Name: generation and culturing of primary human keratinocytes from adult skin
Uploaded: 2017-12-22T14:00:00
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Der Autor bedankt sich bei Annette Blak Rasmussen und Kristine Moeller für ihre technische Unterstützung

Die Sammlung von Hautproben von gesunden Erwachsenen Probanden einer plastischen Operation erfordert Genehmigung durch die Ethik-Kommission in den Einrichtungen. Dieses Protokoll wurde von der regionalen ethischen Ausschuss der Region Midtjylland, Dänemark (M-20110027) genehmigt. Die hier beschriebene Methode leitet sich von ähnlichen Studien von Maciaq Et al. 10 und Liu und Karasek11.
1. Isolation von Keratinozyten aus der menschlichen ...

<ol>
	<li>Barker, J. N., Mitra, R. S., Griffiths, C. E., Dixit, V. M., Nickoloff, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keratinocytes+as+initiators+of+inflammation.">Keratinocytes as initiators of inflammation.</a> Lancet. 337 (8735), 211-214 (1991).</li><li>Nickoloff, B. J., Turka, L. 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L., Girolomoni, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keratinocytes+in+inflammatory+skin+diseases.">Keratinocytes in inflammatory skin diseases.</a> Curr Drug Targets Inflamm Allergy. 4 (3), 329-334 (2005).</li><li>Gilliet, M., Lande, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+peptides+and+self-DNA+in+autoimmune+skin+inflammation.">Antimicrobial peptides and self-DNA in autoimmune skin inflammation.</a> Curr Opin Immunol. 20 (4), 401-407 (2008).</li><li>Rohani, M. G., Pilcher, B. K., Chen, P., Parks, W. 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C., Karasek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+growth+of+adult+human+epidermal+keratinocytes+in+cell+culture.">Isolation and growth of adult human epidermal keratinocytes in cell culture.</a> J Invest Dermatol. 71 (2), 157-162 (1978).</li><li>Naaldijk, Y., Friedrich-Stockigt, A., Sethe, S., Stolzing, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+different+cooling+rates+for+fibroblast+and+keratinocyte+cryopreservation.">Comparison of different cooling rates for fibroblast and keratinocyte cryopreservation.</a> J Tissue Eng Regen Med. 10 (10), E354-E364 (2016).</li><li>Otkjaer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-20+gene+expression+is+induced+by+IL-1beta+through+mitogen-activated+protein+kinase+and+NF-kappaB-dependent+mechanisms.">IL-20 gene expression is induced by IL-1beta through mitogen-activated protein kinase and NF-kappaB-dependent mechanisms.</a> J Invest Dermatol. 127 (6), 1326-1336 (2007).</li><li>Watt, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involucrin+and+other+markers+of+keratinocyte+terminal+differentiation.">Involucrin and other markers of keratinocyte terminal differentiation.</a> J Invest Dermatol. 81 (1 Suppl), 100s-103s (1983).</li><li>Boyce, S. T., Ham, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-regulated+differentiation+of+normal+human+epidermal+keratinocytes+in+chemically+defined+clonal+culture+and+serum-free+serial+culture.">Calcium-regulated differentiation of normal human epidermal keratinocytes in chemically defined clonal culture and serum-free serial culture.</a> J Invest Dermatol. 81 (1 Suppl), 33s-40s (1983).</li><li>Hennings, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+regulation+of+growth+and+differentiation+of+mouse+epidermal+cells+in+culture.">Calcium regulation of growth and differentiation of mouse epidermal cells in culture.</a> Cell. 19 (1), 245-254 (1980).</li><li>Carlson, M. W., Alt-Holland, A., Egles, C., Garlick, J. 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H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crosstalk+between+keratinocytes+and+T+cells+in+a+3D+microenvironment:+a+model+to+study+inflammatory+skin+diseases.">Crosstalk between keratinocytes and T cells in a 3D microenvironment: a model to study inflammatory skin diseases.</a> J Invest Dermatol. 134 (3), 719-727 (2014).</li><li>Raaby, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Langerhans+cell+markers+CD1a+and+CD207+are+the+most+rapidly+responding+genes+in+lesional+psoriatic+skin+following+adalimumab+treatment.">Langerhans cell markers CD1a and CD207 are the most rapidly responding genes in lesional psoriatic skin following adalimumab treatment.</a> Exp Dermatol. , (2017).</li></ol>

Hier beschreiben wir, wie primären menschlichen Keratinozyten von Erwachsenen Haut leicht zu isolieren und sie in-vitro-Kultur. Dieses Modell kann nützlich sein für Forscher, die Interesse an einem Studium Haut-Krankheiten kann haben eine breite Anwendung für die Untersuchung der epidermalen Zelle Biologie
Einige der Vorteile von dem hier beschriebenen Protokoll ist, dass im Gegensatz zu Keratinozyten isoliert von Neugeborenen Vorhaut erhalten von Neugeborenen männlichen Beschnei...

Die Haut ist das größte Organ des menschlichen Körpers und dient als eine schützende Barriere gegen die Außenwelt. Die Haut besteht aus zwei Schichten: die Dermis und Epidermis, wo die Epidermis die äußerste Schicht der Haut bildet. Die am häufigsten vorkommenden Zelltyp in der Epidermis ist die Keratinozyten, bestehend aus mehr als 95 % der Zelle Masse1,2. Die Keratinozyten werden in verschiedenen Stadien der Differenzierung in der Epidermis und gliedern sich in basalen, abstehenden, körnige und verhornten Schichten, die bestimmte Phasen der Differenzierung3entsprechen. Die primäre Funktion der Keratinozyten soll die strukturelle Integrität der Epidermis, wodurch eine intakte Barriere nach außen zur Verfügung zu stellen.
Die Keratinozyten auch die erste Linie der Verteidigung gegen Krankheitserreger in der Haut darstellen und daher eine wichtige Rolle in der angeborenen Immunantwort4,5. Exposition der Keratinozyten auf äußere Reize führt zu einer Aktivierung der intrazellulären Signalwege und anschließend Produktion einer Reihe von verschiedenen Entzündungsmediatoren wie Zytokine, Chemokine und antimikrobielle Peptide. Diese Keratinozyten gewonnenen Proteinen beteiligt die entzündliche Reaktion durch die Rekrutierung und Aktivierung von Immunzellen wie dendritische Zellen, Neutrophilen und spezifische T-Zellen6,7. So weil Keratinozyten in vielen biologischen Prozessen eine entscheidende Rolle spielen, war das Grundprinzip hinter der hier vorgestellten Technik erzeugen eine in-Vitro -Modell, um die Haut Biologie zu studieren. Primären Keratinozyten Kulturen gewonnenen neonatale Vorhaut werden häufig verwendet, um Haut Biologie8,9zu studieren. Jedoch mit der hier beschriebenen Technik Keratinozyten aus beiden Geschlechtern ergeben sich wiederum eine höhere biologische Vielfalt der Zellen.
Hier präsentieren wir Ihnen ein detailliertes Protokoll zur Isolierung und Generierung von primären menschlichen Keratinozyten aus Erwachsenen Haut, einschließlich Wartung und das Einfrieren der Keratinozyten. Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, die primären menschlichen Keratinozyten zu generieren, die als Modell kann, zur kutanen Biologie in-vitro-Studie verwendet werden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="621">
	<tbody>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">KSFM</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">17005-034</td>
			<td style="width:167px;">Cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">KSFM supplements</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">37000-015</td>
			<td style="width:167px;">Supplements for KSFM</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">DPBS</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">14190-144</td>
			<td style="width:167px;">DPBS without Calcium and Magnesium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMSO</td>
			<td style="width:119px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D8418</td>
			<td style="width:167px;">Dimethyl sulfoxid</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Gentamycin</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">15710-049</td>
			<td style="width:167px;">Cell culture medium additive</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Sterilization filter</td>
			<td style="width:119px;">Sartorius</td>
			<td style="width:119px;">16534</td>
			<td style="width:167px;">Syringe filter with a pore size of 0.2 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypsin</td>
			<td style="width:119px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T7409</td>
			<td style="width:167px;">Used to trypsinize cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glucose</td>
			<td style="width:119px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G7528</td>
			<td style="width:167px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">RPMI-1640</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">61870-010</td>
			<td style="width:167px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">FBS</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">16000044</td>
			<td style="width:167px;">Used to inactivate trypsin</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Forceps</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td style="width:167px;">Forceps from any company can be used</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Scissors</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td style="width:167px;">Scissors from any company can be used</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Scalpel</td>
			<td style="width:119px;">Swann Morton</td>
			<td style="width:119px;">0501</td>
			<td style="width:167px;">Scalpels from any company can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">70% ethanol</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td style="width:167px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Gauze pads</td>
			<td style="width:119px;">NOBAMED</td>
			<td style="width:119px;">875420</td>
			<td style="width:167px;">Gauze pads from any provider can be used</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Foot planer</td>
			<td style="width:119px;">Credo Solingen</td>
			<td style="width:119px;">1510</td>
			<td style="width:167px;">Foot planer from any provider can be used</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Petri dishes</td>
			<td style="width:119px;">TPP</td>
			<td style="width:119px;">93100</td>
			<td style="width:167px;">Petri dishes from any provider can be used</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Metal filter</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td style="width:167px;">In-house 1 mm hole size metal filter</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:216px;">75 cm2 culture flasks</td>
			<td style="width:119px;">NUNC</td>
			<td style="width:119px;">156499</td>
			<td style="width:167px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:216px;">150 cm2 culture flasks</td>
			<td style="width:119px;">TTP</td>
			<td style="width:119px;">90151</td>
			<td style="width:167px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">0.05% Trypsin-EDTA solution</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">25300-062</td>
			<td style="width:167px;">Used to trypsinize cells when passaging</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation and culturing of primary human keratinocytes from adult skin

Die Hauptfunktion der Keratinozyten soll die strukturelle Integrität der Epidermis, eine mechanische Barriere für die Außenwelt erhalten bleibt. Darüber hinaus spielen die Keratinozyten eine wesentliche Rolle bei der Initiierung, Wartung und Regelung der epidermalen Immunantworten als Teil des angeborenen Immunsystems Reaktion auf Antigene Reize schnell und unspezifisch. Wir beschreiben hier, ein Protokoll für die Isolierung der primären menschlichen Keratinozyten von Erwachsenen Haut und zeigen, dass diese Zellen auf Kalzium-induzierte terminal Differenzierung, gemessen durch eine erhöhte Expression von Differenzierung Marker Involucrin reagieren. Darüber hinaus zeigen wir, dass die isolierte Keratinozyten, IL-1β-induzierte Aktivierung des intrazellulären Signalwege reagieren, wie durch die Aktivierung der p38 MAPK Weg gemessen. Zusammengenommen, beschreiben wir eine Methode zur Isolierung und Kultivierung von primären menschlichen Keratinozyten von Erwachsenen. Da die Keratinozyten die vorherrschenden Zelltyp in der Epidermis sind, eignet sich diese Methode zu molekulare Mechanismen in kutane Biologie in-vitro-Studie.

Kalzium-induzierte Terminal Differenzierung Menschlichen Keratinozyten unterziehen terminal Differenzierung bei der Behandlung mit Kalzium14,15,16. Primären menschlichen Keratinozyten waren isoliert und kultiviert wie im obigen Protokoll beschrieben. Bei ca. 50-60 % Zusammenfluss, die Zellen wurden mit Kalzium (1,2 mM) stimuliert oder Fahrzeug und Bilder der Zellen wurden am Tag 0, 1 und 2. <strong class="xf...

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Generation and Culturing of Primary Human Keratinocytes from Adult Skin

Die menschliche Haut wirkt als eine erste Verteidigungslinie gegen die Außenumgebung. Wir präsentieren Ihnen eine Methode zur Isolierung von primären menschlichen Keratinozyten von Erwachsenen. Diese isolierten Keratinozyten eignen sich zahlreiche Versuchsaufbauten und sind ein sehr geeignetes Modell für die Untersuchung der molekularer Mechanismen in kutane Biologie in-vitro-.

Generation und Kultivierung der primären menschlichen Keratinozyten von Erwachsenen

The main function of keratinocytes is to provide the structural integrity of the epidermis, thereby maintaining a mechanical barrier to the outside world. ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

Isolierung und Charakterisierung von Quantitative Immunzytochemische Primäre myogenen Zellen und Fibroblasten aus menschlichen Skelettmuskel

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Transfection, Selection, and Colony-picking of Human Induced Pluripotent Stem Cells TALEN-targeted with a GFP Gene into the AAVS1 Safe Harbor

Transfektion, Selektion und Colony-Picking für Menschen induzierten pluripotenten Stammzellen mit einem GFP-Gen in die AAVS1 Safe Harbor TALEN ziel

Targeted transgene addition can provide persistent gene expression while circumventing the gene silencing and insertional mutagenesis caused by viral ...

Generation of Integration-free Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Hair-derived Keratinocytes

Generation der Integration freie Menschen induzierten pluripotenten Stammzellen Mit Haarstamm Keratinozyten

Recent advances in reprogramming allow us to turn somatic cells into human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). Disease modeling using ...

Generation of Genetically Modified Organotypic Skin Cultures Using Devitalized Human Dermis

Herstellung von genetisch veränderten Organotypische Hautkulturen Mit devitalisierten Menschen Dermis

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function ...

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Isolieren von Haarfollikelstammzellen und epidermalen Keratinozyten von Dorsal Mäusehaut

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