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Overview
1:04
Principles of 2D Gel Electrophoresis
2:37
Sample Preparation and Running Isoelectric Focusing
4:08
Running SDS-PAGE and Visualization/Analysis
5:25
Applications
7:07
Summary
2차원 겔 전기포진(2DGE)은 혼합물로부터 수천 개의 생체 분자를 해결할 수 있는 기술이다. 이 기술은 함께 결합 된 두 가지 분리 방법을 포함한다: 등전기 초점 (IEF) 및 나트륨 도데실 황산염 폴리 아크라이아미드 젤 전기 포근 (SDS-PAGE). 이것은 물리적으로 그들의 등전 점 (전기 화학 적 속성) 및 그들의 분자 량에 의해 젤의 두 축에 걸쳐 화합물을 분리합니다.
이 비디오에서 절차는 2DGE의 주요 개념과 복잡한 단백질 용액의 조성을 특성화하기위한 일반적인 절차를 다룹니다. 이 기술의 세 가지 예는 질병 개시 및 진행을 위한 바이오마커 검출, 환자에서의 모니터링 치료, 번역 후 변형(PTM) 다음 단백질 의 연구를 포함하여 응용 분야에서 도시된다.
2차원 또는 2D, 겔 전기전수는 단일 혼합물에서 수천 개의 단백질을 분리할 수 있는 두 가지 분리 방법을 활용하는 기술이다. 기술 중 하나, SDS-PAGE 또는 나트륨 도데딜 황산 폴리 아크라이알라미드 젤 전기 포충제, 완전히 복잡한 혼합물을 분리 할 수 없습니다. 2D 젤 전기전경은 SDS-PAGE를 제2 방법, 동전 적 초점 또는 IEF와 결합하여 등산 지점에 따라 분리되어 세포 용액에 잠재적으로 모든 단백질의 분해를 허용합니다. 이 비디오는 2D 젤 전기 전도의 원리, 일반적인 절차 및 생물 의학 응용 프로그램의 일부를 보여줍니다.
2D 젤 전기포는 IEF로 시작하여 첫 번째 차원으로 시작됩니다. 모든 단백질은 순 전하가 0인 등전기 점 또는 pI라고 불리는 pH 값을 가지고 있습니다. 단백질이 전기장을 받게 되면 반대전으로 전극쪽으로 이동합니다. 관심있는 샘플은 산성 및 기본 그룹을 모두 포함하는 분자, ampholytes, 내장 된 ampholytes가있는 고정 된 pH 그라데이션 또는 IPG 스트립에 로드됩니다. 전기장은 pH 그라데이션 스트립에 적용되어 단백질이 pI와 일치하는 pH 값에 도달할 때까지 이동하여 순 전하를 잃게 됩니다.
2차원을 실행하기 전에, 임베디드 단백질은 SDS로 처리되어 이를 규명하고 균일한 음전하를 제공합니다. 완료되면 IPG 스트립은 폴리아크릴아미드 젤에 놓입니다. 적용된 전기장은 단백질을 양극쪽으로 끌어들이고, 더 큰 단백질은 젤을 통해 더 느리게 움직입니다.
단백질 혼합물이 pI 및 분자량에 따라 분리되면, 프로테오메 맵은 얼룩을 사용하여 시각화되고, 관심 있는 단백질이 확인된다.
이제 우리는 2D 젤 전기 포의 원리를 논의했습니다, 전형적인 실험실 절차를 통해 가자.
실험을 수행하기 전에 단백질은 미디어로 용해되어야합니다. 시료의 수용성 은 수소 결합 상호 작용을 방해하기위한 chaotropic 에이전트의 조합과 단백질을 분해하여 달성, 단백질의 전하의 변경을 방지하기 위해 nonionic 세제, 이황화물 결합을 깰 에이전트를 감소, 버퍼. 풍부한 단백질 및 기타 분자를 방해하는 것을 제거하기 위해, 물질은 원심분리에 의해 순차적으로 추출되고, 생성된 펠릿의 수집; 그 다음에 는 실험을 방해하는 DNA를 섭취하는 데 사용되는 효소인 엔도누리스로 치료합니다.
단백질이 용해되면 IPG 스트립은 스트립 세척 용액으로 헹구고 거꾸로 건조시켜 제조됩니다. 각 스트립에는 스트립 홀더 번호가 할당됩니다. 일단 준비되면 셀룰러 추출물이 음수에서 양수 끝으로 천천히 슬라이딩 모션으로 스트립에 로드됩니다. 재수화를 목적으로, 축축한 블로팅 용지는 전극 의 상부와 젤 스트립 아래에 놓입니다. 그런 다음 IPG 스트립이 IEF 기기에 줄지어 있습니다. 높은 전류가 적용되고 단백질이 이동하기 시작합니다.
첫 번째 차원의 완성 후, SDS-PAGE용 젤은 주조 장치에서 제조된다. IPG 스트립은 SDS 함유 평형 버퍼에 얼굴을 아래로 배치하여 처리됩니다. 전기 전광 장치는 전기 포세이스 버퍼의 첨가와 함께 준비된다. 처리된 IPG 스트립은 핀셋을 사용하여 수집되고, 젤 플레이트 위에 놓고, 아가로즈 밀봉 용액으로 밀봉된다. 그런 다음 전압 소스는 가장 빠르게 움직이는 단백질이 젤 바닥에서 1cm가 될 때까지 유지되는 전기장을 적용합니다.
전기 전도가 완료 된 후, 단백질은 시각화해야합니다. 전통적으로 이것은 쿠마시 블루 또는 실버 질산염으로 염색하여 수행됩니다. 관심 있는 단백질은 겔으로부터 전이될 수 있고, 서양 얼룩 분석에 의해 분석될 수 있다.
두 번째 식별 접근법은 질량 분석법에 의해 분석하는 것보다 젤에서 단백질을 절제하고 소화합니다.
이제 절차를 검토했습니다, 2D 젤 전기 전광증에 대한 사용의 일부를 살펴 보자.
이 기술에 대 한 가장 일반적인 사용 중 하나는 질병 개시 및 진행에 관련 된 분자의 식별. 질량 분석과 결합된 2D 젤 전기전경은 건강한 단백질과 비교하여 병든 부위의 특정 단백질의 위 또는 하향 조절을 검출할 수 있습니다.
또한, 2D 겔 전기포고는 잠재적인 치료 약물에 대한 환자의 반응의 진행에 유용하다. 시편은 치료의 투여 후 다양한 시점에서 환자로부터 취할 수 있다. 이러한 방식으로, 2D 젤 전기포고증은 서양 얼룩 또는 질량 분광분석과 결합되어 염증과 같은 부정적인 반응과 관련된 단백질을 검출할 수 있다. 또는 완화 된 상태에서 단백질의 부재.
2D 젤 전기 포에 이션에 대한 또 다른 사용은 mRNA에서 번역 한 후 단백질에 추가되는 번역 후 변형, 또는 PTM에 따라 단백질 구조 및 기능의 연구에 있습니다. PTM은 단백질 신호, 유전자 발현, 또는 산화 손상을 일으키는 원인이 되는 각종 기능을 조절할 수 있습니다. 2D 젤 전기 포근은 메틸화 또는 아세틸화와 같은 수정에 민감하며, 이는 분자량뿐만 아니라 pI의 변화를 일으킬 수 있습니다.
방금 2D 젤 전기 전광에 대한 JoVE의 비디오를 시청했습니다. 이 비디오는 기술의 원리, 전형적인 실험 절차 및 생물 의학 분야에서의 응용 분야의 몇 가지 응용 분야를 설명했습니다.
시청해 주셔서 감사합니다!
2차원 겔 전기포진(2DGE)은 혼합물로부터 수천 개의 생체 분자를 해결할 수 있는 기술이다. 이 기술은 함께 결합 된 두 가지 분리 방법을 포함한다: 등전기 초점 (IEF) 및 나트륨 도데실 황산염 폴리 아크라이아미드 젤 전기 포근 (SDS-PAGE). 이것은 물리적으로 그들의 등전 점 (전기 화학 적 속성) 및 그들의 분자 량에 의해 젤의 두 축에 걸쳐 화합물을 분리합니다.
이 비디오에서 절차는 2DGE의 주요 개념과 복잡한 ?...
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