Name: absolute quantification of plasma microrna levels in cynomolgus monkeys, using quantitative real-time reverse transcription pcr
Uploaded: 2018-02-12T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Absolute Quantification of Plasma MicroRNA Levels in Cynomolgus Monkeys, Using Quantitative Real-time Reverse Transcription PCR at JoVE.com

هذا البحث لم يتلق أي منحة محددة من وكالات التمويل في القطاعات العامة، التجاري، أو عدم الربح.

وقد أقر جميع التجارب برعاية الحيوان المؤسسية واستخدام اللجنة دايتشي سانكيو المحدودة
1. إعداد نموذج
<ol><li>جمع الدم (يقل عن 0.5 مل) من هذا السياق فخذي قرود سينومولوغوس في الأنابيب التي تحتوي على 2 ك يدتا. ملاحظة: سترات والهيبارين غير مقبولة لأن تكبح هذه التخثر اللاحقة بكر<sup class="...

<ol>
	<li>Sch&#246;ler, N., Langer, C., D&#246;hner, H., Buske, C., Kuchenbauer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+microRNAs+as+a+novel+class+of+biomarkers:+a+comprehensive+review+of+the+literature.">Serum microRNAs as a novel class of biomarkers: a comprehensive review of the literature.</a> Exp. Hematol. 38, 1126-1130 (2010).</li><li>Viereck, J., Thum, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+Noncoding+RNAs+as+Biomarkers+of+Cardiovascular+Disease+and+Injury.">Circulating Noncoding RNAs as Biomarkers of Cardiovascular Disease and Injury.</a> Circ. Res. 120 (2), 381-399 (2017).</li><li>D'Alessandra, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+microRNAs+are+new+and+sensitive+biomarkers+of+myocardial+infarction.">Circulating microRNAs are new and sensitive biomarkers of myocardial infarction.</a> Eur Heart J. 31 (22), 2765-2773 (2010).</li><li>Chen, Y., Gelfond, J. A., McManus, L. M., Shireman, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducibility+of+quantitative+RT-PCR+array+in+miRNA+expression+profiling+and+comparison+with+microarray+analysis.">Reproducibility of quantitative RT-PCR array in miRNA expression profiling and comparison with microarray analysis.</a> BMC Genomics. 10, 407 (2009).</li><li>Nassirpour, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+tubular+injury+microRNA+biomarkers+in+urine:+comparison+of+next-generation+sequencing+and+qPCR-based+profiling+platforms.">Identification of tubular injury microRNA biomarkers in urine: comparison of next-generation sequencing and qPCR-based profiling platforms.</a> BMC Genomics. 15, 485 (2014).</li><li>Derveaux, S., Vandesompele, J., Hellemans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+do+successful+gene+expression+analysis+using+real-time+PCR.">How to do successful gene expression analysis using real-time PCR.</a> Methods. 50 (4), 227-230 (2010).</li><li>Bustin, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+the+need+for+qPCR+publication+guidelines?--The+case+for+MIQE.">Why the need for qPCR publication guidelines?--The case for MIQE.</a> Methods. 50 (4), 217-226 (2010).</li><li>Kroh, E. M., Parkin, R. K., Mitchell, P. S., Tewari, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+circulating+microRNA+biomarkers+in+plasma+and+serum+using+quantitative+reverse+transcription-PCR+(qRT-PCR).">Analysis of circulating microRNA biomarkers in plasma and serum using quantitative reverse transcription-PCR (qRT-PCR).</a> Methods. 50 (4), 298-301 (2010).</li><li>Thompson, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absolute+Measurement+of+Cardiac+Injury-Induced+microRNAs+in+Biofluids+across+Multiple+Test+Sites.">Absolute Measurement of Cardiac Injury-Induced microRNAs in Biofluids across Multiple Test Sites.</a> Toxicol Sci. 154 (1), 115-125 (2016).</li><li>Iguchi, T., Niino, N., Tamai, S., Sakurai, K., Mori, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+Analysis+of+Circulating+microRNA+Specific+to+the+Liver,+Heart,+and+Skeletal+Muscle+of+Cynomolgus+Monkeys.">Comprehensive Analysis of Circulating microRNA Specific to the Liver, Heart, and Skeletal Muscle of Cynomolgus Monkeys.</a> Int. J. Toxicol. 36 (3), 220-228 (2017).</li><li>Matsuzaka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+novel+serum+biomarkers,+miR-1,+miR-133a,+and+miR-206+for+Limb-girdle+muscular+dystrophy,+Facioscapulohumeral+muscular+dystrophy,+and+Becker+muscular+dystrophy.">Three novel serum biomarkers, miR-1, miR-133a, and miR-206 for Limb-girdle muscular dystrophy, Facioscapulohumeral muscular dystrophy, and Becker muscular dystrophy.</a> Environ. Health. Prev. Med. 19 (6), 452-458 (2014).</li><li>Starkey Lewis, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+microRNAs+as+potential+markers+of+human+drug-induced+liver+injury.">Circulating microRNAs as potential markers of human drug-induced liver injury.</a> Hepatology. 54 (5), 1767-1776 (2011).</li><li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+microRNAs,+potential+biomarkers+for+drug-induced+liver+injury.">Circulating microRNAs, potential biomarkers for drug-induced liver injury.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (11), 4402-4407 (2009).</li><li>Moldovan, L., Batte, K., Wang, Y., Wisler, J., Piper, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+the+Circulating+MicroRNAs+in+Exosomes/Extracellular+Vesicles+from+Serum+or+Plasma+by+qRT-PCR.">Analyzing the Circulating MicroRNAs in Exosomes/Extracellular Vesicles from Serum or Plasma by qRT-PCR.</a> Methods Mol. Biol. 1024, 129-145 (2013).</li><li>Li, S., Chen, H., Song, J., Lee, C., Geng, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avoiding+heparin+inhibition+in+circulating+MicroRNAs+amplification.">Avoiding heparin inhibition in circulating MicroRNAs amplification.</a> Int. J. Cardiol. 207, 92-93 (2016).</li><li>Cheng, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+processing+conditions+substantially+influence+circulating+microRNA+biomarker+levels.">Plasma processing conditions substantially influence circulating microRNA biomarker levels.</a> PLoS One. 8 (6), e64795 (2013).</li><li>Serafin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+set+of+endogenous+reference+genes+for+miRNA+expression+studies+in+Parkinson's+disease+blood+samples.">Identification of a set of endogenous reference genes for miRNA expression studies in Parkinson's disease blood samples.</a> BMC Res. Notes. 7, 715 (2014).</li><li>Akiyama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+set+of+external+reference+controls/probes+that+enable+quality+assurance+between+different+microarray+platforms.">A set of external reference controls/probes that enable quality assurance between different microarray platforms.</a> Anal. Biochem. 472, 75-83 (2015).</li><li>Kirschner, M. B., van Zandwijk, N., Reid, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+microRNAs:+potential+biomarkers+in+need+of+standardized+reporting.">Cell-free microRNAs: potential biomarkers in need of standardized reporting.</a> Front Genet. 4, 56 (2013).</li><li>Malentacchi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SPIDIA-RNA:+second+external+quality+assessment+for+the+pre-analytical+phase+of+blood+samples+used+for+RNA+based+analyses.">SPIDIA-RNA: second external quality assessment for the pre-analytical phase of blood samples used for RNA based analyses.</a> PLoS One. 9 (11), e112293 (2014).</li><li>Sourvinou, I. S., Markou, A., Lianidou, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+circulating+miRNAs+in+plasma:+effect+of+preanalytical+and+analytical+parameters+on+their+isolation+and+stability.">Quantification of circulating miRNAs in plasma: effect of preanalytical and analytical parameters on their isolation and stability.</a> J Mol Diagn. 15 (6), 827-834 (2013).</li><li>Yamaura, Y., Nakajima, M., Takagi, S., Fukami, T., Tsuneyama, K., Yokoi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+microRNA+profiles+in+rat+models+of+hepatocellular+injury,+cholestasis,+and+steatosis.">Plasma microRNA profiles in rat models of hepatocellular injury, cholestasis, and steatosis.</a> PLoS One. 7 (2), e30250 (2012).</li><li>Kirschner, M. B., Edelman, J. J., Kao, S. C., Vallely, M. P., van Zandwijk, N., Reid, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Impact+of+Hemolysis+on+Cell-Free+microRNA+Biomarkers.">The Impact of Hemolysis on Cell-Free microRNA Biomarkers.</a> Front Genet. 4, 94 (2013).</li><li>Mestdagh, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+stem-loop+RT-qPCR+miRNA+expression+profiling+using+minute+amounts+of+input+RNA.">High-throughput stem-loop RT-qPCR miRNA expression profiling using minute amounts of input RNA.</a> Nucleic Acids Res. 36 (21), e143 (2008).</li><li>Pritchard, C. C., Cheng, H. H., Tewari, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+profiling:+approaches+and+considerations.">MicroRNA profiling: approaches and considerations.</a> Nat. Rev. Genet. 13 (5), 358-369 (2012).</li><li>Moldovan, L., Batte, K. E., Trgovcich, J., Wisler, J., Marsh, C. B., Piper, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodological+challenges+in+utilizing+miRNAs+as+circulating+biomarkers.">Methodological challenges in utilizing miRNAs as circulating biomarkers.</a> J. Cell. Mol. Med. 18 (3), 371-390 (2014).</li><li>Mangolini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+and+prognostic+microRNAs+in+the+serum+of+breast+cancer+patients+measured+by+droplet+digital+PCR.">Diagnostic and prognostic microRNAs in the serum of breast cancer patients measured by droplet digital PCR.</a> Biomark. Res. 3, 12 (2015).</li><li>Miotto, E., Saccenti, E., Lupini, L., Callegari, E., Negrini, M., Ferracin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+circulating+miRNAs+by+droplet+digital+PCR:+comparison+of+EvaGreen-+and+TaqMan-based+chemistries.">Quantification of circulating miRNAs by droplet digital PCR: comparison of EvaGreen- and TaqMan-based chemistries.</a> Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 23 (12), 2638-2642 (2014).</li></ol>

لدينا تقييم شامل قدم تحليلاً إحصائيا أكثر صرامة على مدى النطاق الديناميكي، الذي يبين بوضوح أن حجم الاختلاف بين العينات الفردية كانت مختلفة للغاية بين ميرناس اختبار. على الرغم من أن هذه الاختلافات يمكن أن يعزى إلى تلك الكميات الصغيرة في سوائل الجسم، تجدر الإشارة إلى أن هذه البيانات تعكس ا?...

تم استكشاف ميكرورناس (ميرناس) كالمؤشرات الحيوية للتشخيص والتشخيص لأمراض السرطان، عدد متزايد من الدراسات أو الرصد والكشف عن الأمراض الأخرى في الدراسات السريرية و nonclinical1،2،3 . الكمية في الوقت الحقيقي النسخ العكسي بكر (RT-qPCR) إحدى الطرق الأكثر شيوعاً المستخدمة لتقييم ميرناس الهدف الفردي، لأن هذا الأسلوب أكثر حساسية من ميكرواري4 وتسلسل الحمض النووي الريبي القائمة على منصات5. بشكل عام، يتم قياس التعبير ميرنا مقارنة بعينه مرجعية باستخدام أسلوب ΔCq6. وهذا النهج مناسبة للتحقيق في التغيرات الفسيولوجية في مستويات التعبير الجيني المستهدف. ومع ذلك، محدودة الكمي النسبي لتعميم ميرناس الأداة المساعدة بسبب تلك الكميات الصغيرة. وباﻹضافة إلى ذلك، الاختلاف التقني يجعل من الصعب مقارنة النتائج من الدراسات المختلفة، لأن تخصيص مختبرات مختلفة البروتوكولات التجريبية RT-قبكر بطريقة مختلفة، الأمر الذي يؤدي إلى غير متناسقة أو نتائج متناقضة حتى من 7من دراسات مختلفة.
وفي ضوء الشواغل المذكورة أعلاه، قد يكون القياس الكمي المطلق أكثر مناسبة لتقييم كميات صغيرة من ميرناس في سوائل الجسم. يستخدم الأسلوب الكمي المطلق منحنى المعياري المتولدة من تركيزات معروفة من النوكليوتيد الجيش الملكي النيبالي الاصطناعية متطابقة في تسلسل إلى المقابلة ميرنا الهدف8. الصحة، ومعهد العلوم البيئية (هيسي) اللجنة التقنية المعنية بعلم الجينوم أجرت مؤخرا دراسات شاملة لمقارنة نتائج القياسات المطلقة للبلازما ميرناس، عبر مواقع اختبار متعددة. وأظهرت النتائج أن استخدام بروتوكول قياسي للمطلقة كوانتيتيشن من ميرناس إلى نتائج قابلة للمقارنة عبر مواقع اختبار متعددة9. RT-qPCR المقايسة الطريقة الموضحة في هذه الدراسة مطابق تقريبا لبروتوكول قياسي هيسي، الذي يتضمن تحليل متعدد لميرنا أهداف متعددة، والتضخيم السابقة للمساعدة في الكشف عن ميرناس التعبير منخفضة.
في هذه الدراسة، حجم ثابت (200 ميليلتر) يدتا-البلازما من الدم التي تم جمعها من المنطلق فخذي قرود سينومولوغوس واعية (n = 50) كانت تستخدم10. البروتوكول التالي يصف الإجراءات لإعداد عينات البلازما، واستخراج ميرنا، و RT-قبكر، بما في ذلك ما قبل التضخيم. الأهم من ذلك، معلومات تقنية إضافية حول البروتوكول قد أدرج، حيث أنه يمكن أن يتم التحقق من صحة كمية ميرناس المستهدفة في العينات في تركيبة مع عملية المؤهلين تأهيلاً جيدا. أولاً، تم التحقق من صحة المنحنى المعياري لكل ميرنا لنطاق الكشف الفردية، قبل القياس الكمي في العينات البيولوجية. ثانيا، تم تقييم جودة المنهجية الحالية صورة شاملة عن طريق الاستبيان المفاهيمي قيم عنصر تحكم خارجي (cel-مير-238). ولذلك، هذا المنبر غلة أكثر من بيانات موثوق بها ومفيدة لمقارنة النتائج من دراسات مختلفة أو المختبرات.
لمحات ميرناس 8 قد أدرجت في هذا التقرير كنتائج تمثيلية من أسلوب الفحص الموضحة هنا. وقد اقترحت هذه ميرناس كما المحتملة سلامة المؤشرات الحيوية المرتبطة بإصابة الأنسجة إلى الكبد (مير-122 ومير-192)، القلب (مير-1 ومير-208a، مير-208b ومير-499a)، والهيكل العظمى والعضلات (133a مير ومير-206) في القوارض والبشر3، 11،،من1213.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="697">
	<tbody>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:216px;">BD Microtainer tube (K2EDTA)</td>
			<td style="width:195px;">Becton, Dickinson and Company</td>
			<td style="width:119px;">365974</td>
			<td style="width:167px;">For blood collection</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Eppendorf PCR Tubes, 0.2 mL</td>
			<td style="width:195px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">0030124359</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Eppendorf Safe-Lock micro test tubes&#160; 1.5 mL</td>
			<td style="width:195px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">0030120086</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Eppendorf Safe-Lock micro test tubes&#160; 2.0 mL</td>
			<td style="width:195px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">0030120094</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Synthetic oligonucleotide</td>
			<td style="width:195px;">Hokkaido System Science</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td style="width:167px;">Individual miRNA (0.2 &#956;mol,HPLC grade)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tris-EDTA Buffer&#160; (pH 8.0)</td>
			<td style="width:195px;">Nippon Gene</td>
			<td style="width:119px;">314-90021</td>
			<td style="width:167px;">TE buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Buffer RPE</td>
			<td style="width:195px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td style="width:167px;">Contents in miRNeasy mini kit&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Buffer RWT</td>
			<td style="width:195px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td style="width:167px;">Contents in miRNeasy mini kit&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">miRNeasy Mini Kit</td>
			<td style="width:195px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:119px;">217004</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nuclease-Free Water&#160;</td>
			<td style="width:195px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:119px;">129114</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">QIAzol Lysis Reagent</td>
			<td style="width:195px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td style="width:167px;">Contents in miRNeasy mini kit&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Syn-cel-miR-238-3p miScript miRNA Mimic&#160;</td>
			<td style="width:195px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:119px;">219600</td>
			<td style="width:167px;">ID:MSY0000293, 5 nmol</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">SC Adapters</td>
			<td style="width:195px;">TAIGEN Bioscience Corporation</td>
			<td style="width:119px;">S0120</td>
			<td style="width:167px;">For RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">VacEZor 36 Complete System</td>
			<td style="width:195px;">TAIGEN Bioscience Corporation</td>
			<td style="width:119px;">M3610</td>
			<td style="width:167px;">For RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">7900HT Fast Real-Time PCR System</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td style="width:119px;">4351405</td>
			<td style="width:167px;">Fast 96-Well Block</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">GeneAmp PCR System 9700</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td style="width:119px;">9700</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td style="width:119px;">4346907</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">MicroAmp Optical Adhesive Film</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td style="width:119px;">4311971</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TaqMan Fast Advanced Master Mix</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td style="width:119px;">4444557</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TaqMan MicroRNA Assays (cel-miR-238-3p)</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td style="width:119px;">4427975</td>
			<td style="width:167px;">Assay ID: 000248</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-122-5p)</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td style="width:119px;">4427975</td>
			<td style="width:167px;">Assay ID: 002245</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-133a-3p)</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td style="width:119px;">4427975</td>
			<td style="width:167px;">Assay ID: 002246</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-1-3p)</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td style="width:119px;">4427975</td>
			<td style="width:167px;">Assay ID: 002222</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-192-5p)</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td style="width:119px;">4427975</td>
			<td style="width:167px;">Assay ID: 000491</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-206)</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td style="width:119px;">4427975</td>
			<td style="width:167px;">Assay ID: 000510</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-208a-3p)</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td style="width:119px;">4427975</td>
			<td style="width:167px;">Assay ID: 000511</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-208b-3p)</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td style="width:119px;">4427975</td>
			<td style="width:167px;">Assay ID: 002290</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-499a-5p)</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td style="width:119px;">4427975</td>
			<td style="width:167px;">Assay ID: 001352</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TaqMan MicroRNA Reverse 
			Transcription Kit</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td style="width:119px;">4366597</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TaqMan PreAmp Master Mix (2&#215;)</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td style="width:119px;">4391128</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Chloroform&#160;</td>
			<td style="width:195px;">Wako Pure Chemicals</td>
			<td style="width:119px;">035-02616</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ethanol (99.5)</td>
			<td style="width:195px;">Wako Pure Chemicals</td>
			<td style="width:119px;">057-00456</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

absolute quantification of plasma microrna levels in cynomolgus monkeys, using quantitative real-time reverse transcription pcr

RT-قبكر واحد من الأساليب الأكثر شيوعاً لتقييم ميرناس الهدف الفردي. يتم قياس مستويات ميرناس عموما بالنسبة إلى عينة مرجعية. وهذا النهج مناسبة لدراسة التغيرات الفسيولوجية في مستويات التعبير الجيني المستهدف. ومع ذلك، الكمي المطلق أفضل من التحليل الإحصائي باستخدام الأفضل لإجراء تقييم شامل لمستويات التعبير الجيني. القياس الكمي المطلق هو ما زالت لا في الاستعمال الشائع. ويصف هذا التقرير وضع بروتوكول لقياس المستويات المطلقة لميرنا البلازما، استخدام الرايت قبكر مع أو بدون ما قبل التضخيم.
أعدت وحدة تخزين ثابتة (200 ميليلتر) يدتا-البلازما من الدم التي تم جمعها من هذا السياق فخذي قرود سينومولوغوس واعية (n = 50). تم استخراج الحمض النووي الريبي مجموع تستخدم نظام متاح تجارياً. تم قياس كمية ميرناس البلازما بفحوصات قبكر RT المستندة إلى التحقيق الذي يتضمن ميرنا على حدة إلى الأمام/عكس PCR التمهيدي والتحقيق. المنحنيات القياسية للقياس الكمي المطلق تم إنشاؤها باستخدام النوكليوتيد الحمض النووي الريبي الاصطناعية المتاحة تجارياً. اصطناعية cel-مير-238 كعنصر تحكم خارجي لتقييم جودة والتطبيع. ميرناس أن أظهر تقدير القيم دورة (Cq) أعلاه 35 تم تضخيم مسبقاً قبل الخطوة qPCR.
بين ميرناس 8 التي درست، مير-122 و 133a مير مير-192 كانت قابلة للكشف دون ما قبل التضخيم، حين مير-1، مير-206، ومير-499a المطلوبة قبل التضخيم بسبب مستويات منخفضة من التعبير. مير-208a ومير-208b لا يمكن كشفها حتى بعد ما قبل التضخيم. وجرى تقييم كفاءة تجهيز العينة بقيم Cq ارتفعت cel-مير-238. في هذا الأسلوب المقايسة، والتغير التقني قدرت بأقل من 3-fold والحد الأدنى للقياس الكمي (للوق) نسخة2 10/ميليلتر، بالنسبة لمعظم من ميرناس النظر.
هذا البروتوكول يوفر تقدير أفضل لكمية ميرناس البلازما، ويسمح لتقييم نوعية البيانات المناظرة من دراسات مختلفة. وأعرب عن النظر في انخفاض عدد ميرناس في سوائل الجسم، قبل التضخيم مفيد لتعزيز الكشف عن سوء ميرناس.

سير العمل للمقايسة ميرنا من الرايت قبكر والجودة أسيسمينر ويبين الشكل 1 سير العمل للمقايسة ميرنا من عينات الدم باستخدام قبكر10. يمكن التحقق من جودة التجارب بالجوف-مير-238 كعنصر تحكم خارجي. هذا وسوف تكشف عن الاختلافات التقنية في ا?...

Watch this Scientific Journal Video about Absolute Quantification of Plasma MicroRNA Levels in Cynomolgus Monkeys, Using Quantitative Real-time Reverse Transcription PCR at JoVE.com

Absolute Quantification of Plasma MicroRNA Levels in Cynomolgus Monkeys, Using Quantitative Real-time Reverse Transcription PCR

ويصف هذا التقرير وضع بروتوكول لقياس المستويات المطلقة لميرنا البلازما، استخدام النسخ العكسي في الوقت الحقيقي الكمي PCR مع أو بدون تضخيم ما قبل. هذا البروتوكول يتيح فهم أفضل لكمية ميرناس البلازما ويسمح التقييم النوعي للبيانات المناظرة من دراسات مختلفة أو المختبرات.

القياس الكمي المطلق من مستويات البلازما MicroRNA في القرود سينومولوغوس، استخدام النسخ العكسي في الوقت الحقيقي الكمي PCR

RT-qPCR is one of the most common methods to assess individual target miRNAs. MiRNAs levels are generally measured relative to a reference sample. This ...

The overall goal of this procedure is to measure the absolute levels of Plasma MicroRNAs using Quantitative Real-time Reverse Transcription PCR. This method can help assess the quantity of plasma microRNAs, even if their expression level is low. The main advantage of this technique is that the measured data can be compared with others from different studies or laboratories.The implications of this technique extend to the samples from other species because a standard curve can be generated by using the synthetic RNA or the nucleotide. This method can provide insight into translational research to investigate promising safety biomarkers. First, thaw the frozen plasma samples obtained from the femoral vein of the Cynomolgus Monkeys on ice.Transfer the Lysis reagent in Chloroform on ice for chilling before RNA extraction. Next, add 1, 000 microliters of Lysis reagent to 200 microliters of the sample. And vortex for one minute to ensure proper mixing.Then add five microliters of five nanomolar synthetic Caenorhabditis elegans microRNA and 200 microliters of chloroform to the sample. Vortex the sample for one minute to mix properly. Then, place the sample on ice for two to three minutes.Next, centrifuge the sample at 12, 000 G, for 15 minutes at four degrees Celsius. Next, carefully transfer 650 microliters of the aqueous phase to a new microtube. Then, add 975 microliters of Ethanol to the aqueous phase and pipette several times to ensure complete mixing.Transfer the sample into the corresponding column and adapter and then vacuum dry for three minutes using vacuum manifolds. Then add 200 microliters of Ethanol to the column and vacuum dry for one minute. After vacuum drying, add 800 microliters of RWT Buffer to the column and, again, vacuum dry for two minutes.Then add 800 microliters of RPE Buffer to the column and vacuum dry for two minutes. Add the RPE Buffer twice, followed by vacuum drying. Next, add 300 microliters of Ethanol to the column.After adding Ethanol, vacuum dry for one minute. Then, transfer the column in a new microtube and centrifuge the same at 12, 000 G at room temperature for one minute. After centrifugation, transfer the column to a new microtube and add 50 microliters of Nuclease-free water to it.Let the column stand at room temperature for three minutes and then centrifuge at 8, 000 G at room temperature for one minute. Finally, store the eluate at minus 80 degrees Celsius until use. To prepare a synthetic RNA Oligonucleotide Concentration that corresponds to the target microRNA, dilute the stock solution 10-fold to achieve a working solution with the highest concentration to plot the standard curves.Next, to constitute a multiplex pool of reverse transcription primers, mix equal volumes of the 20-strength primers for target microRNAs. Then, prepare the reverse transcription reaction mix. Then add 10 microliters of reverse transcription reaction mix to five microliters of RNA sample.Mix the two by pipetting several times. Then, incubate the mixture on ice for five minutes. After placing the sample in the Thermocycler, start the cycle.Once the program is over, store the reverse transcribed sample at minus 80 degrees Celsius. To constitute the multiplex assay primer pool, add equal volumes of five microliters of assay primers corresponding to target microRNAs into the tube containing Tris-EDTA buffer in the final volume of 1, 000 microliters. Next, constitute the pre-amplification reaction mix.Once the reaction mix is done, transfer 22.5 microliters of pre-amplification reaction mix to two point five microliters of reversed-transcribed sample. Then, pipette to mix the sample and pre-amplification master mix thoroughly and incubate on ice for five minutes and then leave the PCR tubes in the Thermocycler and start the run. Once the program is over, transfer all the samples at minus 80 degrees Celsius.After thawing the pre-amplified or non-pre-amplified samples, dilute it five-folds with sterile water. To generate the standard curve, do 10-fold serial dilution of the samples derived from synthetic RNA oligonucleotides. Then, constitute the quantitative PCR reaction mix in a tube kept on ice.Then add 18 microliters from the quantitative PCR reaction mix to the Fast Optical 96-Well Reaction Plates. Then add two microliters of the diluted samples into the wells. After sealing the plate with adhesive film, briefly centrifuge the sample at 500 G for 15 seconds.Then start the real-time Thermocycler program. Use a SDS software Version 2.4 that functions with the corresponding real-time thermal cycler to compute the raw copy number of each sample. Then calculate the absolute copy number from the raw copy number using Excel software.Amplification efficiency of miR-122, miR-192, and miR-133a was analyzed by plotting standard curves, which explains the relation between the log concentration versus the quantification cycle for the non-pre-amplified samples. The standard curves for miR-122, miR-192, and miR-133a show a linear relationship between quantification cycles and log concentration of the samples. Next, amplification efficiency of miR-1, miR-499a, and miR-206 was analyzed by plotting standard curves for pre-amplified samples.To analyze the amplification efficiency, the slope was computed using linear regression. The slope in standard curve A shows the absence of specific amplicons at 1, 000 copies per microliter concentration for miR-499a and miR-206. However, the non-specific amplicons were obtained at 1, 000 copies per microliter for miR-1.Here, non-pre-amplified and pre-amplified miR-206 samples were used in duplicates to derive the amplification plots. The quantification cycle values for non-pre-amplified and pre-amplified miR-206 was estimated to be 39.9, plus or minus one point nine and 27.0, plus or minus two point two, respectively, representing almost similar values between the duplicates as shown in the plots. Next, plasma microRNAs obtained from Cynomolgus monkeys were subjected to profiling to compute their absolute values.The dot plots, obtained from microRNA profiling representing their expression levels, shows that miR-122, miR-133a, and miR-192 is detectable without pre-amplification. Whereas, miR-1, miR-206, and miR-499a will require pre-amplification due to low expression levels. After watching this video, you should have a good understanding of how to measure the absolute levels of plasma microRNA, using RT-qPCR.And pre-amplification;it's useful to improve detection with small quantities of microRNAs.

Research

JoVE Journal

Biology

Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

الكمية في الوقت الحقيقي باستخدام PCR العلمية الحرارية سولاريس qPCR الفحص

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and ...

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer (Agrilus planipennis) Using Quantitative Real Time-PCR

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer Agrilus planipennis Using Quantitative Real Time-PCR

تحليل التعبير الجيني في الحفار الرماد الزمرد ( Agrilus planipennis) عن طريق ريال الكمية من الزمن - PCR

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB ...

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR (qPCR) Arrays

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR qPCR Arrays

من التنميط المسبق الجزئي الرناوات و microRNAs باستخدام الكمية في الوقت الحقيقي PCR (qPCR) صالحة

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower ...

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

تحديد ملامح التعبير الجيني في C. ايليجانس استخدام ميكروأري وPCR الوقت الحقيقي

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, ...

Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

الكمي من البروتينات عن طريق التخصيب الببتيد Immunoaffinity اقترن الطيف الكتلي

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in ...

Quantitative, Real-time Analysis of Base Excision Repair Activity in Cell Lysates Utilizing Lesion-specific Molecular Beacons

كمي، في الوقت الحقيقي وتحليل قاعدة الختان في نشاط إصلاح Lysates خلية الاستفادة من الآفات محددة منارات الجزيئية

We describe a method for the quantitative, real-time measurement of DNA glycosylase and AP endonuclease activities in cell nuclear lysates using base ...

Real-time Analyses of Retinol Transport by the Membrane Receptor of Plasma Retinol Binding Protein

في الوقت الحقيقي تحليلات النقل الريتينول بواسطة مستقبلات البروتين غشاء البلازما الريتينول ملزم

Vitamin A is essential for vision and the growth/differentiation of almost all human organs.  Plasma retinol binding protein (RBP) is the principle and ...

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

التنميط الفردية الخلايا الجذعية الجنينية البشرية من خلال الكمي RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...

Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs

يستند التحقيق، في الوقت الحقيقي PCR مقاربات للقياس الكمي من microRNAs

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

تحليل qPCRTag - إنتاجية عالية، في الوقت الحقيقي PCR الفحص لSc2.0 التنميط الجيني

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...