신진 대사 라벨은 세포의 기계를 조사하는 데 사용됩니다. 이것은 발생하는 생화학적 변형 및 수정을 조사하기 위해 화학 적 유사체를 사용하여 수행됩니다. 이 비디오는 신진 대사 라벨링, 일반적인 동위원소 및 광반응 라벨링 절차 및 일부 응용 프로그램의 원리를 보여줍니다.

대사 라벨링은 여러 가지 전략을 사용하여 수행 될 수있다. 여기에서 우리는 동위원소, 광반응성 및 바이오 직교 라벨을 설명합니다.

동위원소 라벨링은 화학적으로 자연적인 유사체와 동일하지만 구조에 통합된 드문 동위원소가 있는 구조용 유사체를 사용하여 수행됩니다. 이 L-리신 아날로그에서 탄소 및 질소 원자는 탄소-13 및 질소-15로 대체된다. 동위원소 유사체의 존재에서 배양 된 세포는 생화학 적 구조에 통합됩니다. 대사 산물은 세포에서 수집되고 분석을 위해 정제됩니다. 안정적인 동위원소를 가진 견본은 질량 분광법 또는 NMR 분광법과 같은 기술을 사용하여 분석됩니다. 방사성 라벨을 가진 견본은 동위원소 라벨링 프로토콜에서 입증될 액체 신경화 계수 및 엑스레이 필름을 사용하여 분석됩니다.

광반응성 라벨은 자외선에 노출될 때까지 안정되는 단백질에 통합된 기능성 그룹입니다. 기능성 그룹은 가장 가까운 단백질에 결합하는 반응성 라디칼을 형성합니다. 일반적인 예로, L-photo-leucine에는 광반응 크로스링커인 다이아디린 링이 포함되어 있습니다. 동위원소 라벨링과는 달리, 사진 반응성 화학 유사체와 자연적인 대응 사이에는 화학적 유사성이 있습니다. 세포는 유사체보다 천연 화합물을 우선적으로 통합할 수 있습니다. 따라서, 모방되는 화합물이 없는 매체에서 사진 반응성 라벨링을 수행하는 것이 중요하다. 일단 자외선에 드러나면, 표지된 단백질의 광 반응성 그룹은 불안정하고 반응성이 높으며 상호 작용하는 단백질과 상호 연결되어 단백질 복합체를 만듭니다. 교차 연결된 복합체는 SDS PAGE 및 질량 분석 방법을 사용하여 분석할 수 있는 스냅샷 역할을 합니다. 이것은 반응 종을 확인하여 신진 대사 통로에서 일어나는 무슨 반응및 결합 사이트를 결정하여 상호 작용하는 지에 대한 통찰력을 제공합니다.

생물 정형 호고날 라벨링 전략은 천연 생체 분자와 반응성이 거의 또는 전혀 없는 작은 기능성 그룹과 유사체를 활용합니다. 예를 들어, 아지드는 생화학 반응에 직교라고하는 작은 기능 성 그룹입니다. Staudinger 결찰에서, 포스핀 그룹은 아지도 그룹을 공격합니다. 이것은 아민 결합 리간드의 결과로, 분자적으로 가까운 에스테르와 반응하는 전환 상태를 산출합니다. 생체 분자에 통합된 생체 오르토고날 기능성 그룹은 형광 기능성 그룹과 같은 검출 태그 및 항원과 같은 친화성 태그로 결합될 수 있다.

이제 신진 대사 라벨에 대한 몇 가지 개념과 전략이 논의되었으므로 실험실의 과정을 살펴 보겠습니다.

대사 라벨링 실험의 첫 번째 단계는 관심있는 단백질을 수집하는 것입니다. 이를 위해, 세포는 플레이트에서 재배되고, 발현 방법은 원하는 단백질의 합성을 촉진하는 데 사용된다. 이 예에서, 류신이 풍부한 반복 키나아제, 또는 LRRK가 표현된다. 방사성 인-32를 함유한 디나트륨 인산염은 아날로그로 사용된다. 이온화 방사선으로부터 보호하기 위해 적절한 조치를 취해야 합니다. 여기에는 작업 영역 설정, 적절한 보호 장비 착용, 방사성 오염 확인 등이 포함됩니다. 일단 안전 조치가 취해지면 동위원소 유사체를 포함하는 매체가 준비됩니다. 배양으로부터의 배지는 제거되고, 동위원소 화학 유사체를 포함하는 것으로 대체된 다음 배양한다. 배양 후 세포는 lysed됩니다. 용액을 수집하고 정제합니다.

정제 후, 단백질은 SDS-PAGE를 사용하여 해결한 다음 PVDF 멤브레인으로 전달됩니다. 사인방사선은 막을 엑스레이 필름에 노출시킴으로써 수행되고 인광구 이미저를 사용하여 측정된다. 서양 블로팅은 PVDF 막에서 상대적인 단백질 수준을 측정하는 데 사용됩니다. 이 예에서는 293T 세포에서 합성된 류신이 풍부한 반복 키나아제의 인산화 수준을 측정하였다. 자동 방사선 사진은 얼마나 많은 인이 단백질에 통합되었는지 보여줍니다. 서양 얼룩은 LRRK 단백질의 수준을 해명합니다. 이미지 분석 소프트웨어는 단백질의 인산화 수준의 정량적 데이터를 얻기 위해 사용된다.

이 다음 절차에서는 광반응 라벨링이 시연됩니다. 첫째, 세포는 제조되고 배양된다. 광반응성 아날로그는 중간 로그 단계에서 셀에 추가되고 배양됩니다. 이 절차에서 p-벤조일펠헤니알라닌이 사용된다. 샘플은 간격에 걸쳐 수집되고 얼음위에 놓입니다. 샘플은 시간이 지남에 따라 생화학 적 경로의 스냅 샷을 얻기 위해 노출됩니다. 관심 있는 단백질은 SDS-PAGE를 사용하여 정제되고 해결됩니다.

포토반응성 라벨링 전략은 관심 있는 단백질과 상호 작용하는 화합물을 식별하는 데 사용되었습니다. 서양 얼룩을 가진 면역 검출은 조사된 견본에 더 높은 분자량 단백질이 존재한다는 것을 나타내는 단백질 밴드를 보여줍니다. 이들은 UV 조사 도중 생기는 단백질 단백질 상호 작용 때문에 교차 연결에서 입니다.

이제 신진 대사 라벨링 절차를 검토했습니다.

대사 라벨링 개념은 다세포 유기체로 확장될 수 있습니다. 식물은 밀봉 된 환경에서 재배되며, 안정적인 동위원소가 풍부하여 라벨이 부착 된 식물 재료를 생산합니다. 탄소-13을 함유한 이산화탄소가 인클로저에 첨가되고 질소-15는 풍부한 비료를 사용한다. 그 결과 수확된 식물 재료는 생태계에서 탄소 와 질소 사이클링에 대한 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

라벨링은 오래된 RNA로부터 새로 합성된 RNA의 분리를 가능하게 합니다. 아날로그의 초기 농도를 변경함으로써, 새로운 RNA 합성의 운동을 결정할 수 있다. 결과는 4-thiouridine의 농도가 얼마나 새로운 RNA가 전사되는지에 영향을 미친다는 것을 보여줍니다. 추가적으로, RNA에 라벨의 편화 비율은 분광광계로 직접 정량화될 수 있다.

바이오트호고날 클릭 화학작용을 사용하여 얼룩말 물고기 배아의 글리칸에 라벨을 부착할 수 있습니다. 계란은 글리칸에 알키네 라벨을 초래하는 라벨링 화합물을 주입합니다. 애벌레의 글리칸은 원하는 개발 단계에서 염료 화합물로 리게된다. 배아의 글리칸이 그 때 이미지화됩니다. 상이한 시점에서 생성된 글리칸은 배아 발달의 다른 단계에서 다른 색상을 사용하여 라벨을 부착하여 식별할 수 있다.

당신은 신진 대사 라벨에 JoVE의 비디오를 보았다. 이 비디오는 신진 대사 라벨링과 그들의 전략 뒤에 개념을 설명하고, 두 개의 일반적인 절차를 통해 갔다, 기술의 사용의 일부를 커버.

시청해 주셔서 감사합니다!