Name: generation and culturing of primary human keratinocytes from adult skin
Uploaded: 2017-12-22T14:00:00
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L’auteur tient à remercier Annette Blak Rasmussen et Kristine Moeller pour leur support technique

Le prélèvement d’échantillons de peau sur des volontaires adultes sains qui subissent une chirurgie plastique doit être approuvée par le Comité éthique dans les établissements d’accueil. Ce protocole a été approuvé par la régionale Comité éthique de région Midtjylland, à Danemark (M-20110027). La méthode décrite ici provient d’études similaires par Maciaq et al. 10 et Liu et Karasek11.
1. isolement des kératinocyt...

<ol>
	<li>Barker, J. N., Mitra, R. S., Griffiths, C. E., Dixit, V. M., Nickoloff, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keratinocytes+as+initiators+of+inflammation.">Keratinocytes as initiators of inflammation.</a> Lancet. 337 (8735), 211-214 (1991).</li><li>Nickoloff, B. J., Turka, L. 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C., Karasek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+growth+of+adult+human+epidermal+keratinocytes+in+cell+culture.">Isolation and growth of adult human epidermal keratinocytes in cell culture.</a> J Invest Dermatol. 71 (2), 157-162 (1978).</li><li>Naaldijk, Y., Friedrich-Stockigt, A., Sethe, S., Stolzing, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+different+cooling+rates+for+fibroblast+and+keratinocyte+cryopreservation.">Comparison of different cooling rates for fibroblast and keratinocyte cryopreservation.</a> J Tissue Eng Regen Med. 10 (10), E354-E364 (2016).</li><li>Otkjaer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-20+gene+expression+is+induced+by+IL-1beta+through+mitogen-activated+protein+kinase+and+NF-kappaB-dependent+mechanisms.">IL-20 gene expression is induced by IL-1beta through mitogen-activated protein kinase and NF-kappaB-dependent mechanisms.</a> J Invest Dermatol. 127 (6), 1326-1336 (2007).</li><li>Watt, F. 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Ici, nous décrivons comment isoler facilement des kératinocytes humains primaires de peau adulte et à leur culture in vitro. Ce modèle peut avoir une large demande d’enquête de la biologie cellulaire épidermique et peut être utile pour les chercheurs intéressés à étudier les maladies cutanees.
Certains des avantages du protocole décrit ici est que, contrairement aux kératinocytes isolées du prépuce néonatal obtenu à partir des mâles nouveau-nés subissant la circon...

La peau est le plus grand organe du corps humain et agit comme une barrière protectrice contre l’environnement externe. La peau est composée de deux couches principales : le derme et l’épiderme, où l’épiderme constitue la couche la plus superficielle de la peau. Le type de cellule plus abondant dans l’épiderme est les kératinocytes comprenant plus de 95 % de la masse1,de cellule2. Les kératinocytes sont maintenues à différents stades de différenciation dans l’épiderme et sont organisés en couches basales, épineux, granulaires et cornéocytaire qui correspondent à des étapes spécifiques de différenciation3. La fonction principale des kératinocytes est d’assurer l’intégrité structurale de l’épiderme, produisant ainsi une barrière intacte au monde extérieur.
Les kératinocytes représentent également la première ligne de défense contre les agents pathogènes de la peau et jouent donc un rôle important dans la réponse immunitaire innée4,5. Exposition des kératinocytes aux stimuli externes conduit à l’activation des voies de signalisation intracellulaires et par la suite, la production d’un certain nombre de différents médiateurs inflammatoires, y compris les cytokines, chimiokines et peptides antimicrobiens. Ces protéines dérivées des kératinocytes participent dans la réponse inflammatoire en recrutant et en activant des cellules immunitaires comme les cellules dendritiques, les neutrophiles et spécifiques T cellules6,7. Ainsi, parce que les kératinocytes jouent un rôle essentiel dans de nombreux processus biologiques, la justification de la technique présentée ici était de générer un modèle in vitro pour étudier la biologie de la peau. Cultures de kératinocytes primaire provenant du prépuce néonatal sont souvent utilisés pour étudier la biologie de la peau8,9. Cependant, avec la technique décrite ici, les kératinocytes des deux sexes sont obtenus résultant en une plus grande diversité biologique des cellules.
Nous présentons ici un protocole détaillé pour l’isolement et la génération des kératinocytes humains primaires de peau adulte, y compris l’entretien et la congélation des kératinocytes. L’objectif général de cette méthode est de générer des kératinocytes humains primaires pouvant servir comme modèle pour étudier la biologie cutanée in vitro.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="621">
	<tbody>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">KSFM</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">17005-034</td>
			<td style="width:167px;">Cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">KSFM supplements</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">37000-015</td>
			<td style="width:167px;">Supplements for KSFM</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">DPBS</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">14190-144</td>
			<td style="width:167px;">DPBS without Calcium and Magnesium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMSO</td>
			<td style="width:119px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D8418</td>
			<td style="width:167px;">Dimethyl sulfoxid</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Gentamycin</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">15710-049</td>
			<td style="width:167px;">Cell culture medium additive</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Sterilization filter</td>
			<td style="width:119px;">Sartorius</td>
			<td style="width:119px;">16534</td>
			<td style="width:167px;">Syringe filter with a pore size of 0.2 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypsin</td>
			<td style="width:119px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T7409</td>
			<td style="width:167px;">Used to trypsinize cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glucose</td>
			<td style="width:119px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G7528</td>
			<td style="width:167px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">RPMI-1640</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">61870-010</td>
			<td style="width:167px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">FBS</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">16000044</td>
			<td style="width:167px;">Used to inactivate trypsin</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Forceps</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td style="width:167px;">Forceps from any company can be used</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Scissors</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td style="width:167px;">Scissors from any company can be used</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Scalpel</td>
			<td style="width:119px;">Swann Morton</td>
			<td style="width:119px;">0501</td>
			<td style="width:167px;">Scalpels from any company can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">70% ethanol</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td style="width:167px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Gauze pads</td>
			<td style="width:119px;">NOBAMED</td>
			<td style="width:119px;">875420</td>
			<td style="width:167px;">Gauze pads from any provider can be used</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Foot planer</td>
			<td style="width:119px;">Credo Solingen</td>
			<td style="width:119px;">1510</td>
			<td style="width:167px;">Foot planer from any provider can be used</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Petri dishes</td>
			<td style="width:119px;">TPP</td>
			<td style="width:119px;">93100</td>
			<td style="width:167px;">Petri dishes from any provider can be used</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Metal filter</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td style="width:167px;">In-house 1 mm hole size metal filter</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:216px;">75 cm2 culture flasks</td>
			<td style="width:119px;">NUNC</td>
			<td style="width:119px;">156499</td>
			<td style="width:167px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:216px;">150 cm2 culture flasks</td>
			<td style="width:119px;">TTP</td>
			<td style="width:119px;">90151</td>
			<td style="width:167px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">0.05% Trypsin-EDTA solution</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">25300-062</td>
			<td style="width:167px;">Used to trypsinize cells when passaging</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation and culturing of primary human keratinocytes from adult skin

La fonction principale des kératinocytes est d’assurer l’intégrité structurale de l’épiderme, tout en conservant une barrière mécanique au monde extérieur. En outre, les kératinocytes jouent un rôle essentiel dans l’initiation, d’entretien et règlement de la réponse immunitaire épidermique en faisant partie du système immunitaire inné répondant aux stimulations antigéniques d’une manière rapide, non spécifique. Nous décrivons ici un protocole pour l’isolement des kératinocytes humains primaires de peau adulte et de démontrer que ces cellules répondent à la différenciation terminale induits par le calcium, telle que mesurée par une augmentation de l’expression de l’involucrin de marqueur de différenciation. En outre, nous montrons que les kératinocytes isolés sont sensibles aux induite par l’IL-1β activation des voies de signalisation intracellulaires, telle que mesurée par l’activation de la voie de p38 MAPK. Ensemble, nous décrivons une méthode d’isolement et de mise en culture de kératinocytes humains primaires de peau adulte. Parce que les kératinocytes sont le type cellulaire prédominant dans l’épiderme, cette méthode est utile pour étudier les mécanismes moléculaires de la biologie cutanée in vitro.

Différenciation terminale induits par le calcium Kératinocytes humains subissent une différenciation terminale par traitement avec du calcium14,15,16. Des kératinocytes humains primaires ont été isolées et cultivées comme décrit dans le protocole ci-dessus. Quand environ 50-60 % anastomosé, les cellules sont stimulées avec calcium (1,2 mM) ou véhicule et photos des cellules ont été prises le jou...

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Generation and Culturing of Primary Human Keratinocytes from Adult Skin

La peau agit comme une première ligne de défense contre l’environnement externe. Nous présentons une méthode pour isoler des kératinocytes humains primaires de peau adulte. Ces kératinocytes isolés sont utiles dans nombreuses configurations expérimentales et sont un modèle très approprié pour l’étude des mécanismes moléculaires de la biologie cutanée in vitro.

Génération et culture de kératinocytes humains primaires de peau adulte

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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