Name: metabolic mapping: quantitative enzyme cytochemistry and histochemistry to determine the activity of dehydrogenases in cells and tissues
Uploaded: 2018-05-26T13:00:00
Duration: 8 min 36 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Metabolic Mapping: Quantitative Enzyme Cytochemistry and Histochemistry to Determine the Activity of Dehydrogenases in Cells and Tissues at JoVE.com

R.J.M. נתמך על ידי מלגת הדוקטורט AMC. מחקר זה נתמך על ידי ההולנדי האגודה למלחמה בסרטן (KWF גרנט UVA 2014-6839). המחברים מודים יונקר א ד ר לעזרתו עם הכתיבה של הפרוטוקול.

פרוטוקול זה עוקב אחר ההנחיות על השימוש של החומר האנושי של ועדת הבדיקה אתיות הרפואי של המרכז הרפואי האקדמי.
1. הכנת תאים או רקמות מקטעים
<ol><li>תאים<ol>
<li>Trypsinize תאים מן התרבות מנות באמצעות 1 מ"ל של 0.25% טריפסין-EDTA עבור 5 דקות ב 37 ° C ב- 10 מ מ פטרי ולהביא התאים ב- 37 מעלות צלזיוס השעיה של 50,000-200,000 תאים למ"ל, בהתאם לגודל של התאים.</li>
		<li>לצרף 200 µL של התליה תא אל שקופיות מיקרוסקופ באמצעות cytospin funnels cytocentrifuge ב 20 x g למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>מילה נהדרת של cytospins עבור 24 שעות בטמפרטורת החדר. הגדרה זו אינה משפיעה פעילות דהידרוגנאז. 5
</li>
	</ol>
</li>
	<li>מקטעי רקמת<ol>
<li>מבקר המסעדות חולים או בעלי חיים על פי היתרים אתית. 10 מ מ3 של רקמות מספיקה עבור ניסויים מרובים.</li>
		<li>לשים את פיסות רקמה לתוך צלוחיות פלסטיק קטן מ ל 2 פרקו, snap-להקפיא הבקבוקונים המכיל פיסת הרקמה של חנקן נוזלי.</li>
		<li>אחסן את הבקבוקונים המכילה חתיכות רקמה −80 ° C עד עיבוד נוסף.</li>
		<li>השתמש מדיום דמוי ג'ל הנקרא טמפרטורה אופטימלית חיתוך (אוקטובר) כדי לטעון את דגימת רקמה על צ'אק שקופא ל-20 ° C ל--25 ° C במהירות, כך מים לא יכול ליצור גבישים.</li>
		<li>שימוש cryostat חיתוך והראשון לקצץ את הבלוק לרמה הרצויה (אידיאלי חצי מרוחב מיקרוסקופיה זכוכית שקופית, למשל 5 מ מ x 5 מ מ).</li>
		<li>עם חלוקתה, להשתמש מברשות, צלחת אנטי-לגלגל כדי למנוע את המקטעים מסתלסל כלפי מעלה.</li>
		<li>לחתוך דגימות רקמה למקטעים מיקרומטר בעובי 6-10 במהירות איטי אך קבוע (1 s לכל סעיף). כאשר מקטע הוא נחתך כראוי, נותר שטוח על הסכין מיקרוטום כתשר אנטי-רול.</li>
		<li>לאסוף את סעיפים 1-3 בשקופיות זכוכית microscopical ולאחסן ב −80 ° C עד השימוש. מספר קטעים מוכן תלוי בגודל של דגימת הרקמות העובי הרצוי של הסעיפים.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. אנזים היסטו/Cytochemistry עבור Dehydrogenases מסיסים
<ol><li>הכנת מאגר התגובה.<ol>
<li>להכין 100 מ של פוספט מאגר של ה-pH נכונה (ראו טבלה 1; לכל אנזים יש של pH אופטימלי בו פעילות שלה הוא הגבוה ביותר). לדוגמה, מערבבים פתרונות של 0.1 מ' ח'2PO4 (חומצי) ו 0.1 M נה2HPO4 (בסיסי) עד מאגר עם ה-pH נכונה.</li>
		<li>שוקל 18 גרם אלכוהול (PVA) למאגר פוספט ברדס fume כמו PVA מאובק ולא רעילים.<ol>
<li>התמוססות של 18% w/v PVA במאגר פוספט ב 100 מעלות צלזיוס על ידי ההתחממות המאגר au ביין מארי (לשים בקבוק הזכוכית במים רותחים), תוך ערבוב עד PVA התפרקה לחלוטין. הפתרון יהיה שקוף, עם בועות אוויר קטנות שנגרמות על ידי ערבוב. זה בדרך כלל דורש ~ 15 דקות בשביל PVA להתמוסס. הערה: 18% w/v PVA במאגר פוספט צמיגה, ניתן להעביר 15 מ"ל התגובה מאגר צינורות באמצעות פיפטה רחב. אחסון לטווח קצר של 18% w/v PVA במאגר פוספט צריכה להתרחש ≥40 ° C, לאחסון לטווח ארוך (עד 2 שבועות) אצל ≥ 60 מעלות צלזיוס. µL 250 של 18% w/v PVA במאגר פוספט נדרש בדרך כלל עבור הכנה cytospin, בעוד 500 µL נדרש עבור מקטע רקמות.</li>
		</ol>
</li>
		<li>להכין פתרון מלח (nitroBT) tetrazolium. עבור כל 1 מ"ל של דגירה מדיום, µL 40 של nitroBT פתרון נדרש, בהיקף של 5 מ"ג של nitroBT (אבקה צהובה) מומס שילוב של µL 20 dimethylformamide (DMF) ו- µL 20 של אתנול, אשר יהיה פתרון שקוף צהוב בהיר. הערה: בגלל היציבות של nitroBT הוא הנמוך ביותר של כל ריאגנטים הכרחי, מומלץ להכין את הפתרון מניות nitroBT אחרונה ולקבל להמיס את nitroBT לתוך האמצעי תגובת קודם.<ol>
<li>להמיס nitroBT DMF, אתנול על ידי חימום זה בקבוקון זכוכית במשך תקופה קצרה של זמן (~ 10 s) באמצעות מבער בונזן. לנער את המבחנה בזמן חימום, אל תשאירו את המבחנה יותר מדי זמן ב הלהבה כדי למנוע התאיידות.</li>
			<li>להפוך את 10% הפתרון nitroBT נוספת כדי לאפשר אידוי DMF ואתנול במהלך תהליך המסת.</li>
		</ol>
</li>
		<li>מגן על אלקטרון נשאים phenazine methosulfate (PMS) או (1-מתוקסי)-phenazine methosulfate (mPMS), דגירה מדיה המכילה m(PMS) של אור ישיר על-ידי גלישת נייר כסף סביב המבחנה אחסון זכוכית.</li>
		<li>להכין ריאגנט פתרונות על פי טבלה 1 על ידי המסת אותם מזוקקים H2O. כמה ריאגנטים לגווע במהירות, אז הכינו אותם כמו זמן קצר לפני הניסוי ככל האפשר. לשמור פתרונות מגיב על קרח או ב 4 ° C עד השימוש.</li>
		<li>להכין מדיה הדגירה כפי שמוצג בטבלה 1 , homogenize את הפתרון לאחר כל שלב על ידי ערבוב עדין. להימנע הדור של בועות אוויר בתוך המדיום הדגירה תוך ערבוב מתמיד ושמירה המרית מתחת לפני השטח של המדיום הדגירה תוך כדי ערבוב.</li>
	</ol>
</li>
	<li>החלת הדגירה בינוני על מקטעים של רקמות<ol>
<li>שקופיות מיקרוסקופ חם מראש עם cytospins או רקמות מקטעים מצורף ב- 37 מעלות צלזיוס ב חדר הדגירה אימונוהיסטוכימיה במשך 15 דקות להטביע בתחתית תא הדגירה אימונוהיסטוכימיה במים חמים כדי לשמור על טמפרטורת חום קבועה ב- חממה.</li>
		<li>בזהירות לשבור או לנסר את פיפטות פסטר-המעבר הצר החלק הרחב. פיפטות פסטר רגיל צרים מדי האחות המדיום הדגירה צמיגה, אז שלב זה יש צורך להפוך רחב מספיק עבור השאיפה של המדיום הדגירה פיפטות פסטר.</li>
		<li>החל 250-500 µL של המדיום הדגירה המתאים לכל תא הכנה או סעיף הרקמה על שקופיות מיקרוסקופ באמצעות החלק הרחב של פיפטה פסטר.</li>
		<li>להשתמש את הטיפ פיפטה שמתפזר המדיום הדגירה. להתעלם בועות אוויר קטנות במדיום דגירה, כי אלה יצופו על פני השטח לא יתערב התגובה אנזימטי בסעיף תא הכנה או רקמות בשקופית מיקרוסקופ.</li>
		<li>תקופת דגירה של ההכנות התא או מקטעי רקמת על השקופיות מיקרוסקופיה 37 ° C חממה (למשל חממה תרביות רקמה) של משך זמן שצוין מראש, בהתאם קינטיקה אנזימטית את ביטויה בהכנה לתא מסוים או רקמה (טבלה 1). שמור את המכסה של תא הדגירה אימונוהיסטוכימיה סגורות כדי לשמור על סביבה לחה כדי למנוע את המאגר תגובה ממנו להתייבש.</li>
	</ol>
</li>
	<li>שטיפת שקופיות מיקרוסקופ<ol>
<li>הקש את הדגירה עודף בינוני על טישו.</li>
		<li>מכנית לשטוף המדיום הדגירה מהשקופיות מיקרוסקופ במאגר פוספט 60 ° C, pH 5.3, על ידי העברת שקופיות מיקרוסקופ למעלה ולמטה במאגר. זה עוצר את התגובה אנזימטיות.</li>
		<li>לשטוף את שקופיות מיקרוסקופ על ידי שמירה על אותם במאגר פוספט 60 ° C, pH 5.3 כעשרים דקות.</li>
		<li>מכנית לשטוף את שקופיות מיקרוסקופ במי ברז 60 ° C.</li>
		<li>לשטוף את שקופיות מיקרוסקופ על ידי שמירה על אותם במי ברז 60 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות.</li>
		<li>תן למים, שקופיות להתקרר לאט ערבוב מי ברז בטמפרטורת החדר עם מי הברז 60 מעלות צלזיוס במשך 1 דקה.</li>
		<li>לבצע צעד סופי כביסה מכני במים מזוקקים בטמפרטורת החדר.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הקף את Cytospins מוכתם או מקטעי רקמת על שקופיות מיקרוסקופ<ol>
<li>לחמם שקופית חם יותר ב 50-60 ° c</li>
		<li>בזהירות לייבש את הצד האחורי של שקופיות מיקרוסקופ בעזרת מגבת נייר ומניחים על השקופית חם לייבוש את הצד העליון של השקופית מיקרוסקופ.</li>
		<li>כאשר השקופיות יבש, הקף תא ההכנות או מקטעים רקמות על שקופיות מיקרוסקופ באמצעות גליצרול ג'לי הרכבה בינונית ו coverslips.</li>
		<li>שמור את ההכנות התא או שקופיות מיקרוסקופ מקטעים רקמות בחושך במקרר ב 4 ° C או ומיד להמשיך עם ייבוא תמונות.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. ייבוא תמונות
<ol><li>תגובה לינארית ורווח תמונות רשומה עם מצלמה מדעי CCD בשחור-לבן עם טווח דינמי מספיק (לפחות 8-bit, אבל רצוי 10 סיביות או 12 סיביות), קבוע.</li>
	<li>בחר מטרה נאותה (20 X X-63 עבור cytospins) ו- 10-63 X עבור מקטעים רקמות.</li>
	<li>לצמצם בוהק על-ידי צמצום הסרעפת שדה כך שזה מעט גדול יותר מאשר שדה הראיה.</li>
	<li>שימוש אור מונוכרומטי על-ידי החלת מסנן היסק bandpass רחב nm 10 ליד הגל isobestic של precipitate formazan7 בשילוב עם חסימת אינפרא-אדום לסנן (ראה טבלת חומרים). הערה: ספיגת isobestic מקסימלית של nitroBT הוא-585 ננומטר.</li>
	<li>מיטוב תאורה על מנת להבטיח כי הטווח כולו רמת האפור של המצלמה משמש (קרי, להגדיר את רמת תאורה כך תאורה המרבית מושגת ללא חשיפת יתר על המידה בעת הקלטת שקופית מיקרוסקופ ריק).</li>
	<li>כיילו ערכים נמדדו רמות אפור ספיגת הידוע (או צפיפות אופטית [OD]). למטרה זו, לכידת תמונות גוני האפור לפחות 10 שלבים שונים של כיול בשקופית או שלב לוח עם ערכים OD ידוע (ראה שלב 4.1.1), או זמינים מסחרית (ראה טבלת חומרים) או למדוד את לוח שלב טריז סולם אפור בהזמנה אישית על ידי densitophotometer ושימוש למדוד התוצאות כדי לכייל את גריי ערכים לערכים ספיגת ידוע.</li>
	<li>ללכוד את photomicrographs של תאים או רקמות מקטעים של עניין.</li>
</ol>4. תמונות ניתוח
<ol><li>לפני ניתוח תמונות, לכייל את התוכנה ImageJ עבור ספיגת מדידות.<ol>
<li>למדוד את ספיגת (OD) של photomicrographs לפחות 10 אזורים כיול עם ספיגת ידועים פרמטרים בכיול שקופית או שלב הלוח עם ערכים OD ידועים. ב- ImageJ, השתמש נתח ← מידה תפריט או Ctrl + M hotkey כדי למדוד את האזור הנבחר.</li>
		<li>מתחילה ההליך כיול ספיגת על נתח ← כיול. בחר פונקציה "Rodbard (NIH תמונה)". בעמודה השמאלית של החלון שנפתח, תוצאות מדידות רמת האפור של כל שלב של הלוח שקופיות/שלב כיול הופיעה 4.1.1 כבר קיימים. אם לא, העתק אותם מהמסך תוצאות ImageJ. בעמודה השמאלית, להזין כל ערך ספיגת ידוע המתאימים כפי שמודפסת על האישור שקיבלת עם הלוח שלב מכוילת. סמן תיבות "כיול העולמי" עלילה "הצג" ולחץ על "אישור".</li>
		<li>עבור בקרת איכות, לוודא R2 של הפונקציה Rodbard > 0.99. אם זה < 0.99, בדוק אם השקופיות כיול היו צולם, נמדד כראוי, האם הפרמטרים הידועים ספיגת הוזנו כהלכה.</li>
		<li>ImageJ עכשיו מכויל עד לסגירת התוכנית (ומכאן "כיול העולמי"). ספיגת מעבדתיים, הפעלה ImageJ מכויל תמיד ממירה שספיגת שנצפה חשובה ערכים בין 0 ל- 1, שבו 0 ו- 1 asymptotes של אפס, מלא ספיגת, בהתאמה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>עבור cytospins, בחר > 100 תאים בודדים באופן אקראי. עבור מקטעים רקמות, בחר שדה אחד או יותר עניין של קבוע אורך ורוחב כל המקטעים.<ol>
<li>פרויקט רסטר מעל photomicrographs כדי לסייע תא לא משוחד הבחירות. ב- ImageJ, פרוייקט רשת מעל תמונה דרך תפריט רשת ← נתח ← תוספים.</li>
		<li>ב- ImageJ, להשתמש בכלי אליפטית כדי לבחור תאים בודדים, ולהשתמש בכלי מלבן כדי לבחור אזורי רקמות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>למדוד את ספיגת ואזור של התאים שנבחרו או רקמות אזורים. צפיפות אופטית ואזור נקראים "מתכוון" ותוצאות "אזור" ב- ImageJ גיליון אלקטרוני, בהתאמה. הערה: ספיגת הכולל של אזור תאים או רקמות (אם בחרת במספר אזורים רקמות עם גדלים שונים) שווה לסכום של כל פיקסל מופרדים absorbances. אם תא עם תמונה ב- 1000 פיקסלים, לאחר מכן ספיגת סה כ ניתנת על ידי הסכום של 1000 absorbances, ספיגת כלומר ניתנת על ידי ספיגת סה כ/1000. הליך זה גם ימנע שגיאה בנפרד.</li>
	<li>לקבוע את ספיגת סה כ ממוצע של > 30 תאים או רקמות אזורים מ השקופיות שליטה, אשר מכיל מדגם זה נחשף לשלוט הדגירה בינוני בהיעדרו של המצע אלא בנוכחות cofactors. ספיגת פקד זה משמש כדי לשלוט מכתים פעילות האנזים שאינם ספציפיים, חפצי אמנות ספיגת המושרה על ידי שקופיות מיקרוסקופ רגיל, הרכבה בינונית, מכסה או מיקרוסקופ.</li>
	<li>להחסיר את ספיגת שליטה הממוצע של כל ספיגת סה כ המדידות של דגימות שנחשפו לבינונית הדגירה עם ריכוז זהה של קופקטור (אך ריכוזים שונים של המצע ו/או מעכב). זה נותן את ספיגת סה כ המתוקן של אזור תאים או רקמות.</li>
	<li>מבחינה סטטיסטית להשוות את absorbances הממוצע הכולל המתוקן באמצעות מבחן T של הסטודנט או מבחן ANOVA בכיוון אחד, בהתאם לעיצוב הניסיונית שלך.</li>
	<li>ספיגת Formazan יכולים להיות מומרים אנזים פעילות (המצע µmol המרה לכל מ"ל כל דקות) באמצעות החוק של למברט-בירה: c=A/(є×d), כאשר c הוא הריכוז של formazan בטווח הבינוני התגובה, A הוא ספיגת נמדד ב- ImageJ לאחר כיול; Є הוא המקדם הכחדה של formazan (16.000-585 ננומטר)8 ו- d הוא האור נוסע מרחק, אשר שווה ל עובי ממוצע התא או עובי חיתוך מקטע נומינלית (6-10 מיקרומטר ב פרוטוקול זה). הערה: לאחר ייבוש, העובי בסעיף רקמות תקטין ~ 50% מ עובי חיתוך מקטע נומינלית, אך זה לא משתקף בחישוב לעיל כי העובי חיתוך מקטע הנומינלית היא ביולוגית הרלוונטי ביותר. ניתן לקבוע את עובי ממוצע התא ואת הספרה ממדי תא preparates דבקה שקופיות זכוכית מיקרוסקופ באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית או מיקרוסקופ שדה רחב, אשר הפרוטוקולים ניתן למצוא במקום אחר. 9 , 10
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Pavlova, N. N., Thompson, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Emerging+Hallmarks+of+Cancer+Metabolism.">The Emerging Hallmarks of Cancer Metabolism.</a> Cell Metab. 23 (1), 27-47 (2016).</li><li>Van Noorden, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+enzymes+at+work:+metabolic+mapping+by+enzyme+histochemistry.">Imaging enzymes at work: metabolic mapping by enzyme histochemistry.</a> J Histochem Cytochem. 58 (6), 481-497 (2010).</li><li>Van Noorden, C. J. F., Mcmanus, L. M., Mitchell, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Pathobiology of Human Disease. , 3760-3774 (2014).</li><li>Chieco, P., Jonker, A., De Boer, B. A., Ruijter, J. M., Van Noorden, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+cytometry:+protocols+for+2D+and+3D+quantification+in+microscopic+images.">Image cytometry: protocols for 2D and 3D quantification in microscopic images.</a> Prog Histochem Cytochem. 47 (4), 211-333 (2013).</li><li>Van Noorden, C. J. F., Frederiks, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Enzyme histochemistry : a laboratory manual of current methods. , (1992).</li><li>Van Noorden, C. J. F., Butcher, R. G., Stoward, P. J., Pearse, A. G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Histochemistry, theoretical and applied. Vol 3.: enzyme histochemistry. , 355-432 (1991).</li><li>Van Noorden, C. J., Tas, J., Vogels, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytophotometry+of+glucose-6-phosphate+dehydrogenase+activity+in+individual+cells.">Cytophotometry of glucose-6-phosphate dehydrogenase activity in individual cells.</a> Histochem J. 15 (6), 583-599 (1983).</li><li>Butcher, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+measurement+in+tissue+sections+of+the+two+formazans+derived+from+nitroblue+tetrazolium+in+dehydrogenase+reactions.">The measurement in tissue sections of the two formazans derived from nitroblue tetrazolium in dehydrogenase reactions.</a> Histochem J. 10 (6), 739-744 (1978).</li><li>Matsumoto, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cell biological applications of confocal microscopy. , (2002).</li><li>Errington, R. J., White, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+dynamic+cell+volume+in+situ+by+confocal+microscopy.">Measuring dynamic cell volume in situ by confocal microscopy.</a> Methods Mol Biol. 122, 315-340 (1999).</li><li>Molenaar, R. J., Radivoyevitch, T., Maciejewski, J. P., van Noorden, C. J., Bleeker, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+driver+and+passenger+effects+of+isocitrate+dehydrogenase+1+and+2+mutations+in+oncogenesis+and+survival+prolongation.">The driver and passenger effects of isocitrate dehydrogenase 1 and 2 mutations in oncogenesis and survival prolongation.</a> Biochim Biophys Acta. 1846 (2), 326-341 (2014).</li><li>Molenaar, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radioprotection+of+IDH1-Mutated+Cancer+Cells+by+the+IDH1-Mutant+Inhibitor+AGI-5198.">Radioprotection of IDH1-Mutated Cancer Cells by the IDH1-Mutant Inhibitor AGI-5198.</a> Cancer Res. 75 (22), 4790-4802 (2015).</li><li>Khurshed, M., Molenaar, R. J., Lenting, K., Leenders, W. P., van Noorden, C. J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+silico+gene+expression+analysis+reveals+glycolysis+and+acetate+anaplerosis+in+IDH1+wild-type+glioma+and+lactate+and+glutamate+anaplerosis+in+IDH1-mutated+glioma.">In silico gene expression analysis reveals glycolysis and acetate anaplerosis in IDH1 wild-type glioma and lactate and glutamate anaplerosis in IDH1-mutated glioma.</a> Oncotarget. 8 (30), 49165-49177 (2017).</li><li>Alberts, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular biology of the cell. , (2015).</li><li>Berg, J. M., Tymoczko, J. L., Gatto, G. J., Stryer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biochemistry. , (2015).</li><li>Webb, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Enzyme nomenclature 1992 : recommendations of the Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology on the nomenclature and classification of enzymes. , (1992).</li><li>Botman, D., Tigchelaar, W., Van Noorden, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+Phosphate-activated+Glutaminase+Activity+and+Its+Kinetics+in+Mouse+Tissues+using+Metabolic+Mapping+(Quantitative+Enzyme+Histochemistry).">Determination of Phosphate-activated Glutaminase Activity and Its Kinetics in Mouse Tissues using Metabolic Mapping (Quantitative Enzyme Histochemistry).</a> J Histochem Cytochem. 62 (11), 813-826 (2014).</li><li>van Lith, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate+as+chemotactic+fuel+for+diffuse+glioma+cells:+are+they+glutamate+suckers?.">Glutamate as chemotactic fuel for diffuse glioma cells: are they glutamate suckers?.</a> Biochim Biophys Acta. 1846 (1), 66-74 (2014).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

מחקר על חילוף החומרים הסלולר כיום חווה רנסאנס כי החוקרים מבין שכעת השפעות מטבוליות מכריעים פתוגנזה וטיפול במחלות רבות. 1 יתר על כן, מחקר מטבולית מסתייעת על הזמינות הגוברת של טכניקות המספקים תחום מחקר בכלים יותר מתמיד, כולל ספקטרומטר מסה, תיוג radioisotopic מסות תהודה מגנטית גרעינית. מיפוי מטבולית היא בהחלט לא טכניקה הרומן, אך יכולתה לתת מידע משולב על הפעילות של אנזימים במצב כמעט נכון-כדי-הטבע בטכניקה זו רלוונטיים יותר מתמיד. 2
Cofactors NAD+ ו- NADP+ מצויים כל התאים החיים, אשר מציין כי dehydrogenases התעוררו מוקדם מאוד במהלך האבולוציה, יש את תפקידי המפתח בחילוף החומרים הסלולר. 14 , 15 . כיום, ישנן 523 מזורז-אנזים תגובות מסווגים dehydrogenases, מתרחשים על פני כל המינים. 16 באופן תיאורטי, הפעילות של כל דהידרוגנאז שונים התגובות יכול בנפרד ייחקרו על ידי כוונון של פרוטוקול מטבולית במיפוי המתוארים כאן. כל תגובה אנזימטי הוא ייחודי על-ידי המצע ואת cofactors הנדרשים עבור פעילותה. לכן, הפעילות של כל תגובות אנזימטיות יכול להיקבע באמצעות ניסוי מיפוי מטבולית עם המצע נאותה, cofactors של המדיום התגובה. אולם, מספר איזופורמים אנזים נבדלים לוקליזציה subcellular שלהם, למשל אחד isoform מזרז לתגובה בציטופלסמה ואילו isoform עוד פונקציות בתוך המיטוכונדריה. דוגמה בולטת היא IDH1 ו IDH2, אשר לשעבר הוא cytoplasmic האחרון מיטוכונדריאלי ויש אשר הם שני חלבונים שונים מקודד על ידי שני גנים שונים. 11 1-מתוקסי-5-methylphenazinium methylsulfate (מתוקסי-PMS) ו- 5-methylphenazinium methylsulfate (PMS) שניהם ניתן להשתמש אלקטרון להגנה על ניסויים אלה. לשעבר לא עוברים ממברנות מיטוכונדריאלי, אינו האחרון. לכן, חקירות על אנזימים מיטוכונדריאלי (למשל IDH2) כדאי להשתמש PMS ואילו חקירות על אנזימים cytosolic (למשל IDH1) כדאי להשתמש mPMS.
כמו עם טכניקות רבות, וריאציות של פרוטוקול זה, כגון באמצעות סוגים שונים של מלחי tetrazolium, למעט התוספת של PMS, אזיד הנתרן, שימוש באמצעי הרכבה מימית של, ו משתנה הדגירה ושטיפה פעמים, קיימות, יפעלו באותה מידה. היישום של מיפוי מטבולית עם מלחי tetrazolium אינה מוגבלת dehydrogenases. עם שינויים קטנים בפרוטוקול, זה יכול לשמש גם להערכת הפעילות של האנזימים לתפקד ישירות הזרם של דהידרוגנאז ב מסלול מטבולי. בעבר תארנו את העיקרון הזה עבור האנזים glutaminase,17 המתפקד ישירות הזרם של גלוטמט דהידרוגנאז בשביל glutaminolysis. 18 . בתיאוריה, אותו עיקרון ניתן ליישם אנזימים אחרים פונקציה ישירות במורד הזרם או הזרם של דהידרוגנאז למשל aconitase, הנמצא במעלה ישירות של IDH2 ו IDH3 ב החומצה tricarboxylic (TCA) מחזור. עוד וריאציה פשוטה של ריכוז המתוארות בטבלה 1 היא באמצעות ביצוע צלוחיות בינוניות הדגירה עם ריכוזים שונים של סובסטרט, קופקטור ו/או מעכב. פעולה זו מאפשרת את הדור של עקומות מנה-פעילות כפונקציה של ריכוז המצע, קופקטור ו/או עיכוב.
מבחינה טכנית, מטבולית במיפוי ניסויים לא להקל על תצפיות לא משוחד בחיי עיר פעילות האנזים, כי החוקרים צריכים לבחור ריכוז המצע ו קופקטור כי לא תשקף את המצע ורמות קופקטור כי הם נוכחים בחיי עיר. יתר על כן, השימוש צמיגה 18% PVA במדיום התגובה מגישה לשמור על מקרומולקולות ללא פגע, במקום ואת קונפורמציה, אך אוסר על דיפוזיה יעילה של ריאגנטים משקל מולקולרי נמוך דרך המדיום התגובה. 3 , 5 . לפיכך, פעילות האנזים נחוש בניסויים המתוארים כאן המשתמשות ריכוז המצע supraphysiological אינן משקפות את המצב ויוו -ריכוז סובסטרט מסוים אבל מתאים השוואות התוך ניסיוני. לכן, התוצאה של הניסויים מטבולית במיפוי הוא קיבולת הייצור (פעילות מקסימלית) של תגובה אנזימטי בהקשר של המצע ורמות קופקטור כי הם נוכחים בתוך באתרו. יתר על כן, השימוש של ריכוזים שונים של המצע ו/או cofactors ודוגמאות מרובות מאפשרת השוואה לא משוחדת של כושר הייצור המרבי (Vmax), האהדה (Km) של אנזים קופקטור/המצע תא ההכנות , רקמות או רקמות אזורים. פרמטרים אלה הם התוצאה של הסכום של האנזים חלבון ביטוי, שינויים post-translational, ההשפעה של microenvironment צפופים על הפעילות של אנזימים. לכן, מיפוי מטבולית הוא עדיין השתקפות טובה יותר של פעילות אנזים מאשר ניסויים לקבוע ביטוי חלבון או מטוהרים אנזים הפעילות במבחנה.

יסוד חיוני של פיסיולוגיה תאית היא חילוף החומרים. חילוף החומרים תאים מספק האנרגיה הדרושה עבור כל התהליכים הפיזיולוגיים, מספק את אבני הבניין של הביוסינתזה macromolecular, מווסת את הסלולר הומאוסטזיס הפסולת, מולקולות רעילים, את פירוק, מיחזור של רכיב הסלולר מיותרים או לא מתפקדת. אנזימים למכשפים כמעט כל תגובות כימיות חיוני הסלולר, ולכן הם יחידות מוטוריות בפיזיולוגיה של תאים. 1 , 2
הפעילות של אנזימים ברמות רבות, והיא לכן אנזים כמותית להסטולוגיה ו- cytochemistry (נקרא גם מיפוי מטבולית) היא השיטה המועדפת ללמוד פעילות האנזים באתרו בתוך. ברמת תעתיק, ביטוי גנים לתוך ה-mRNA מוסדר. השפעת ברגולציה של תמלול יכול להיקבע באמצעות מבחני ה-mRNA כמותית, כגון מיקרו-מערכים או רצפי RNA ישירה או מבחני ה-mRNA איכותי, כמו הכלאה מקומיים אשר נותן מידע על הטלפון הסלולרי (sub) לוקליזציה של מולקולות ה-mRNA. הדבר מאפשר להעריך את ההבדלים היחסי פעילות גנים ברמת השעתוק בין תאים. עם זאת, הפירוש ואת החוקיות של אלה מבחני ה-mRNA לגבי פעילות חילוף החומרים הוא מסובך כי תקנה מתרחשת גם ברמת mRNA, שבו רצף ויציבות של מולקולות ה-mRNA נערכים אחרי זה הוא עיבד מ- DNA. עריכה זה מסדיר תרגום isoform חלבון וכמות תרגום החלבון על הריבוזומים. בנוסף, התהליך של תרגום החלבון נשלטת ומשפיע בסופו של דבר על הביטוי האנזים ולכן פעילות. ההשפעות המשולבות של צעדים רגולטוריים הנ ל ניתן להערכה באמצעות מבחני ביטוי חלבון כמותי, כגון המערבי סופג או היפוך פאזה מיקרו-מערכים lysate חלבון או מבחני ביטוי חלבון איכותי, כגון immunocytochemistry, אימונוהיסטוכימיה, אבל טכניקות אלה להיכשל לשלב במורד הזרם רגולטוריות מתופעות כמו שינוי post-translational של חלבונים פונקציונליים ויסות אנזימים microenvironment צפוף שלהם. יתר על כן, הביטוי של אנזים עשוי בצורה גרועה לתאם עם פעילותה, כך מדידות פעילות של אנזים מטוהרים homogenates תאים או רקמות או בכל פתרונות מדולל נמצאים בשימוש נרחב עבור לימודי פעילות האנזים. עם זאת, ניסויים אלה להיכשל לשכפל את ההשפעה של הציטופלסמה ממודר צפוף או אברון על הפעילות של אנזים. יתר על כן, כל הטכניקות הנ ל לקבוע את הכמות או הלוקליזציה של mRNA או אנזים ביטוי, אך אינם מסוגלים לתת מידע מקיף על שני היבטים אלה של אנזים ביטוי, שלא לדבר על השילוב של זה מידע עם האישושים פעילות האנזים. 2 , 3 , 4
מיפוי מטבולית מאפשר את ההערכה של כל המשתנים הנ ל הקובעים את הפעילות של אנזים. זאת ועוד, מיפוי מטבולית הוא סוג של תא חי או רקמות הדמיה עם תאים ורקמות אשר נשמרים ללא פגע במהלך ניתוח כדי ליצור מצב כמעט נכון-כדי-טבע להפיק נתוני הפעילות של אנזימים. היא מייצרת תמונות המאפשרים הייסוף שני נתונים היסטוריים של המיקום של פעילות אנזים, כמו גם חזקים כימות של פעילות אנזים בתוך תא תאים או רקמות. 3 , 4 הפרוטוקולים המתוארים כאן למיפוי מטבולית של פעילות של dehydrogenases מבוססים על המדריך מעבדה של אנזים זמין פתולוגיה השיטות,5 על העקרונות של אנזים כמותית להסטולוגיה,6 ניתוח תמונה של מיפוי מטבולית כמותית. 4
Dehydrogenases הם אנזימים לבצע תגובות חמצון-חיזור להפחית cofactors קנוניים כגון NAD+, NADP+ אופנה ל- NADH, ניקוטין, FADH2, בהתאמה. תאים שלמים או קטעי רקמה cryostat אינם קבועים כימית מודגרת במדיום התגובה המכיל, בין אחרים, המצע cofactors דהידרוגנאז ספציפיים, מלח tetrazolium. לאחר מכן, זה דהידרוגנאז מבצעת פעילות קטליטית שלה ומקטינה, לדוגמה, NADP+ ל- nadph. ויה נושאת אלקטרון, 2 מולקולות nadph ל בסופו של דבר להפחית 1 tetrazolium השקופה למחצה מסיסים במים מלוחים מולקולה לתוך מולקולה 1 לא מסיס-מים כחולים formazan את זה מיד ארגונייט שוקע באתר של דהידרוגנאז. לכן, ספיגת של formazan זירז הוא מדד ישיר של הפעילות המקומית של דהידרוגנאז ולא יכול להיות שנצפו באמצעות מיקרוסקופ אור או לכמת באמצעות מיקרוסקופ אור מונוכרומטי וניתוח התמונה. ההיבט הכמותי של פרוטוקול זה מאפשר החוקרים להסיק מסקנות סטטיסטיות של מבחני אלה. בנוסף, כימות זו מקלה על הקביעה של בחיי עיר אנזים קינטי פרמטרים, כגון פעילות אנזים מקסימלי (Vmax), האהדה של מצע אנזים (Km). 3 , 4 , 5 , 6
בעת תכנון ניסוי מיפוי מטבולית, חשוב להבין כי לכל ניסוי, לכל היותר 50 שקופיות זכוכית עם הקפדה ההכנות תאים או רקמות מקטעים מומלצים כדי למזער את הזמן לעיכובים במהלך הדגירה על מנת לקבל עקבי תוצאות. זה אפשרי לעבד יותר שקופיות ו/או קומפוזיציות בינוני כאשר השלבים פרוטוקול מתבצעות בשיתוף פעולה על-ידי הנסיין אחד או יותר. יתר על כן, כמה השתנות קיימת בין ניסויים. לכן, ניסויים זהים יש לחזור לפחות 3 פעמים עם cytospins של כל הכנה תא או מקטעים של כל דגימה רקמה, הפקדים המתאימים צריכים להיכלל בכל ניסוי. תמיד להכין מדיום הדגירה שליטה בהיעדר של המצע אלא בנוכחות cofactors כדי לשלוט מכתים פעילות האנזים לא ספציפית. קנאס התוצאות מתקבלים בניסויים שבו ריכוז סובסטרט שונים/קופקטור מוחלים על רקמות מקטעים או ההכנות תא מדגם זהה, כך הנסיין יכול לבצע ניתוח השימוש קינטיקה אנזימטית עקומות מנה-פעילות.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="972">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Adenosine 5&#8242;-diphosphate sodium salt</td>
			<td style="width:343px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A2754</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">D-Glucose 6-phosphate sodium salt</td>
			<td style="width:343px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G7879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:343px;">Disodium hydrogen phosphate (NA2HPO4)</td>
			<td style="width:343px;">Merck Millipore</td>
			<td align="right" style="width:119px;">106559</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">di-Sodium succinate</td>
			<td style="width:343px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">W327700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">DL-Isocitric acid trisodium salt hydrate</td>
			<td style="width:343px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">I1252&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">D-Malic acid</td>
			<td style="width:343px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">2300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Glycerol Gelatin</td>
			<td style="width:343px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">GG1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">L-Glutamic acid</td>
			<td style="width:343px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G1251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Lithium 6-phospho-D-galactonate</td>
			<td style="width:343px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">55962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Magnesium chloride</td>
			<td style="width:343px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">methoxy-Phenazine methosulfate</td>
			<td style="width:343px;">Serva</td>
			<td style="width:119px;">28966.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Nicotinamide adenine dinucleotide</td>
			<td style="width:343px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">N0505&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate</td>
			<td style="width:343px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">NADP-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Nitrotetrazolium Blue chloride</td>
			<td style="width:343px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">N6876</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Phenazine methosulfate</td>
			<td style="width:343px;">Serva</td>
			<td style="width:119px;">32030.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Polyvinyl alcohol, fully hydrolyzed</td>
			<td style="width:343px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P1763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:343px;">Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4)</td>
			<td style="width:343px;">Merck Millipore</td>
			<td align="right" style="width:119px;">104873</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Sodium azide</td>
			<td style="width:343px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Sodium L-lactate</td>
			<td style="width:343px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">L7022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Bandpass filter</td>
			<td style="width:343px;">Edmund optics</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>https://www.edmundoptics.de/optics/optical-filters/bandpass-filters/Hard-Coated-OD-4-10nm-Bandpass-Filters/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Grey-step wedge</td>
			<td style="width:343px;">Stouffer Industries</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://www.stouffer.net/TransPage.htm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

metabolic mapping: quantitative enzyme cytochemistry and histochemistry to determine the activity of dehydrogenases in cells and tissues

שינו חילוף החומרים הסלולר מהווה סימן היכר של מחלות רבות, כולל סרטן, מחלות לב וכלי דם, זיהום. היחידות מנוע חילוף החומרים של התאים הינם אנזימים, פעילותם בכבדות מווסתות רמות, כולל תעתיק של רבים, יציבות mRNA, translational, post-translational ורמת פונקציונלי. תקנה זו מורכבת אומר כי מבחני כמותיים או הדמיה קונבנציונליים, כגון כמותיים mRNA ניסויים, לחומה המערבית אימונוהיסטוכימיה, תשואות מידע לא שלם לגבי הפעילות האולטימטיבי של אנזימים, תפקידם ו/או לוקליזציה subcellular שלהם. אנזים כמותית cytochemistry ולהסטולוגיה (קרי, מיפוי מטבולית) מציגים מידע מעמיק בחיי עיר פעילות אנזימטיות, קינטיקה, הפונקציה והאטרקציות לוקליזציה subcellular במצב כמעט נכון-כדי-טבע.
אנו מתארים פרוטוקול כדי לזהות את הפעילות של dehydrogenases, אשר הם אנזימים לבצע תגובות חמצון-חיזור כדי להפחית את cofactors כמו NAD(P)+ אופנה. תאים ומקטעים רקמות מודגרת במדיום זה ספציפית לפעילות אנזימטי של אחד דהידרוגנאז. לאחר מכן, דהידרוגנאז זה הנושא של החקירה מבצעת את פעילותה אנזימטי אתר subcellular שלו. בתגובה כימית עם המדיום התגובה, ובסופו של דבר יוצר בצבע כחול formazan באתר של הפעילות של דהידרוגנאז. ספיגת של formazan ולכן הוא מדד ישירה של הפעילות של דהידרוגנאז, ניתן לכמת באמצעות מיקרוסקופ אור מונוכרומטי וניתוח התמונה. ההיבט הכמותי של פרוטוקול זה מאפשר החוקרים להסיק מסקנות סטטיסטיות של מבחני אלה.
מלבד מחקרים תצפיתיים, ניתן להשתמש בטכניקה זו ללימודי עיכוב של אנזימים מסוימים. בהקשר זה, לימודי התועלת מן היתרונות true-כדי-טבע של מיפוי מטבולית, מתן תוצאות בחיי עיר זה עשוי להיות פיזיולוגית יותר נוגע במבחנה מחקרים עיכוב האנזים. בסך הכל, מיפוי מטבולית הוא טכניקה חיוני ללמוד חילוף החומרים ברמה הסלולר או רקמות. הטכניקה קל לאמץ, מספק מידע מעמיק, המקיפה והמשולבת מטבולית ומאפשר ניתוח כמותי מהירה.

מספר פרוטוקולים להכין הדגירה בינוני מוצגים לחקור פעילות דהידרוגנאז מסוים. עבור כל דהידרוגנאז, לפזר את ריאגנטים המפורטים בהפתרון PVA תוך שמירה על חום לפחות 37 מעלות צלזיוס. ריאגנטים צריך להיות מומס בסדר המפורט בטבלה, דהיינו nitroBT תמיד התפרקה קודם, (ז) PMS תמיד התפרקה אחרונה. כל 5 מ"ג של nitroBT הוא מומס לערבב µL 40 (אתנול µL 20 + 20 µL dimethylformamide). כל אמצעי האחסון הינם לכל 1 מ"ל של 18% PVA פתרון, אשר יכול לשמש כתם מקטעי רקמת ~ 2 או ~ 4 ההכנות תא בשקופיות זכוכית. NitroBT, NAD+, NADP+, פתרונות ADP והמצע צריך להיות עשוי טרי. נאן3, MgCl2 ו- (ז) PMS פתרונות שניתן לאחסן ב 4 מעלות צלזיוס למשך חודש אחד. 18% PVA מומס פוספט מאגר שניתן לאחסן ב 60 מעלות צלזיוס למשך שבועיים. ניתן להגדיר את ה-pH של התמיסה PVA 18% באמצעות יצירות שונות של 0.1 M אשלגן dihydrogen פוספט (2פו ח'4) ו- 0.1 M ניתרן מימן פוספט (נה2HPO4) מאגרים. התקופות המוצגות הדגירה מספקות נקודות פתיחה טובה, אך התקופות הדגירה האופטימלי תלוי המין, את סוג הרקמה ושמירה על הרקמה. באופן כללי, ההכנות התא צריך להיות מודגרות יותר רקמת מקטעים כדי להשיג רמה דומה של ייצור formazan.
דהידרוגנאז isocitrate פראי-סוג 1 ו-2 (IDH1/2) לעודד את ההמרה של isocitrate α-ketoglutarate (αKG) עם צמצום בו-זמני של NADP+ ל- nadph ל ולבסוף המיטוכונדריה, בהתאמה. אנזימים אלה יש לאחרונה להתעניינות בגלל IDH1/2 מוטציות מתרחשות בסוגים שונים של סרטן אנושי, כולל סרטן מוח ראשוניים (glioblastoma) וסרטן המעי הגס, ומציעים הזדמנות ייחודית כדי להדגים את האפשרויות של מיפוי מטבולית. מוטציות IDH1 בטל פעילות אנזים פראי-סוג IDH1, גם זירוז פעילות ניאו-אנזימטי שמוביל הייצור ואת הצטברות oncometabolite D-2 עוקבות-hydroxyglutarate (D-2 HG),11 אשר במקום אחר בהרחבה. 12 מטבולית במיפוי ניסויים הראו כי NADP+-פעילות IDH1/2 תלוי היה נמוך באופן משמעותי בתאי סרטן המעי הגס עם הפיל במשפחתית ולא משפחתית הטרוזיגוטיים IDH1 מוטציה מאשר בתאי סרטן המעי הגס שהיו IDH1 פראי-סוג (איור 1 א'). הבדל זה היה לכמת על ידי ניתוח תמונות של photomicrographs אור מונוכרומטי (איור 1B). 12
עוד דוגמה מטבולית במיפוי ניסויים הממחישים מוצג באיור 2, אשר הוא דימוי של מקטע cryostat של המוח העכבר הוזרקו תאים אנושיים גליובלסטומה. IDH1/2 הוא ספק nadph ל החשוב ביותר במוח האנושי, פעילותה היא upregulated בפראי-סוג גליובלסטומה IDH1/2 , בעוד יכולת ייצור nadph של IDH1/2 היא נמוכים בהרבה במוחם של מכרסמים. 11 איור 2A מציג את ההבדל בין NADP גבוהה+-פעילות IDH1/2 התלויים גליובלסטומה האנושי והתאים את NADP נמוך+-פעילות IDH1/2 תלוי במוח עכבר בריא. פעילות IDH1/2 הוא לכמת כמו ייצור nadph ל µmol לכל מ"ל של רקמות לדקה איור 2B.
התגובה אנזימטי של IDH1/2 היא פשוטה יחסית, אבל לקטאט דהידרוגנאז (LDH) הוא אנזים מורכב יותר מורכבים. LDH ממירה את ההמרה הפיך של לקטט פירובט עם הפחתת בו-זמני של NAD+ NADH או להיפך. הזמינות של ו לקטט פירובט, ההרכב של האנזים LDH מורכבת מכתיבה אם לקטאט בעיקר מומר פירובט (אשר על ידי LDH-B ותשואות NADH) או אם פירובט מומר בעיקר כדי לקטט (וזה על ידי LDH-A, צורכת NADH). מיפוי מטבולית 13 ניסויים מסוגל לדמיין את הפעילות של התגובה LDH-B, אך הם "עיוור" לפעילות של התגובה LDH-A כי הפקת NADH אינה מתרחשת כתוצאה מכך nitroBT לא מופחתת ל- formazan. איור 3 מראה ל- NAD+-LDH פעילות התלויים (כלומר ההמרה של לקטט לתוך פירובט) במוח האנושי סעיפים בהיעדרו של סובסטרט (איור 3 א), בנוכחות ריכוז גבוה של חומצת החלב (איור 3B ), בנוכחות לקטט 6 מ מ (איור 3C), בנוכחות ריכוז נמוך של לקטט ריכוז גבוה יותר של פירובט (דמות תלת-ממד). התוצאות של ניסויים אלה ממחישים מטבולית מיפוי שלמאחה לוכדת את זה-NAD+-פעילות LDH תלוי בסעיפים רקמות תלוי בזמינות של ו לקטט פירובט במדיום התגובה.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56843/56843fig1.jpg">
איור 1 . NADP+-פעילות IDH1/2 התלויים של תאי סרטן המעי הגס האנושי. (א) photomicrographs נציג אור מונוכרומטי של תאי סרטן המעי הגס האנושי HCT116 לאחר צביעת עבור NADP+-תלוי IDH1/2 פעילות נגד NADP isocitrate ו- 0.8 מ מ 1-10 מ מ+. גודל ברים = 50 מיקרומטר. (B) כימות ספיגת של כחול formazan המופק nitroBT על ידי NADP+-פעילות IDH1/2 התלויים בכל תא מוצג עם השימוש של אור מונוכרומטי (א) וניתוח התמונה. IDH1 קיצורים:WT/WT, isocitrate דהידרוגנאז 1 פראי-סוג; IDH1WT/MUT, isocitrate דהידרוגנאז 1 מוטציה. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56843/56843fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56843/56843fig2.jpg">
איור 2 . NADP+-פעילות תלויים IDH1/2 דוגמאות גליובלסטומה אנושי. Photomicrograph (א) נציג של מקטע מוח העכבר המכיל את מוח העכבר בריא (h), xenograft הגידול של גליובלסטומה אנושי (t) לאחר צביעת עבור NADP+-פעילות IDH1/2 תלויים בנוכחות 0.8 NADP מ מ+ , isocitrate 2 מ מ. סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר (B), האנזים פעילות כימות של אזורי מוח העכבר (h) של גליובלסטומה האנושי xenograft (t) המוצגים ב (א) באמצעות החוק של למברט-בירה. קווי שגיאה מייצגים סטיות תקן. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56843/56843fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56843/56843fig3.jpg">
איור 3 . NAD+-תלוי לקטאט דהידרוגנאז (LDH) הפעילות של דגימות המוח האנושי. Photomicrographs נציג קטעים טורי של המוח האנושי דגימות לאחר צביעת עבור NAD+-פעילות LDH התלויים (א') נגד תנאי הבקרה (ב המצע היעדרות ו פירובט, 3 מ מ NAD+ בלבד) (B) נגד 150 מ מ לקטט בהיעדרו של פירובט (C) נגד 6 מ מ לקטט בהיעדרו של פירובט ו- (ד) נגד 6 מ מ לקטט בנוכחות 18 מ מ פירובט, החומר המדכא מוצר תחרותי של התגובה לקטאט-כדי-פירובט. סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56843/56843fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>אנזים:</td>
			<td>G6PDH</td>
			<td>לקטט דהידרוגנאז</td>
			<td>SDH</td>
			<td>MDH</td>
			<td>IDH1</td>
			<td>IDH2</td>
			<td>IDH3</td>
			<td>6PGD</td>
			<td>GDH</td>
		</tr>
<tr>
<td>PVA 18% במאגר פוספט 100 מ מ</td>
			<td>1 מ"ל; pH = 7.4</td>
			<td>1 מ"ל;  pH = 7.4</td>
			<td>1 מ"ל;  pH = 8.0</td>
			<td>1 מ"ל; pH = 7.4</td>
			<td>1 מ"ל; pH = 7.4</td>
			<td>1 מ"ל; pH = 7.4</td>
			<td>1 מ"ל; pH = 7.4</td>
			<td>1 מ"ל; pH = 8.0</td>
			<td>1 מ"ל; pH = 8.0</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 מ מ NitroBT</td>
			<td>מיקס µL 40 מ ג 5</td>
			<td>מיקס µL 40 מ ג 5</td>
			<td>מיקס µL 40 מ ג 5</td>
			<td>מיקס µL 40 מ ג 5</td>
			<td>מיקס µL 40 מ ג 5</td>
			<td>מיקס µL 40 מ ג 5</td>
			<td>מיקס µL 40 מ ג 5</td>
			<td>מיקס µL 40 מ ג 5</td>
			<td>מיקס µL 40 מ ג 5</td>
		</tr>
<tr>
<td>נאן 5 מ מ3 </td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>MgCl 5 מ מ2</td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>3 מ מ NAD+</td>
			<td></td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td></td>
			<td>10 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>0.8 מ מ NADP</td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td></td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>2 מ מ ADP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>המצע</td>
			<td>10 מ מ גלוקוז-6-פוספט</td>
			<td>לקטט 150 מ מ</td>
			<td>succinate 50 מ מ</td>
			<td>חומצה מאלית 100 מ מ</td>
			<td>2 מ מ isocitrate</td>
			<td>2 מ מ isocitrate</td>
			<td>2 מ מ isocitrate</td>
			<td>10 מ מ 6-פוספו-galactonate</td>
			<td>חומצה גלוטמית 10 מ מ</td>
		</tr>
<tr>
<td>0.32 מ מ mPMS</td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td></td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>0.2 מ מ PMS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td></td>
			<td>10 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>משך הדגירה</td>
			<td>5 דקות</td>
			<td>30 דקות</td>
			<td>60 דקות</td>
			<td>60 דקות</td>
			<td>30 דקות</td>
			<td>30 דקות</td>
			<td>30 דקות</td>
			<td>10 דקות</td>
			<td>30 דקות</td>
		</tr>
</tbody></table>
טבלה 1. סקירה סכמטי של פרוטוקול מטבולית במיפוי עבור dehydrogenases. קיצורים: ADP, אדנוזין diphosphate; (ז) PMS (מתוקסי)-5-סולפט מתיל methylphenazinium; nitroBT, ניטרו tetrazolium כחול כלוריד; G6PDH, גלוקוז-6-פוספט דהידרוגנאז; LDH, לקטט דהידרוגנאז; SDH, succinate דהידרוגנאז; MDH, בנויים דהידרוגנאז; IDH, isocitrate דהידרוגנאז; 6PGD, 6-phosphogluconate דהידרוגנאז; GDH, גלוטמט דהידרוגנאז.

Watch this Scientific Journal Video about Metabolic Mapping: Quantitative Enzyme Cytochemistry and Histochemistry to Determine the Activity of Dehydrogenases in Cells and Tissues at JoVE.com

Metabolic Mapping: Quantitative Enzyme Cytochemistry and Histochemistry to Determine the Activity of Dehydrogenases in Cells and Tissues

כאן, אנו מציגים פרוטוקול זה יכול לשמש כדי להמחיש ולכמת פעילות של dehydrogenases, תאים, רקמות, קינטיקה, הפונקציה והאטרקציות לוקליזציה subcellular ברמה המיקרוסקופית.

מיפוי מטבולית: אנזים כמותית Cytochemistry ו להסטולוגיה כדי לקבוע את הפעילות של Dehydrogenases של תאים ורקמות

Altered cellular metabolism is a hallmark of many diseases, including cancer, cardiovascular diseases and infection. The metabolic motor units of cells ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Seven Steps to Stellate Cells

שבעה צעדים Stellate תאים

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

כמותי<em&gt; במבחנה</em&gt; Assay כדי למדוד הידבקות נויטרופילים לתאים מופעלים עיקריים אדם אנדותל כלי הדם בתנאים סטטיים

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Methods to Inhibit Bacterial Pyomelanin Production and Determine the Corresponding Increase in Sensitivity to Oxidative Stress

שיטות לעכב קטריאלי Pyomelanin ייצור וקבעו את הגידול המקביל ברגישות לסטרס חמצונים

Pyomelanin is an extracellular red-brown pigment produced by several bacterial and fungal species. This pigment is derived from the tyrosine catabolism ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

בידוד נויטרופילים וניתוח כדי לקבוע את תפקידם רגישות תאים לימפומה לסוכנים טיפוליים

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Optimization of a Quantitative Micro-neutralization Assay

אופטימיזציה של Assay כמותי מיקרו-נטרול

The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. ...

In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues

In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues

בחיי עיר MHC-tetramer מכתים וניתוח כמותי כדי לקבוע את מיקום שפע, ותפקיד של אנטיגן ספציפי CD8 T תאים ברקמות

T cells are critical to many immunological processes, including detecting and eliminating virus-infected cells, preventing autoimmunity, assisting in ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Overexpression וטיהור האדם<em&gt; Cis</em&gt; פרנליטרונפרפרז ב<em&gt; Escherichia coli</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

הרומן מזין ללא מערכת לייצור המוני של תאים רוצח טבעי מאתר במבחנה

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...

Histological Quantification to Determine Lung Fungal Burden in Experimental Aspergillosis

כימות היסטולוגית כדי לקבוע נטל פטרייתי ריאות ב Aspergillosis ניסיוני

The quantification of lung fungal burden is critical for the determination of the relative levels of immune protection and fungal virulence in mouse ...

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&#945;

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â±

פיתוח ובדיקת של מולקולה בודדת העדינה מערך דיגיטלי מקושרים-אנזים Immunosorbent Assay עבור אינטרפרון אנושי-α

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ...