Name: generation and culturing of primary human keratinocytes from adult skin
Uploaded: 2017-12-22T14:00:00
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L'autore desidera ringraziare Annette Blak Rasmussen e Kristine Moeller per il loro supporto tecnico

La raccolta di campioni di pelle da volontari sani adulti sottoposti a chirurgia plastica richiede l'approvazione del comitato etico nelle istituzioni dell'host. Questo protocollo è stato approvato dal regionale Comitato etico della regione Midtjylland, Danimarca (M-20110027). Il metodo qui descritto è derivato dagli studi simili da Maciaq et al. 10 e Liu e Karasek11.
1. isolamento dei cheratinociti da pelle umana
<ol>
	<li>Iniziare ...

<ol>
	<li>Barker, J. N., Mitra, R. S., Griffiths, C. E., Dixit, V. M., Nickoloff, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keratinocytes+as+initiators+of+inflammation.">Keratinocytes as initiators of inflammation.</a> Lancet. 337 (8735), 211-214 (1991).</li><li>Nickoloff, B. J., Turka, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keratinocytes:+key+immunocytes+of+the+integument.">Keratinocytes: key immunocytes of the integument.</a> Am J Pathol. 143 (2), 325-331 (1993).</li><li>Fuchs, E., Raghavan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+under+the+skin+of+epidermal+morphogenesis.">Getting under the skin of epidermal morphogenesis.</a> Nat Rev Genet. 3 (3), 199-209 (2002).</li><li>Bos, J. D., Kapsenberg, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+skin+immune+system+Its+cellular+constituents+and+their+interactions.">The skin immune system Its cellular constituents and their interactions.</a> Immunol Today. 7 (7-8), 235-240 (1986).</li><li>Nestle, F. O., Di Meglio, P., Qin, J. Z., Nickoloff, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+immune+sentinels+in+health+and+disease.">Skin immune sentinels in health and disease.</a> Nat Rev Immunol. 9 (10), 679-691 (2009).</li><li>Albanesi, C., Scarponi, C., Giustizieri, M. L., Girolomoni, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keratinocytes+in+inflammatory+skin+diseases.">Keratinocytes in inflammatory skin diseases.</a> Curr Drug Targets Inflamm Allergy. 4 (3), 329-334 (2005).</li><li>Gilliet, M., Lande, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+peptides+and+self-DNA+in+autoimmune+skin+inflammation.">Antimicrobial peptides and self-DNA in autoimmune skin inflammation.</a> Curr Opin Immunol. 20 (4), 401-407 (2008).</li><li>Rohani, M. G., Pilcher, B. K., Chen, P., Parks, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdc42+inhibits+ERK-mediated+collagenase-1+(MMP-1)+expression+in+collagen-activated+human+keratinocytes.">Cdc42 inhibits ERK-mediated collagenase-1 (MMP-1) expression in collagen-activated human keratinocytes.</a> J Invest Dermatol. 134 (5), 1230-1237 (2014).</li><li>Meephansan, J., Tsuda, H., Komine, M., Tominaga, S., Ohtsuki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+IL-33+expression+by+IFN-gamma+and+tumor+necrosis+factor-alpha+in+normal+human+epidermal+keratinocytes.">Regulation of IL-33 expression by IFN-gamma and tumor necrosis factor-alpha in normal human epidermal keratinocytes.</a> J Invest Dermatol. 132 (11), 2593-2600 (2012).</li><li>Maciag, T., Nemore, R. E., Weinstein, R., Gilchrest, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+endocrine+approach+to+the+control+of+epidermal+growth:+serum-free+cultivation+of+human+keratinocytes.">An endocrine approach to the control of epidermal growth: serum-free cultivation of human keratinocytes.</a> Science. 211 (4489), 1452-1454 (1981).</li><li>Liu, S. C., Karasek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+growth+of+adult+human+epidermal+keratinocytes+in+cell+culture.">Isolation and growth of adult human epidermal keratinocytes in cell culture.</a> J Invest Dermatol. 71 (2), 157-162 (1978).</li><li>Naaldijk, Y., Friedrich-Stockigt, A., Sethe, S., Stolzing, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+different+cooling+rates+for+fibroblast+and+keratinocyte+cryopreservation.">Comparison of different cooling rates for fibroblast and keratinocyte cryopreservation.</a> J Tissue Eng Regen Med. 10 (10), E354-E364 (2016).</li><li>Otkjaer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-20+gene+expression+is+induced+by+IL-1beta+through+mitogen-activated+protein+kinase+and+NF-kappaB-dependent+mechanisms.">IL-20 gene expression is induced by IL-1beta through mitogen-activated protein kinase and NF-kappaB-dependent mechanisms.</a> J Invest Dermatol. 127 (6), 1326-1336 (2007).</li><li>Watt, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involucrin+and+other+markers+of+keratinocyte+terminal+differentiation.">Involucrin and other markers of keratinocyte terminal differentiation.</a> J Invest Dermatol. 81 (1 Suppl), 100s-103s (1983).</li><li>Boyce, S. T., Ham, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-regulated+differentiation+of+normal+human+epidermal+keratinocytes+in+chemically+defined+clonal+culture+and+serum-free+serial+culture.">Calcium-regulated differentiation of normal human epidermal keratinocytes in chemically defined clonal culture and serum-free serial culture.</a> J Invest Dermatol. 81 (1 Suppl), 33s-40s (1983).</li><li>Hennings, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+regulation+of+growth+and+differentiation+of+mouse+epidermal+cells+in+culture.">Calcium regulation of growth and differentiation of mouse epidermal cells in culture.</a> Cell. 19 (1), 245-254 (1980).</li><li>Carlson, M. W., Alt-Holland, A., Egles, C., Garlick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+tissue+models+of+normal+and+diseased+skin.">Three-dimensional tissue models of normal and diseased skin.</a> Curr Protoc Cell Biol. , (2008).</li><li>Kamsteeg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+2+helper+T-cell+cytokines+induce+morphologic+and+molecular+characteristics+of+atopic+dermatitis+in+human+skin+equivalent.">Type 2 helper T-cell cytokines induce morphologic and molecular characteristics of atopic dermatitis in human skin equivalent.</a> Am J Pathol. 178 (5), 2091-2099 (2011).</li><li>van den Bogaard, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crosstalk+between+keratinocytes+and+T+cells+in+a+3D+microenvironment:+a+model+to+study+inflammatory+skin+diseases.">Crosstalk between keratinocytes and T cells in a 3D microenvironment: a model to study inflammatory skin diseases.</a> J Invest Dermatol. 134 (3), 719-727 (2014).</li><li>Raaby, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Langerhans+cell+markers+CD1a+and+CD207+are+the+most+rapidly+responding+genes+in+lesional+psoriatic+skin+following+adalimumab+treatment.">Langerhans cell markers CD1a and CD207 are the most rapidly responding genes in lesional psoriatic skin following adalimumab treatment.</a> Exp Dermatol. , (2017).</li></ol>

Qui, descriviamo come facilmente isolare keratinocytes umani primari da pelle adulta e come loro coltura in vitro. Questo modello può avere una vasta applicazione per indagini di biologia delle cellule epidermiche e può essere utile per i ricercatori interessati a studiare le malattie cutanee.
Alcuni dei vantaggi del protocollo descritto qui è che, contrariamente ai cheratinociti isolati da prepuzio neonatale ottenuto da neonati maschi sottoposti a circoncisione, keratinocytes uman...

La pelle è l'organo più grande del corpo umano e serve come una barriera protettiva contro l'ambiente esterno. La pelle è composta di due strati principali: il derma e l'epidermide, dove l'epidermide costituisce lo strato più esterno della pelle. Il tipo più abbondante di cellule nell'epidermide è i keratinocytes che comprende oltre il 95% delle cellule massa1,2. I cheratinociti sono tenuti nelle varie fasi di differenziazione nell'epidermide e sono organizzati in livelli basali, spinosi, granulari e cornified che corrispondono a specifiche fasi di differenziazione3. La funzione primaria dei cheratinociti è per fornire l'integrità strutturale dell'epidermide, producendo così una barriera intatta al mondo esterno.
I cheratinociti rappresentano anche la prima linea di difesa contro gli agenti patogeni della pelle e quindi giocano un ruolo importante nella risposta immunitaria innata4,5. L'esposizione dei keratinocytes agli stimoli esterni conduce all'attivazione di vie di segnalazione intracellulare e, successivamente, produzione di un numero di vari mediatori infiammatori, tra cui citochine, chemochine e peptidi antimicrobici. Queste proteine derivate da cheratinociti partecipano nella risposta infiammatoria di reclutamento e l'attivazione di cellule immunitarie come specifico T cellule6,7, neutrofili e cellule dendritiche. Così, perché keratinocytes gioca una parte cruciale in numerosi processi biologici, la spiegazione razionale dietro la tecnica presentata qui era per generare un modello in vitro per studiare la biologia della pelle. Primario del keratinocyte colture ottenute da prepuzio neonatale sono spesso utilizzati per studiare biologia pelle8,9. Tuttavia, con la tecnica qui descritta, cheratinociti da entrambi i sessi sono ottenuti con conseguente una maggiore diversità biologica delle cellule.
Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per l'isolamento e la generazione di keratinocytes umani primari da pelle adulta, compresa la manutenzione e il congelamento dei keratinocytes. L'obiettivo generale di questo metodo è quello di generare keratinocytes umani primari che può essere utilizzato come modello per studiare biologia cutanea in vitro.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="621">
	<tbody>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">KSFM</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">17005-034</td>
			<td style="width:167px;">Cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">KSFM supplements</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">37000-015</td>
			<td style="width:167px;">Supplements for KSFM</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">DPBS</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">14190-144</td>
			<td style="width:167px;">DPBS without Calcium and Magnesium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMSO</td>
			<td style="width:119px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D8418</td>
			<td style="width:167px;">Dimethyl sulfoxid</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Gentamycin</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">15710-049</td>
			<td style="width:167px;">Cell culture medium additive</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Sterilization filter</td>
			<td style="width:119px;">Sartorius</td>
			<td style="width:119px;">16534</td>
			<td style="width:167px;">Syringe filter with a pore size of 0.2 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypsin</td>
			<td style="width:119px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T7409</td>
			<td style="width:167px;">Used to trypsinize cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glucose</td>
			<td style="width:119px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G7528</td>
			<td style="width:167px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">RPMI-1640</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">61870-010</td>
			<td style="width:167px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">FBS</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">16000044</td>
			<td style="width:167px;">Used to inactivate trypsin</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Forceps</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td style="width:167px;">Forceps from any company can be used</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Scissors</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td style="width:167px;">Scissors from any company can be used</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Scalpel</td>
			<td style="width:119px;">Swann Morton</td>
			<td style="width:119px;">0501</td>
			<td style="width:167px;">Scalpels from any company can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">70% ethanol</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td style="width:167px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Gauze pads</td>
			<td style="width:119px;">NOBAMED</td>
			<td style="width:119px;">875420</td>
			<td style="width:167px;">Gauze pads from any provider can be used</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Foot planer</td>
			<td style="width:119px;">Credo Solingen</td>
			<td style="width:119px;">1510</td>
			<td style="width:167px;">Foot planer from any provider can be used</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Petri dishes</td>
			<td style="width:119px;">TPP</td>
			<td style="width:119px;">93100</td>
			<td style="width:167px;">Petri dishes from any provider can be used</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Metal filter</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td style="width:167px;">In-house 1 mm hole size metal filter</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:216px;">75 cm2 culture flasks</td>
			<td style="width:119px;">NUNC</td>
			<td style="width:119px;">156499</td>
			<td style="width:167px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:216px;">150 cm2 culture flasks</td>
			<td style="width:119px;">TTP</td>
			<td style="width:119px;">90151</td>
			<td style="width:167px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">0.05% Trypsin-EDTA solution</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">25300-062</td>
			<td style="width:167px;">Used to trypsinize cells when passaging</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation and culturing of primary human keratinocytes from adult skin

La funzione principale dei cheratinociti è per fornire l'integrità strutturale dell'epidermide, mantenendo quindi una barriera meccanica al mondo esterno. Inoltre, cheratinociti svolgono un ruolo essenziale nell'iniziazione, la manutenzione e la regolazione delle risposte immunitarie epidermiche facendo parte del sistema immunitario innato risponde agli stimoli antigenici in modo veloce, non specifico. Qui, descriviamo un protocollo per l'isolamento dei keratinocytes umani primari da pelle adulta e dimostrare che queste cellule rispondono a differenziazione terminale calcio-indotta, come misurato da un'aumentata espressione del involucrin indicatore di differenziazione. Inoltre, ci mostra che i keratinocytes isolati sono reattivi al-1 β-induced attivazione delle vie di segnalazione intracellulare come misurato tramite l'attivazione del pathway MAPK p38. Presi insieme, descriviamo un metodo per l'isolamento e coltura dei keratinocytes umani primari da pelle adulta. Poiché i cheratinociti sono il tipo predominante delle cellule nell'epidermide, questo metodo è utile per studiare i meccanismi molecolari in biologia cutanea in vitro.

Calcio-indotto differenziazione terminale Cheratinociti umani subiscono differenziazione terminale previo trattamento con calcio14,15,16. Keratinocytes umani primari è stato isolato e coltivato come descritto nel protocollo di cui sopra. Quando circa 50-60% confluenti, le cellule sono state stimolate con calcio (1,2 mM) o veicolo e immagini delle cellule sono state scattate il giorno 0, 1 e 2. <strong class=...

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Generation and Culturing of Primary Human Keratinocytes from Adult Skin

La pelle umana agisce come una prima linea di difesa contro l'ambiente esterno. Presentiamo un metodo per isolare i keratinocytes umani primari da pelle adulta. Questi keratinocytes isolato sono utili in numerose configurazioni sperimentali e sono un modello altamente adatto per studiare i meccanismi molecolari in biologia cutanea in vitro.

Generazione e la coltura dei Keratinocytes umani primari da pelle adulta

The main function of keratinocytes is to provide the structural integrity of the epidermis, thereby maintaining a mechanical barrier to the outside world. ...

Research

JoVE Journal

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