможность предсказать структуру липопротеинов. Действительно мы недавно выявили новый класс липопротеинов N-ацил трансферазы, называется Lit, Enterococcus faecalis и Bacillus cereus , что делает lyso форма липопротеинов9. Это указывает на необходимость экспериментально проверить липопротеинов структуры, которая может быть сложным из-за их чрезвычайно гидрофобная природа и ограниченные методы, доступные для характеризовать их молекулярной структуры.
Для облегчения исследований по индукции липопротеинов иммунного ответа, а также структурные определения N-терминала, мы адаптировали несколько ранее описанные протоколы для того чтобы очистить бактериальных липопротеинов и подготовить tryptic N-терминальный lipopeptides для анализа MALDI-TOF MS6,10,,1112. Липопротеины обогащаются с использованием установленных Тритон X-114 (отныне именуемой ПАВ или TX-114) фазы, секционирование метод, с оптимизацией для удаления загрязняющих non липопротеинов и увеличить урожайность липопротеинов. Эти липопротеинов пригодны для непосредственного использования в TLR анализов или для дальнейшей очистки, SDS-PAGE. Для MALDI-TOF MS передачи липопротеинов нитроцеллюлозную мембрану обеспечивает леску для эффективного в situ Пищеварение трипсина, мытье, и последующие элюции от поверхности мембраны, что приводит к весьма очищенный N-терминала lipopeptides. Нитроцеллюлоза было показано, чтобы облегчить пробами и улучшить освещение последовательности для высокой гидрофобностью пептидов из составной мембранных белков13,14, а также липопротеинов9,10 . Метод имеет дополнительное преимущество, фракционирования пептиды, основанные на полярности, так что промежуточные Вымойте решения могут быть проанализированы для идентификации белков высокого доверия одновременно с N-терминальный структурные определения в одном эксперименте . Этот протокол уникально возможности преднамеренного натрия аддукт формирования способствовать фрагментации Ион родителя к dehydroalanyl ионов во время МС/МС, пособничество в структурной назначение государства - ацилирования N. N-го является наиболее переменных и ключевых функций, связанных с признанием TLR липопротеинов. Вместе взятые, этот протокол позволил интенсивной и воспроизводимости исследований на липопротеинов, с отдельные этапы очищения и структурные определения MALDI-TOF MS легко адаптированы в зависимости от общей цели эксперимента.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.01 mm Zirconia/silica beads</td>
			<td>BioSpec Products</td>
			<td>110791012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>EMD</td>
			<td>AX0073-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>EMD</td>
			<td>AX0116-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>EMD</td>
			<td>AX0142-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Fluka Analytical</td>
			<td>09830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioTrace NT Nitrocellulose</td>
			<td>PALL Life Sciences</td>
			<td>66485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA) digest standard</td>
			<td>Protea</td>
			<td>PS-204-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>423550025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC Grade water</td>
			<td>EMD</td>
			<td>WX0008-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP535-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethyl sulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce trypsin protease</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>90057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ponceau S</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>161470100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein LoBind Tube 0.5mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022431064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>792519</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Macron Fine Chemicals</td>
			<td>7581-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid (TFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>299537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-hydrochloride (HCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-114</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>93422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic soy broth (TSB)</td>
			<td>BD</td>
			<td>211822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-cyano-4-hydroxycinnamic acid (MS Grade)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8982</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagNALyser</td>
			<td>Roche</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot Turbo Transfer System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MALDI-TOF target</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultraflextreme MALDI-TOF-TOF</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td></td>
			<td>Equipped with a 355 nm frequency-tripled Nd:YAG smartbeam-II laser</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enrichment of bacterial lipoproteins and preparation of n-terminal lipopeptides for structural determination by mass spectrometry

Липопротеины являются мощным активаторы млекопитающих врожденный иммунный ответ и важные составляющие конверт бактериальной клетки. Несмотря на их значение для физиологии клетки и иммунологии предстоит быть обнаружены формы роман липопротеинов, как они синтезируются и влияние различных форм на хост иммунитета. Чтобы включить тщательные исследования на липопротеинов, этот протокол описывает метод для обогащения бактериальных липопротеинов и подготовка tryptic lipopeptides N-терминальный структурные определения матрицы с помощью лазерной десорбции ионизации время полета масс-спектрометрия (MALDI-TOF MS). Расширение на установленных Тритон X-114 фазы, секционирование метод липопротеинов добычи и обогащения от бактериальных клеточных мембран, протокол включает дополнительные шаги для удаления загрязнений-липопротеиды, увеличивая урожайности липопротеинов и чистоты. Так как липопротеинов широко используются в Толл подобный рецептор (TLR) анализов, важно сначала охарактеризовать структуру N-стержня, г-жа MALDI-TOF здесь, изолировать концентрированной гидрофобные пептиды, обогащенный в N-терминальный представлен метод lipopeptides подходит для прямого анализа MALDI-TOF MS/жа липопротеинов, отделяющий натрия Додециловый сульфат-Полимерность электрофорез геля (SDS-PAGE) передаются на нитроцеллюлозную мембрану, усваивается в situ с трипсин, последовательно промывают для удаления полярных tryptic пептидов и наконец этого eluted хлороформ-метанола. В сочетании с MS более полярных trypsinized пептидов из Вымойте решения, этот метод обеспечивает возможность выявления липопротеинов и характеризуют его N-terminus в одном эксперименте. Преднамеренное натрия аддукт формирования также могут использоваться как инструмент для поощрения более структурно информативный фрагментации спектров. В конечном счете обогащение липопротеинов и определение структуры их N-терминала позволит более обширные исследования на этот вездесущий класса бактериальных белков.

На рисунке 1приводится схема протокола. Липопротеины плотности обогатил дроби, извлеченные из Enterococcus faecalis ATCC 19433 TX-114 показан на рисунке 2. Для сравнения также отображается диапазонов шаблон осажденный белковые фракции. Белки из это...

Watch this Scientific Journal Video about Enrichment of Bacterial Lipoproteins and Preparation of N-terminal Lipopeptides for Structural Determination by Mass Spectrometry at JoVE.com

Enrichment of Bacterial Lipoproteins and Preparation of N-terminal Lipopeptides for Structural Determination by Mass Spectrometry

Обогащение бактериальных липопротеинов и подготовка N-терминальный Lipopeptides структурные определения по масс-спектрометрии

Обогащение бактериальной липопротеинов с использованием фазы неионных ПАВ, секционирование метод описан для прямого использования в TLR анализов или других приложений. Дальнейшие шаги подробно подготовить tryptic lipopeptides N-терминала для структурных характеристик по масс-спектрометрии.

Lipoproteins are important constituents of the bacterial cell envelope and potent activators of the mammalian innate immune response. Despite their ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Invasion of Human Cells by a Bacterial Pathogen

Вторжение клеток человека от бактериальных патогенов

Here we will describe how we study the invasion of human endothelial cells by bacterial pathogen Staphylococcus aureus . The general protocol can be ...

Structure of HIV-1 Capsid Assemblies by Cryo-electron Microscopy and Iterative Helical Real-space Reconstruction

Структура ВИЧ-1 капсида Ассамблеи по крио-электронной микроскопии и итерационных Винтовая реальном пространстве реконструкции

Cryo-electron microscopy (cryo-EM), combined with image processing, is an increasingly powerful tool for structure determination of macromolecular protein ...

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Слюна, слюнные железы, и гемолимфы Коллекция от иксодовых клещей Scapularis

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne ...

Discovery of New Intracellular Pathogens by Amoebal Coculture and Amoebal Enrichment Approaches

Открытие новых внутриклеточных патогенов на Amoebal сокультивирования и подходов Amoebal обогащению

Intracellular pathogens such as legionella, mycobacteria and Chlamydia-like organisms are difficult to isolate because they often grow poorly or not at ...

Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

Быстрое выявление грамотрицательных бактерий из крови культуральной жидкости Использование MALDI-TOF масс-спектрометрии

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional ...

Preparation of a Blood Culture Pellet for Rapid Bacterial Identification and Antibiotic Susceptibility Testing

Подготовка крови культуры Пелле для быстрого идентификации бактерий и чувствительности к антибиотикам

Bloodstream infections and sepsis are a major cause of morbidity and mortality. The successful outcome of patients suffering from bacteremia depends on a ...

Electroporation of Functional Bacterial Effectors into Mammalian Cells

Электропорация функциональных бактериальных эффекторов в клетках млекопитающих

The study of protein interactions in the context of living cells can generate critical information about localization, dynamics, and interacting partners. ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Генерация и нескольких фенотипическая Скрининг высокого содержания<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; транспозонов мутанты

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Alternative In Vitro Methods for the Determination of Viral Capsid Structural Integrity

Alternative In Vitro Methods for the Determination of Viral Capsid Structural Integrity

Альтернативные в Vitro методы для определения вирусного капсида структурной целостности

Human norovirus exacts considerable public health and economic losses worldwide. Emerging in vitro cultivation advances are not yet applicable for routine ...

Identification of Nucleolar Factors During HIV-1 Replication Through Rev Immunoprecipitation and Mass Spectrometry

Идентификация нуклеолярных факторов во время репликации ВИЧ-1 через Rev Immunoprecipitation и масс-спектрометрию

The HIV-1 infectious cycle requires viral protein interactions with host factors to facilitate viral replication, packaging, and release. The infectious ...