Name: using three-color single-molecule fret to study the correlation of protein interactions
Uploaded: 2018-01-30T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Three-color Single-molecule FRET to Study the Correlation of Protein Interactions at JoVE.com

이 작품은 독일 연구 재단 (INST 39/969-1)와 ERC 부여 계약 n. 681891 통해 유럽 연구 위원회에 의해 자금을.

1. 설치 및 필수 구성 요소
<ol><li>프리즘 형 TIRFM에 멀티 컬러 smFRET 측정을 수행 합니다. 2 색상 설정의 설명 정돈 간행물 주어진 대로12참조.<ol>
<li>멀티 컬러 TIRFM 생성 합니다. 일반 레이아웃은 9에 상세 하다.</li>
		<li>사용 전환, 다이오드 여기 경로 있는 기계적인 셔터의 사용을 불필요 한 렌더링 솔리드 스테이트 연속파 레이저를 펌핑.</li>
		<li>목표 입력을 후?...

<ol>
	<li>Nooren, I. M. A., Thornton, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+protein-protein+interactions.">Diversity of protein-protein interactions.</a> EMBO J. 22 (14), 3486-3492 (2003).</li><li>Marsh, J. A., Teichmann, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure,+dynamics,+assembly,+and+evolution+of+protein+complexes.">Structure, dynamics, assembly, and evolution of protein complexes.</a> Annu Rev Biochem. 84, 551-575 (2015).</li><li>Henzler-Wildman, K., Kern, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+personalities+of+proteins.">Dynamic personalities of proteins.</a> Nature. 450 (7172), 964-972 (2007).</li><li>Hohng, S., Joo, C., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Molecule+Three-Color+FRET.">Single-Molecule Three-Color FRET.</a> Biophys J. 87 (2), 1328-1337 (2004).</li><li>Person, B., Stein, I. H., Steinhauer, C., Vogelsang, J., Tinnefeld, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlated+movement+and+bending+of+nucleic+acid+structures+visualized+by+multicolor+single-molecule+spectroscopy.">Correlated movement and bending of nucleic acid structures visualized by multicolor single-molecule spectroscopy.</a> ChemPhysChem. 10 (9-10), 1455-1460 (2009).</li><li>Lee, J., Lee, S., Ragunathan, K., Joo, C., Ha, T., Hohng, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+four-color+FRET.">Single-molecule four-color FRET.</a> Angew Chem Int Ed. 49 (51), 9922-9925 (2010).</li><li>Ratzke, C., Berkemeier, F., Hugel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heat+shock+protein+90's+mechanochemical+cycle+is+dominated+by+thermal+fluctuations.">Heat shock protein 90's mechanochemical cycle is dominated by thermal fluctuations.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (1), 161-166 (2012).</li><li>Ratzke, C., Hellenkamp, B., Hugel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Four-colour+FRET+reveals+directionality+in+the+Hsp90+multicomponent+machinery.">Four-colour FRET reveals directionality in the Hsp90 multicomponent machinery.</a> Nat Commun. 5, 4192 (2014).</li><li>G&#246;tz, M., Wortmann, P., Schmid, S., Hugel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Multicolor+Single-Molecule+FRET+Approach+to+Study+Protein+Dynamics+and+Interactions+Simultaneously.">A Multicolor Single-Molecule FRET Approach to Study Protein Dynamics and Interactions Simultaneously.</a> Methods Enzymol. 581, 487-516 (2016).</li><li>Yengo, C. M., Berger, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+anisotropy+and+resonance+energy+transfer:+Powerful+tools+for+measuring+real+time+protein+dynamics+in+a+physiological+environment.">Fluorescence anisotropy and resonance energy transfer: Powerful tools for measuring real time protein dynamics in a physiological environment.</a> Curr Opin Pharmacol. 10 (6), 731-737 (2010).</li><li>Wortmann,P , ., Götz M, ., Hugel T , . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperative+Nucleotide+Binding+in+Hsp90+and+Its+Regulation+by+Aha1.">Cooperative Nucleotide Binding in Hsp90 and Its Regulation by Aha1.</a> Biophys J. 113, 1711-1718 (2017).</li><li>D&#246;rfler, T., Eilert, T., R&#246;cker, C., Nagy, J., Michaelis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+Information+from+Single-molecule+FRET+Experiments+Using+the+Fast+Nano-positioning+System.">Structural Information from Single-molecule FRET Experiments Using the Fast Nano-positioning System.</a> J Vis Exp. (120), e54782 (2017).</li><li>Stephanopoulos, N., Francis, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choosing+an+effective+protein+bioconjugation+strategy.">Choosing an effective protein bioconjugation strategy.</a> Nature chemical biology. 7 (12), 876-884 (2011).</li><li>S&#225;nchez-Rico, C., Voith von Voithenberg, L., Warner, L., Lamb, D. C., Sattler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Fluorophore+Attachment+on+Protein+Conformation+and+Dynamics+Studied+by+spFRET+and+NMR+Spectroscopy.">Effects of Fluorophore Attachment on Protein Conformation and Dynamics Studied by spFRET and NMR Spectroscopy.</a> Chemistry (Weinheim an der Bergstrasse, Germany). , (2017).</li><li>Roy, R., Hohng, S., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+single-molecule+FRET.">A practical guide to single-molecule FRET.</a> Nat Methods. 5 (6), 507-516 (2008).</li><li>Lee, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-color+alternating-laser+excitation+of+single+molecules:+monitoring+multiple+interactions+and+distances.">Three-color alternating-laser excitation of single molecules: monitoring multiple interactions and distances.</a> Biophys J. 92 (1), 303-312 (2007).</li><li>Kapanidis, A. N., Lee, N. K., Laurence, T. A., Doose, S., Margeat, E., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-aided+molecule+sorting:+analysis+of+structure+and+interactions+by+alternating-laser+excitation+of+single+molecules.">Fluorescence-aided molecule sorting: analysis of structure and interactions by alternating-laser excitation of single molecules.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (24), 8936-8941 (2004).</li><li>Hohlbein, J., Craggs, T. D., Cordes, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternating-laser+excitation:+single-molecule+FRET+and+beyond.">Alternating-laser excitation: single-molecule FRET and beyond.</a> Chem Soc Rev. 43 (4), 1156-1171 (2014).</li><li>Hellenkamp, B., Wortmann, P., Kandzia, F., Zacharias, M., Hugel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multidomain+structure+and+correlated+dynamics+determined+by+self-consistent+FRET+networks.">Multidomain structure and correlated dynamics determined by self-consistent FRET networks.</a> Nat Methods. 14, 174-180 (2017).</li><li>Rabiner, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tutorial+on+hidden+Markov+models+and+selected+applications+in+speech+recognition.">A tutorial on hidden Markov models and selected applications in speech recognition.</a> Proc IEEE. 77 (2), 257-286 (1989).</li><li>Fink, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Markov Models for Pattern Recognition. , (2014).</li><li>Giudici, P., Ryden, T., Vandekerkhove, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Likelihood-Ratio+Tests+for+Hidden+Markov+Models.">Likelihood-Ratio Tests for Hidden Markov Models.</a> Biometrics. 56 (3), 742-747 (2000).</li><li>Visser, I., Raijmakers, M. E. J., Molenaar, P. C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confidence+intervals+for+hidden+Markov+model+parameters.">Confidence intervals for hidden Markov model parameters.</a> Br J Math Stat Psychol. 53 (2), 317-327 (2000).</li><li>McKinney, S. A., Joo, C., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Single-Molecule+FRET+Trajectories+Using+Hidden+Markov+Modeling.">Analysis of Single-Molecule FRET Trajectories Using Hidden Markov Modeling.</a> Biophys J. 91 (5), 1941-1951 (2006).</li><li>Bronson, J. E., Fei, J., Hofman, J. M., Gonzalez, R. L., Wiggins, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Learning+Rates+and+States+from+Biophysical+Time+Series:+A+Bayesian+Approach+to+Model+Selection+and+Single-Molecule+FRET+Data.">Learning Rates and States from Biophysical Time Series: A Bayesian Approach to Model Selection and Single-Molecule FRET Data.</a> Biophys J. 97 (12), 3196-3205 (2009).</li><li>Greenfeld, M., Pavlichin, D. S., Mabuchi, H., Herschlag, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Molecule+Analysis+Research+Tool+(SMART):+an+integrated+approach+for+analyzing+single+molecule+data.">Single Molecule Analysis Research Tool (SMART): an integrated approach for analyzing single molecule data.</a> PLoS ONE. 7 (2), e30024 (2012).</li><li>Schmid, S., G&#246;tz, M., Hugel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Molecule+Analysis+beyond+Dwell+Times:+Demonstration+and+Assessment+in+and+out+of+Equilibrium.">Single-Molecule Analysis beyond Dwell Times: Demonstration and Assessment in and out of Equilibrium.</a> Biophys J. 111 (7), 1375-1384 (2016).</li><li>Taipale, M., Jarosz, D. F., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HSP90+at+the+hub+of+protein+homeostasis:+emerging+mechanistic+insights.">HSP90 at the hub of protein homeostasis: emerging mechanistic insights.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (7), 515-528 (2010).</li><li>Trepel, J., Mollapour, M., Giaccone, G., Neckers, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+dynamic+HSP90+complex+in+cancer.">Targeting the dynamic HSP90 complex in cancer.</a> Nat Rev Cancer. 10 (8), 537-549 (2010).</li><li>Wayne, N., Bolon, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dimerization+of+Hsp90+is+required+for+in+vivo+function.+Design+and+analysis+of+monomers+and+dimers.">Dimerization of Hsp90 is required for in vivo function. Design and analysis of monomers and dimers.</a> J Biol Chem. 282 (48), 35386-35395 (2007).</li><li>Ali, M. M. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+an+Hsp90-nucleotide-p23/Sba1+closed+chaperone+complex.">Crystal structure of an Hsp90-nucleotide-p23/Sba1 closed chaperone complex.</a> Nature. 440 (7087), 1013-1017 (2006).</li><li>Southworth, D. R., Agard, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species-dependent+ensembles+of+conserved+conformational+states+define+the+Hsp90+chaperone+ATPase+cycle.">Species-dependent ensembles of conserved conformational states define the Hsp90 chaperone ATPase cycle.</a> Mol Cell. 32 (5), 631-640 (2008).</li><li>Blanchard, S. C., Kim, H. D., Gonzalez, R. L., Puglisi, J. D., Chu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=tRNA+dynamics+on+the+ribosome+during+translation.">tRNA dynamics on the ribosome during translation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (35), 12893-12898 (2004).</li><li>Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Oxygen+Scavenging+System+for+Improvement+of+Dye+Stability+in+Single-Molecule+Fluorescence+Experiments.">An Oxygen Scavenging System for Improvement of Dye Stability in Single-Molecule Fluorescence Experiments.</a> Biophys J. 94 (5), 1826-1835 (2008).</li><li>Swoboda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+oxygen+scavenging+for+photostability+without+pH+drop+in+single-molecule+experiments.">Enzymatic oxygen scavenging for photostability without pH drop in single-molecule experiments.</a> ACS Nano. 6 (7), 6364-6369 (2012).</li><li>Rognoni, L., Stigler, J., Pelz, B., Yl&#228;nne, J., Rief, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+force+sensing+of+filamin+revealed+in+single-molecule+experiments.">Dynamic force sensing of filamin revealed in single-molecule experiments.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (48), 19679-19684 (2012).</li><li>Okumus, B., Wilson, T. J., Lilley, D. M. J., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicle+encapsulation+studies+reveal+that+single+molecule+ribozyme+heterogeneities+are+intrinsic.">Vesicle encapsulation studies reveal that single molecule ribozyme heterogeneities are intrinsic.</a> Biophys J. 87 (4), 2798-2806 (2004).</li><li>Boukobza, E., Sonnenfeld, A., Haran, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilization+in+Surface-Tethered+Lipid+Vesicles+as+a+New+Tool+for+Single+Biomolecule+Spectroscopy.">Immobilization in Surface-Tethered Lipid Vesicles as a New Tool for Single Biomolecule Spectroscopy.</a> J Phys Chem B. 105 (48), 12165-12170 (2001).</li><li>Levene, M. J., Korlach, J., Turner, S. W., Foquet, M., Craighead, H. G., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zero-mode+waveguides+for+single-molecule+analysis+at+high+concentrations.">Zero-mode waveguides for single-molecule analysis at high concentrations.</a> Science. 299 (5607), 682-686 (2003).</li><li>Panaretou, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP+binding+and+hydrolysis+are+essential+to+the+function+of+the+Hsp90+molecular+chaperone+in+vivo.">ATP binding and hydrolysis are essential to the function of the Hsp90 molecular chaperone in vivo.</a> EMBO J. 17 (16), 4829-4836 (1998).</li></ol>

우리는 복잡 한 단백질 시스템 및이 측정 분석에 대 한 단계별 설명에 대 한 3 색 smFRET 데이터를 얻기 위해 실험 절차를 제시. 이 방법은 직접 여러 상호 작용이 사이트 또는 구조적 변화 간의 상관 관계를 평가 하기 위해 고유한 가능성을 제공 합니다.
단백질에 적합 한 멀티 컬러 단일 분자 데이터를 얻기 위해 그것은 저 잡음 수준에서 재현 가능한 측정을 수행 하는 것이 중요...

많은 단백질 구조적 변화 및 광범위 한 계획1,2,3과도 연결 하 여 중재 하는 다른 분자와 동적 단지에서 그들의 기능을 충족 해야 합니다. 외부 에너지 원 (예를 들어, ATP) 이러한 동적 상호 작용 기능에서 방향으로 이어질 수 있고 궁극적으로 셀, 인생에 대 한 전제 조건에에서 비 평형 안정 상태를 유지 하는 결합.
완전히 이해 분자 기계, 구조 연구에 의해 유도 정적 설명 충분 하지 않습니다. 또한, 기본 운동 모델의 지식을 하 고 운동 속도 상수를 결정 하기 위해 필수적입니다. 여러 가지 기존 방법을 허용 관심, 예를 들면, 표면 플라스몬 공명, 이완 메서드 (예: 점프 또는 중지 흐름 분 광 판독의 2 개의 분자 사이 상호 작용을 바이너리의 역학을 공부 하는 연구원 기술), 및 핵 자기 공명. 그러나, 그들의 적용은 대부분의 경우 간단한 2-상태 시스템 (예를 들어, 하나의 바운드와 언바운드 상태) 평균 하는 대량 실험에 제한. 경우 더 많은 상태 또는 중간체 관련, 그들은 속도 상수만 복잡 한 혼합물을 얻을. 광학 또는 마그네틱 핀셋 또는 2 색 smFRET, 즉, 하나의 기증자 등 표면 움직일 샘플 1 개의 수락자 fluorophore 단일 분자 방법 구조적 변화를 관찰 하는 모든에 대 한 속도 상수를 복구할 수 있습니다. 그러나, 그것은 하나 이상의 바인딩 사이트에 영향을 미치는 상호 작용에 관해서 라면, 이러한 방법을 유지 제한 고 가능한 상관 관계는 2 개 (이상)의 상호 작용에 정보만 실험 집합 간접적 결론을 통해 액세스할 수 있습니다.
실시간에 직접, 및에서 이러한 구성 요소 간의 상호 작용을 공부 하는 기회를 제공 하는 멀티 컬러 smFRET4,5,6,7,,89 근처 생리 조건10. 이 하나는 ligand 또는 다른 단백질8,,911의 구조에 종속적 바인딩 예를 들어 조사를 허용 합니다. 여기에 제시 된 전반적인 접근은 특정 위치, 측정 챔버의 표면에 1 개의 단백질을 연결 하 고 (대 한 자세한 내용은 참조 9 프리즘 형 TIRFM에 시간이 지남에 형광 강도 추적에 대 한 관심의 protein(s)를 , 12). 다른 염료의 공간 근접 다음 에너지 전송 그들 사이에서 확인할 수 있습니다. 전략 라벨 다를 수 있습니다 단백질에서 단백질 ( 13에서 검토) 및 지침을 smFRET 측정에서 아티팩트를 피하기 위해 존재14.
이후 기증자 염료 다른 수락자 염료 멀티 컬러 smFRET 실험에서 에너지를 전송할 수 있습니다, 모든 염료의 상대 위치 한 염료 혼자15,16의 여기에서 액세스가 불가능 합니다. 하지만 레이저 여기 (알렉스17, 그리고 검토에 18) 교체와 함께에서이 방법을 초 및 하위 나노미터의 해상도에서 모든 spatio 시간적 정보를 제공 합니다.
교장, 고해상도 구조 정보 간 염료 거리를 사용 하 여 달성 될 수 있다 알렉스 멀티 컬러 smFRET 실험에서 모든 형광 강렬의 조합에서 계산. 그러나, 여기 우리가에 초점을 어디 다 색 smFRET은 필수 운동 모델의 추출 뿐만 아니라 상태 식별 및 분리. 삼각 측량에 의하여 구조 결심 "만" 원할 때 높은 신호 대 잡음 비율을 간단 하 게 2 색 smFRET 실험의 세트 수행된12,19될 수 있습니다.
우리가 사용 하는 부분 형광 (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq1.jpg">) 두 fluorophores7사이의 에너지 전송에 대 한 프록시로 서. PF 는 2 색 실험의 무서 워 효율 유사한 형광 강도에서 계산 됩니다.
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq2.jpg">
어디, <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq3v2.jpg"> 방출 채널 em 에서 강도 색 전,와 여기 이후 이며 c 는 가장 긴 파장을 가진 수락자. 검색 채널 샘플 챔버 하지만 형광 빛의 기록 다른 스펙트럼 범위에서 동일한 위치를 나타냅니다. 여기 및 방출에 대 한 동일한 식별자가이 프로토콜에 사용 됩니다 (즉, "파랑," "녹색," 및 "빨강").
실험적인 단점 때문에 측정 된 형광 강렬은 에너지 전송에 뿐만 아니라 fluorophore 및 설정 속성에 따라 달라 집니다. 두 fluorophores 사이의 진정한 에너지 전송 효율을 얻기 위하여 측정된 농도 수정 해야 합니다. 다음 절차는 참조9를 기반으로 합니다. 명백한 누설 (lk, 즉, 다른 염료에 대 한 지정 된 채널에 fluorophore에서 광자의 탐지) 및 명백한 감마 보정 요인 (ag, 즉, 염료의 형광 양자 수율 및 채널의 검출 효율) 이벤트를 표백 하는 수락자를 표시 하는 단일 분자 추적에서 얻을 수 있습니다.
모든 가능한 수락자 채널에 기증자 염료의 누설은 수락자 염료 표백 하지만 기증자 여전히 형광 기록된 형광 추적에서 모든 데이터 요소에서 계산 (<img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq4.jpg">):
<img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq5.jpg">
누설 히스토그램의 중간값은 명백한 누설 요소로 사용 됩니다. 보정 후 누설에 대 한, 명백한 감마 요소 추적의 동일한 세트에서 결정 됩니다. 그것은 기증자 채널 수락자 염료의 표백 시에 형광의 변화에 의해 수락자 채널에서 형광의 변화를 나누어 계산 됩니다.
<img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq6.jpg">
여기서 c 는 다시 긴 파장을 가진 수락자에 대 한 감지 채널입니다. 결과 분포의 중앙값 명백한 보정 요소로 사용 됩니다.
각 채널에서 수정 된 농도 의해 얻을 수 있습니다.
<img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq7.jpg">
PF 는 다음에 따라 계산 됩니다.
<img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq8.jpg">
다른 인구 PFs에 다차원 공간에서 분리 될 수 있다. 위치와 각 상태의 폭 피팅 다차원 가우스 기능 데이터에 의해 결정 됩니다. 모든 PF 흔적을 기반으로 한 글로벌 흠의 후속 최적화 관찰된 활동의 양적 설명을 제공 합니다. 속도의 심지어 작은 변화는 감지.
HMMs 시끄러운 시간 추적의 컬렉션에서 상태 모델을 유추 하는 방법을 제공 합니다. 시스템은 어떤 주어진된 시간에 실제 관측 (즉, 방출) 숨겨진된 상태는이 숨겨진된 상태20의 확률 함수 이산 집합 중 하나에 있을 여겨진다. TIRFM smFRET 데이터의 경우는 방출 확률 b나 주 나 당 연속 가우스 확률 밀도 함수에 의해 모델링 될 수 있습니다. 정기적으로 간격 둔된 개별 시간 포인트에서 다른 상태에서 전환 시간 불변 이며만 현재 상태에 따라 전환 확률에 따라 발생할 수 있습니다. 전환 행렬 A 이 전환 확률 ij 모든 숨겨진된 상태 사이 포함 되어 있습니다. 초기 상태 분포 <img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq9.jpg"> 국가 특정 확률을 제공 <img alt="Equation 10" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq10.jpg"> 시간 추적의 처음으로 포인트. 최대 가능성 접근을 사용 하 여, 가장 앞으로 뒤로 하 고 바 움-웰 치 알고리즘20,21을 사용 하 여 데이터를 설명 하기 위해 이러한 매개 변수를 최적화할 수 있습니다. 이 최대 가능성 평가 인 (MLE)을 생성합니다. 마지막으로, 가장 가능성이 관측의 궤적 생성 상태 시퀀스 Viterbi 알고리즘 유추 수 있습니다. SmFRET 데이터24,,2526 의 다른 흠 분석 달리 우리가 사용 하지 않는 한 단순한 "부드럽게" 데이터 하지만 필요 없이 데이터 집합에서 추출 운동 상태 모델의 피팅 유지 시간으로 흠 히스토그램27 흠 분석 자체 스크립트 이고르 프로 사용 하 여 이루어집니다. 코드의 구현은 참조21을 기반으로 합니다. 제공 하는 소프트웨어 키트 모범적인 데이터 우리의 웹 페이지에 따라 섹션 5와 6이이 프로토콜 (https://www.singlemolecule.uni-freiburg.de/software/3d-fret)의 순서. 전체 소프트웨어는 요청 시 이용 가능.
PF 데이터에서 포인트 시간 <-1 또는 PF > 2 어떤 검색 채널에 모든 국가 (10-200)에 대 한 최소한의 방출 확률 할당 됩니다. 이러한 데이터 요소에 인공 전환이 되지 않습니다.
5.7 단계에서 설명한 대로 방출 확률에 대 한 매개 변수 가우스 기능 3D PF 히스토그램의 적합에서 얻을 수 있습니다. 이 매개 변수는 흠의 최적화 하는 동안 고정 유지 됩니다.
제시 방법에서 초기 상태로 배포 벡터와 전환 매트릭스 사용 됩니다 세계적으로 추적의 전체 앙상블을 설명 하. 그들은 참조27에 따라 데이터 집합에서 모든 N 분자에 따라 업데이트 됩니다.
초기 상태 분포에 대 한 시작 매개 변수 (단계 5.3) PF 히스토그램의 2D 계획에서 결정 됩니다 고 전환 확률 설정 됩니다 확률 제외 0.05 동일한 상태를 유지 하기 등을 선택 하는 특정 상태를 두고 확률 화합과 정규화 됩니다.
가능성 프로 파일링 방법 모든 전환 속도21,22, 그들의 불확실성에 대 한 의미 있는 견적으로 봉사 하는 자신감을 간격 (CIs)에 게 하는 데 사용 됩니다. 특정 비율에 대 한 CI의 범위를 계산 하려면 전환 확률의 MLE 이외의 값으로 고정 됩니다. 이 테스트 모델 λ 생성 '. 가능성의 가능성 비율 (LR) 테스트 <img alt="Equation 16" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq16.jpg"> 데이터 집합 주어진 0 에 따라 수행 됩니다.
<img alt="Equation 11" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq11.jpg">
바인딩된 매개 변수 LR 3.841는 x2의 95% 논집을 초과 하는 경우에 도달 하면에 대 한 95% 신뢰-한 자유도22,23분포.
방법의 파워는 Hsp90를 사용 하 여 증명 됩니다. 풍부한 단백질이 박테리아 및 진핵생물에서 발견 되 고 세포질 긴장 응답28의 일부입니다. 그것은 암 치료29유망 약 대상입니다. Hsp90 homodimer 각 소 단위30의 N 맨끝 도메인에 하나의 뉴클레오티드 바인딩 포켓입니다. 그것은 적어도 두 개의 전역 고유 conformations, 폐쇄 하나 하나의 N-터미널 오픈, V 자형 구조19,31,32사이 영상 효과 받을 수 있습니다. 직접 dimeric 자연 Hsp90에 두 개의 뉴클레오티드 바인딩 사이트 사이 상호 작용의 문제를 발생 시킵니다.
다음에, 우리는 데이터 수집 및 효 모 Hsp90 그리고 뉴클레오티드에 3 색 smFRET 실험의 분석에 대 한 단계별 프로토콜을 제공. 붙일 레이블 앰프 PNP의 구조에 종속적 바인딩 (앰프 PNP *, ATP의 비 hydrolyzable 아날로그) 분석 된다. 설명 된 절차의 응용 프로그램 허용 뉴클레오티드 바인딩 및 동시에 연구 Hsp90의 구조적 변화 하 고 그로 인하여 Hsp90의 2 개의 뉴클레오티드 바인딩 포켓 사이 cooperativity를 보여준다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1301">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Setup</td>
			<td style="width:445px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td style="width:347px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">vibration-damped optical table&#160;&#160;</td>
			<td style="width:445px;">Newport, Irvine, CA, USA</td>
			<td style="width:167px;">RS2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">OBIS 473nm LX 75mW LASER</td>
			<td style="width:445px;">Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA</td>
			<td style="width:167px;">1185052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">OBIS 532nm LS 50mW LASER</td>
			<td style="width:445px;">Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA</td>
			<td style="width:167px;">1261779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">OBIS 594nm LS 60mW LASER</td>
			<td style="width:445px;">Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA</td>
			<td style="width:167px;">1233470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">OBIS 637nm LX 140mW LASER</td>
			<td style="width:445px;">Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA</td>
			<td style="width:167px;">1196625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">laser control unit</td>
			<td style="width:445px;">Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA</td>
			<td style="width:167px;">1234465</td>
			<td style="width:347px;">Scientific Remote</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">aspheric telescope lenses</td>
			<td style="width:445px;">Thorlabs Inc, Newton, New Jersey, USA</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>d=25.4mm, f=50mm and f=100mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">CF ex1</td>
			<td style="width:445px;">AHF analysentechnik AG, T&#252;bingen, Germany</td>
			<td style="width:167px;">ZET 473/10</td>
			<td>cleanup filter excitation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">CF ex2</td>
			<td style="width:445px;">AHF analysentechnik AG, T&#252;bingen, Germany</td>
			<td style="width:167px;">ZET 532/10</td>
			<td>cleanup filter excitation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">CF ex3</td>
			<td style="width:445px;">AHF analysentechnik AG, T&#252;bingen, Germany</td>
			<td style="width:167px;">ZET 594/10</td>
			<td>cleanup filter excitation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">CF ex4</td>
			<td style="width:445px;">Thorlabs Inc, Newton, New Jersey, USA</td>
			<td>FL635-10</td>
			<td>cleanup filter excitation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">DM ex1</td>
			<td style="width:445px;">AHF analysentechnik AG, T&#252;bingen, Germany</td>
			<td style="width:167px;">ZQ594RDC</td>
			<td>dichroic mirror excitation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">DM ex2</td>
			<td style="width:445px;">AHF analysentechnik AG, T&#252;bingen, Germany</td>
			<td style="width:167px;">570DCXR</td>
			<td>dichroic mirror excitation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">DM ex3</td>
			<td style="width:445px;">AHF analysentechnik AG, T&#252;bingen, Germany</td>
			<td style="width:167px;">ZQ491RDC</td>
			<td>dichroic mirror excitation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">AOTFnC-Vis</td>
			<td style="width:445px;">AA Opto-Electronic, Orsay, France</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">&#955;/4 plate</td>
			<td style="width:445px;">Thorlabs Inc, Newton, New Jersey, USA</td>
			<td style="width:167px;">AQWP05M-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">CFI Apo TIRF 100x</td>
			<td style="width:445px;">Nikon Instruments Inc, Melville, NY, USA</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>high-NA objective</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">piezo focus positioner MIPOS 250 CAP</td>
			<td style="width:445px;">piezosystem jena GmbH, Jena, Germany</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>Piezo Controller NV 40/1 CLE</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">piezo stepper</td>
			<td style="width:445px;">Newport, Irvine, CA, USA</td>
			<td>PZA12</td>
			<td>PZC200-KT NanoPZ Actuator Kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">achromatic aspheric lenses</td>
			<td style="width:445px;">Qioptiq Photonics GmbH &#38; Co. KG, G&#246;ttingen, Germany</td>
			<td style="width:167px;">G322-304-000</td>
			<td>d=50mm, f=200mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">adjustable optical slit</td>
			<td style="width:445px;">Owis GmbH, Staufen i. Br., Germany</td>
			<td>27.160.1212</td>
			<td>max. aperture 12 x 12 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">DM det1</td>
			<td style="width:445px;">AHF analysentechnik AG, T&#252;bingen, Germany</td>
			<td style="width:167px;">T 600 LPXR</td>
			<td>dichroic mirror detection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">DM det2</td>
			<td style="width:445px;">AHF analysentechnik AG, T&#252;bingen, Germany</td>
			<td style="width:167px;">H 560 LPXR superflat</td>
			<td>dichroic mirror detection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">DM det3</td>
			<td style="width:445px;">AHF analysentechnik AG, T&#252;bingen, Germany</td>
			<td style="width:167px;">HC BS R635</td>
			<td>dichroic mirror detection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">BP det1</td>
			<td style="width:445px;">AHF analysentechnik AG, T&#252;bingen, Germany</td>
			<td style="width:167px;">525/40 BrightLine HC</td>
			<td>bandpass filter detection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">BP det2</td>
			<td style="width:445px;">AHF analysentechnik AG, T&#252;bingen, Germany</td>
			<td style="width:167px;">586/20 BrightLine HC</td>
			<td>bandpass filter detection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">BP det3</td>
			<td style="width:445px;">AHF analysentechnik AG, T&#252;bingen, Germany</td>
			<td style="width:167px;">631/36 BrightLine HC</td>
			<td>bandpass filter detection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">BP det4</td>
			<td style="width:445px;">AHF analysentechnik AG, T&#252;bingen, Germany</td>
			<td style="width:167px;">700/75 ET Bandpass</td>
			<td>bandpass filter detection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">optical shutters detection</td>
			<td style="width:445px;">Vincent Associates, Rochester, NY, USA</td>
			<td style="width:167px;">Uniblitz VS25S2T0&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">EMCCD iXon Ultra 897</td>
			<td style="width:445px;">Andor Technology Ltd, Belfast, Northern Ireland</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">digital I/O card, PCIe-6535</td>
			<td style="width:445px;">National Instruments, Austin, Texas, USA</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">syringe pump</td>
			<td style="width:445px;">Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA</td>
			<td style="width:167px;">PHD22/2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Name</td>
			<td style="width:445px;">Company</td>
			<td style="width:167px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Flow chamber</td>
			<td style="width:445px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">quartz slides</td>
			<td style="width:445px;">G. Finkenbeiner Inc, Waltham, MA, USA</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>Spectrosil2000, h=3mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">TEGADERM film</td>
			<td style="width:445px;">3M Deutschland GmbH, Neuss, Germany</td>
			<td style="width:167px;">1626W</td>
			<td>10 x 12cm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">spray adhesive</td>
			<td style="width:445px;">3M Deutschland GmbH, Neuss, Germany</td>
			<td style="width:167px;">Photo Mount 050777</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">glycerol</td>
			<td style="width:445px;">Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany</td>
			<td style="width:167px;">Immersol G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">immersion oil</td>
			<td style="width:445px;">OLYMPUS EUROPA SE &#38; CO. KG, Hamburg, Germany</td>
			<td>IMMOIL-F30CC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">prism</td>
			<td style="width:445px;">Vogelsberger Quarzglastechnik GmbH, Hauzenberg, Germany</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>Suprasil1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">aluminium prism holder</td>
			<td style="width:445px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>custom built</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">hollow setscrews</td>
			<td style="width:445px;">Thorlabs Inc, Newton, New Jersey, USA</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>with custom drilling</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Tygon S3 E-3603 tubing</td>
			<td style="width:445px;">neoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany</td>
			<td style="width:167px;">2-4450</td>
			<td>ACF00001</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">PTFE tubing</td>
			<td style="width:445px;">Bohlender GmbH, Gr&#252;nsfeld, Germany</td>
			<td style="width:167px;">S1810-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Name</td>
			<td style="width:445px;">Company</td>
			<td style="width:167px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Sample</td>
			<td style="width:445px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">yeast Hsp90 D61C, Q385C_biotin</td>
			<td style="width:445px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>UniProt ID P02829</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Maleimide derivatives of Atto488, Atto550</td>
			<td style="width:445px;">ATTO-TEC GmbH, Siegen, Germany</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">AMP-PNP*</td>
			<td style="width:445px;">Jena Bioscience, Jena, Germany</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td style="width:347px;">&#947;-[(6-Aminohexyl)-imido]-AMP-PNP-Atto647N</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Fluospheres</td>
			<td style="width:445px;">Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td style="width:167px;">F8764</td>
			<td>amine-modified, 0.2 &#956;m, yellow-green fluorescent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Name</td>
			<td style="width:445px;">Company</td>
			<td style="width:167px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Software</td>
			<td style="width:445px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Andor Solis</td>
			<td style="width:445px;">Andor Technology Ltd, Belfast, Northern Ireland</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>version 4.30</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">LabVIEW</td>
			<td style="width:445px;">National Instruments, Austin, Texas, USA</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>version 2012, 32bit; misc. hardware control</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">MDS control software</td>
			<td style="width:445px;">AA Opto-Electronic, Orsay, France</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>version 2.03a</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Coherent Connection</td>
			<td style="width:445px;">Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>version 3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Igor Pro</td>
			<td style="width:445px;">WaveMetrics Inc, Portland, OR, USA</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>version 6.37</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using three-color single-molecule fret to study the correlation of protein interactions

단일 분자 포스터 공명 에너지 전달 (smFRET)의 생체 역학을 공부 하는 널리 사용 되 생물 기술 되고있다. 대 한 세포 단백질에 많은 분자 기계는 그들의 작업을 수행 하기 위해 기능 주기에서 상호 작용 협동자와 함께 행동 해야 합니다. 확장 다 색을 두 색 smFRET 가능 하 게 동시에 하나 이상의 상호 작용 또는 구조적 변화를 조사. 이 뿐만 아니라 smFRET 실험에 새로운 차원을 추가 하지만 그것은 또한 직접 이벤트의 시퀀스를 공부 하 고 고정된 샘플 및 총 내부 반사 형광을 사용 하 여 서로 상호 작용을 검출 하는 독특한 가능성을 제공 현미경 (TIRFM)입니다. 따라서, 멀티 컬러 smFRET 이전 unachievable 자세히 바이오 단지 양적 방법으로 공부에 대 한 다양 한 도구입니다.
여기, 단백질에 멀티 컬러 smFRET 실험의 특별 한 도전을 극복 하는 방법을 보여 줍니다. 자세한 프로토콜 데이터를 얻기 위해 및 운동 정보를 추출 하기 위한 선물이. 이 추적 선택 기준, 상태 분리 및 3D 앙상블 숨겨진 마르코프 모델 (HMM)를 사용 하 여 시끄러운 데이터에서 상태 궤적의 복구 포함 됩니다. 다른 방법에 비해 운동 정보는 복구 되지 면만 시간 히스토그램에서 하지만 직접는 흠. 최대 가능성 프레임 워크 운동 모델을 비판적으로 평가 요금에 대 한 의미 있는 불확실성을 제공 하 고 있습니다.
열 충격 단백질 90 (Hsp90) 우리의 메서드를 적용 하 여 우리는 뉴클레오티드 바인딩 및 단백질의 글로벌 구조적 변화를 풀 수 있습니다. Hsp90 이합체의 2 개의 뉴클레오티드 바인딩 포켓 사이 cooperativity를 직접 관찰할 수 있습니다.

멀티 컬러 smFRET 측정 두 개 이상의 고유한 상호 작용 사이트 간의 상관 관계의 직접적인 탐지를 허용 한다. 이 기술은 다중 구성 요소 시스템, 단백질 복합물을 조사에 고유한 렌더링 합니다. 우리는 여기에, 설명 예 역할 3 색 smFRET 실험의 프레 젠 테이 션에 초점.
방법의 일반적인 워크플로 그림 1에 표시 ...

Watch this Scientific Journal Video about Using Three-color Single-molecule FRET to Study the Correlation of Protein Interactions at JoVE.com

Using Three-color Single-molecule FRET to Study the Correlation of Protein Interactions

3 색 단일 분자 무서 워를 사용 하 여 단백질 상호 작용의 상관 관계를 연구 하

여기, 우리는 프로토콜 3 색 smFRET 데이터 및 3D 앙상블 숨겨진 마르코프 모델의 분석을 제시. 이 방법을 과학자 들은 복잡 한 단백질 시스템, cooperativity 또는 서로 상호 작용을 포함 하 여에서 운동 정보를 추출할 수 있습니다.

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) has become a widely used biophysical technique to study the dynamics of biomolecules. For ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Fluorescence Anisotropy as a Tool to Study Protein-protein Interactions

단백질 - 단백질 상호 작용을 연구하는 도구로 형광 이방성

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is ...

연구

생화학

Structural Information from Single-molecule FRET Experiments Using the Fast Nano-positioning System

단일 분자의 구조 정보는 고속 나노 측위 시스템을 사용하여 실험을 FRET

Single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET) can be used to obtain structural information on biomolecular complexes in real-time. ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

비계 리포좀을 사용하여 근위 지질 단백질 - 단백질 상호 작용을 재구성<em&gt; 체외</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

생체 분자 구조 결정을위한 단일 분자 수준의 고정밀 FRET

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions

Biotinylated 세포 관통 펩 티 드 세포내 단백질-단백질 상호 작용을 공부 하

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

단일 분자 힘 분광학에 대 한 단백질의 화학식 동원 정지

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

OaAEP1-Mediated Enzymatic Synthesis and Immobilization of Polymerized Protein for Single-Molecule Force Spectroscopy

단일 분자 힘 분광학을 위한 OaAEP1 중재된 효소 합성 및 중합단백질의 고정화

Chemical and bio-conjugation techniques have been developed rapidly in recent years and allow the building of protein polymers. However, a controlled ...

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

체노하브디염 예쁜꼬마선충의 단백질 상호작용 연구를 위한 생체내 하이드록실 라디칼 단백질 발자국

Fast oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting (HRPF) method used to study protein structure, protein-ligand interactions, ...

Making Precise and Accurate Single-Molecule FRET Measurements using the Open-Source smfBox

오픈 소스 smfBox를 사용하여 정확하고 정확한 단일 분자 FRET 측정

The smfBox is a recently developed cost-effective, open-source instrument for single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET), which makes ...