Name: using three-color single-molecule fret to study the correlation of protein interactions
Uploaded: 2018-01-30T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Three-color Single-molecule FRET to Study the Correlation of Protein Interactions at JoVE.com

Dette arbeidet er finansiert av European forskningsråd gjennom ERC Grant avtalen n. 681891 og tyske Research Foundation (INST 39/969-1).

1. installasjon og forutsetninger
<ol><li>Utføre multi-farge smFRET målinger på et prisme-type TIRFM. En beskrivelse av en tofarget oppsett som JoVE publikasjoner er gitt i referere til12.<ol>
<li>Konstruere en multi-farge TIRFM. En generell layout er beskrevet i 9.</li>
		<li>Bruk valgbar, diode pumpet solid state kontinuerlige bølgen lasere, som gjør bruk av mekaniske skodder i eksitasjon baner unødvendig.</li>
		<li>Ansette en asymmetrisk, langstrakt prisme som f...

<ol>
	<li>Nooren, I. M. A., Thornton, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+protein-protein+interactions.">Diversity of protein-protein interactions.</a> EMBO J. 22 (14), 3486-3492 (2003).</li><li>Marsh, J. A., Teichmann, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure,+dynamics,+assembly,+and+evolution+of+protein+complexes.">Structure, dynamics, assembly, and evolution of protein complexes.</a> Annu Rev Biochem. 84, 551-575 (2015).</li><li>Henzler-Wildman, K., Kern, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+personalities+of+proteins.">Dynamic personalities of proteins.</a> Nature. 450 (7172), 964-972 (2007).</li><li>Hohng, S., Joo, C., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Molecule+Three-Color+FRET.">Single-Molecule Three-Color FRET.</a> Biophys J. 87 (2), 1328-1337 (2004).</li><li>Person, B., Stein, I. H., Steinhauer, C., Vogelsang, J., Tinnefeld, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlated+movement+and+bending+of+nucleic+acid+structures+visualized+by+multicolor+single-molecule+spectroscopy.">Correlated movement and bending of nucleic acid structures visualized by multicolor single-molecule spectroscopy.</a> ChemPhysChem. 10 (9-10), 1455-1460 (2009).</li><li>Lee, J., Lee, S., Ragunathan, K., Joo, C., Ha, T., Hohng, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+four-color+FRET.">Single-molecule four-color FRET.</a> Angew Chem Int Ed. 49 (51), 9922-9925 (2010).</li><li>Ratzke, C., Berkemeier, F., Hugel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heat+shock+protein+90's+mechanochemical+cycle+is+dominated+by+thermal+fluctuations.">Heat shock protein 90's mechanochemical cycle is dominated by thermal fluctuations.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (1), 161-166 (2012).</li><li>Ratzke, C., Hellenkamp, B., Hugel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Four-colour+FRET+reveals+directionality+in+the+Hsp90+multicomponent+machinery.">Four-colour FRET reveals directionality in the Hsp90 multicomponent machinery.</a> Nat Commun. 5, 4192 (2014).</li><li>G&#246;tz, M., Wortmann, P., Schmid, S., Hugel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Multicolor+Single-Molecule+FRET+Approach+to+Study+Protein+Dynamics+and+Interactions+Simultaneously.">A Multicolor Single-Molecule FRET Approach to Study Protein Dynamics and Interactions Simultaneously.</a> Methods Enzymol. 581, 487-516 (2016).</li><li>Yengo, C. M., Berger, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+anisotropy+and+resonance+energy+transfer:+Powerful+tools+for+measuring+real+time+protein+dynamics+in+a+physiological+environment.">Fluorescence anisotropy and resonance energy transfer: Powerful tools for measuring real time protein dynamics in a physiological environment.</a> Curr Opin Pharmacol. 10 (6), 731-737 (2010).</li><li>Wortmann,P , ., Götz M, ., Hugel T , . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperative+Nucleotide+Binding+in+Hsp90+and+Its+Regulation+by+Aha1.">Cooperative Nucleotide Binding in Hsp90 and Its Regulation by Aha1.</a> Biophys J. 113, 1711-1718 (2017).</li><li>D&#246;rfler, T., Eilert, T., R&#246;cker, C., Nagy, J., Michaelis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+Information+from+Single-molecule+FRET+Experiments+Using+the+Fast+Nano-positioning+System.">Structural Information from Single-molecule FRET Experiments Using the Fast Nano-positioning System.</a> J Vis Exp. (120), e54782 (2017).</li><li>Stephanopoulos, N., Francis, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choosing+an+effective+protein+bioconjugation+strategy.">Choosing an effective protein bioconjugation strategy.</a> Nature chemical biology. 7 (12), 876-884 (2011).</li><li>S&#225;nchez-Rico, C., Voith von Voithenberg, L., Warner, L., Lamb, D. C., Sattler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Fluorophore+Attachment+on+Protein+Conformation+and+Dynamics+Studied+by+spFRET+and+NMR+Spectroscopy.">Effects of Fluorophore Attachment on Protein Conformation and Dynamics Studied by spFRET and NMR Spectroscopy.</a> Chemistry (Weinheim an der Bergstrasse, Germany). , (2017).</li><li>Roy, R., Hohng, S., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+single-molecule+FRET.">A practical guide to single-molecule FRET.</a> Nat Methods. 5 (6), 507-516 (2008).</li><li>Lee, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-color+alternating-laser+excitation+of+single+molecules:+monitoring+multiple+interactions+and+distances.">Three-color alternating-laser excitation of single molecules: monitoring multiple interactions and distances.</a> Biophys J. 92 (1), 303-312 (2007).</li><li>Kapanidis, A. N., Lee, N. K., Laurence, T. A., Doose, S., Margeat, E., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-aided+molecule+sorting:+analysis+of+structure+and+interactions+by+alternating-laser+excitation+of+single+molecules.">Fluorescence-aided molecule sorting: analysis of structure and interactions by alternating-laser excitation of single molecules.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (24), 8936-8941 (2004).</li><li>Hohlbein, J., Craggs, T. D., Cordes, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternating-laser+excitation:+single-molecule+FRET+and+beyond.">Alternating-laser excitation: single-molecule FRET and beyond.</a> Chem Soc Rev. 43 (4), 1156-1171 (2014).</li><li>Hellenkamp, B., Wortmann, P., Kandzia, F., Zacharias, M., Hugel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multidomain+structure+and+correlated+dynamics+determined+by+self-consistent+FRET+networks.">Multidomain structure and correlated dynamics determined by self-consistent FRET networks.</a> Nat Methods. 14, 174-180 (2017).</li><li>Rabiner, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tutorial+on+hidden+Markov+models+and+selected+applications+in+speech+recognition.">A tutorial on hidden Markov models and selected applications in speech recognition.</a> Proc IEEE. 77 (2), 257-286 (1989).</li><li>Fink, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Markov Models for Pattern Recognition. , (2014).</li><li>Giudici, P., Ryden, T., Vandekerkhove, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Likelihood-Ratio+Tests+for+Hidden+Markov+Models.">Likelihood-Ratio Tests for Hidden Markov Models.</a> Biometrics. 56 (3), 742-747 (2000).</li><li>Visser, I., Raijmakers, M. E. J., Molenaar, P. C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confidence+intervals+for+hidden+Markov+model+parameters.">Confidence intervals for hidden Markov model parameters.</a> Br J Math Stat Psychol. 53 (2), 317-327 (2000).</li><li>McKinney, S. A., Joo, C., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Single-Molecule+FRET+Trajectories+Using+Hidden+Markov+Modeling.">Analysis of Single-Molecule FRET Trajectories Using Hidden Markov Modeling.</a> Biophys J. 91 (5), 1941-1951 (2006).</li><li>Bronson, J. E., Fei, J., Hofman, J. M., Gonzalez, R. L., Wiggins, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Learning+Rates+and+States+from+Biophysical+Time+Series:+A+Bayesian+Approach+to+Model+Selection+and+Single-Molecule+FRET+Data.">Learning Rates and States from Biophysical Time Series: A Bayesian Approach to Model Selection and Single-Molecule FRET Data.</a> Biophys J. 97 (12), 3196-3205 (2009).</li><li>Greenfeld, M., Pavlichin, D. S., Mabuchi, H., Herschlag, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Molecule+Analysis+Research+Tool+(SMART):+an+integrated+approach+for+analyzing+single+molecule+data.">Single Molecule Analysis Research Tool (SMART): an integrated approach for analyzing single molecule data.</a> PLoS ONE. 7 (2), e30024 (2012).</li><li>Schmid, S., G&#246;tz, M., Hugel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Molecule+Analysis+beyond+Dwell+Times:+Demonstration+and+Assessment+in+and+out+of+Equilibrium.">Single-Molecule Analysis beyond Dwell Times: Demonstration and Assessment in and out of Equilibrium.</a> Biophys J. 111 (7), 1375-1384 (2016).</li><li>Taipale, M., Jarosz, D. F., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HSP90+at+the+hub+of+protein+homeostasis:+emerging+mechanistic+insights.">HSP90 at the hub of protein homeostasis: emerging mechanistic insights.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (7), 515-528 (2010).</li><li>Trepel, J., Mollapour, M., Giaccone, G., Neckers, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+dynamic+HSP90+complex+in+cancer.">Targeting the dynamic HSP90 complex in cancer.</a> Nat Rev Cancer. 10 (8), 537-549 (2010).</li><li>Wayne, N., Bolon, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dimerization+of+Hsp90+is+required+for+in+vivo+function.+Design+and+analysis+of+monomers+and+dimers.">Dimerization of Hsp90 is required for in vivo function. Design and analysis of monomers and dimers.</a> J Biol Chem. 282 (48), 35386-35395 (2007).</li><li>Ali, M. M. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+an+Hsp90-nucleotide-p23/Sba1+closed+chaperone+complex.">Crystal structure of an Hsp90-nucleotide-p23/Sba1 closed chaperone complex.</a> Nature. 440 (7087), 1013-1017 (2006).</li><li>Southworth, D. R., Agard, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species-dependent+ensembles+of+conserved+conformational+states+define+the+Hsp90+chaperone+ATPase+cycle.">Species-dependent ensembles of conserved conformational states define the Hsp90 chaperone ATPase cycle.</a> Mol Cell. 32 (5), 631-640 (2008).</li><li>Blanchard, S. C., Kim, H. D., Gonzalez, R. L., Puglisi, J. D., Chu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=tRNA+dynamics+on+the+ribosome+during+translation.">tRNA dynamics on the ribosome during translation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (35), 12893-12898 (2004).</li><li>Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Oxygen+Scavenging+System+for+Improvement+of+Dye+Stability+in+Single-Molecule+Fluorescence+Experiments.">An Oxygen Scavenging System for Improvement of Dye Stability in Single-Molecule Fluorescence Experiments.</a> Biophys J. 94 (5), 1826-1835 (2008).</li><li>Swoboda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+oxygen+scavenging+for+photostability+without+pH+drop+in+single-molecule+experiments.">Enzymatic oxygen scavenging for photostability without pH drop in single-molecule experiments.</a> ACS Nano. 6 (7), 6364-6369 (2012).</li><li>Rognoni, L., Stigler, J., Pelz, B., Yl&#228;nne, J., Rief, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+force+sensing+of+filamin+revealed+in+single-molecule+experiments.">Dynamic force sensing of filamin revealed in single-molecule experiments.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (48), 19679-19684 (2012).</li><li>Okumus, B., Wilson, T. J., Lilley, D. M. J., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicle+encapsulation+studies+reveal+that+single+molecule+ribozyme+heterogeneities+are+intrinsic.">Vesicle encapsulation studies reveal that single molecule ribozyme heterogeneities are intrinsic.</a> Biophys J. 87 (4), 2798-2806 (2004).</li><li>Boukobza, E., Sonnenfeld, A., Haran, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilization+in+Surface-Tethered+Lipid+Vesicles+as+a+New+Tool+for+Single+Biomolecule+Spectroscopy.">Immobilization in Surface-Tethered Lipid Vesicles as a New Tool for Single Biomolecule Spectroscopy.</a> J Phys Chem B. 105 (48), 12165-12170 (2001).</li><li>Levene, M. J., Korlach, J., Turner, S. W., Foquet, M., Craighead, H. G., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zero-mode+waveguides+for+single-molecule+analysis+at+high+concentrations.">Zero-mode waveguides for single-molecule analysis at high concentrations.</a> Science. 299 (5607), 682-686 (2003).</li><li>Panaretou, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP+binding+and+hydrolysis+are+essential+to+the+function+of+the+Hsp90+molecular+chaperone+in+vivo.">ATP binding and hydrolysis are essential to the function of the Hsp90 molecular chaperone in vivo.</a> EMBO J. 17 (16), 4829-4836 (1998).</li></ol>

Vi presenterer den eksperimentelle prosedyren for å få tre farger smFRET data for en kompleks protein og en detaljert beskrivelse av analysen av disse målingene. Denne tilnærmingen gir en enestående mulighet til å vurdere sammenhengen mellom flere samhandling nettsteder eller conformational endringer direkte.
For å få egnet multi-farge single-molekylet data på proteiner er det viktig å utføre reproduserbar målinger på lavt støynivå. Dette kan oppnås ved hjelp av en effektiv og ...

Mange proteiner oppfylle sin funksjon dynamisk komplekser med andre molekyler, formidlet av conformational endringer og forbigående foreninger med et bredt spekter av tidsskalaer1,2,3. Koblet til en ekstern energikilde (f.eks ATP) disse dynamiske interaksjoner kan føre til retningen i en funksjonell syklus og til slutt opprettholde ikke-likevekt stabil i en celle, en forutsetning for livet.
For å forstå disse molekylær maskiner, er en statisk beskrivelse av strukturelle studier ikke tilstrekkelig. I tillegg er det viktig å ha kjennskap til den underliggende kinetic modellen og å finne kinetic rate konstanter. Mange eksisterende metoder tillate forskere å studere dynamikken i binær interaksjoner mellom to molekyler av interesse, f.eks overflaten plasmon resonans, avslapning metoder med en spektroskopiske avlesning (f.eks hoppe eller stoppet flyt teknikker), og kjernefysiske magnetisk resonans. Men er deres anvendbarhet oftest begrenset til enkle to-stats systemer (f.eks en bundet og en ubundet tilstand) på grunn av den snitt iboende til bulk eksperimenter. I tilfeller der flere stater eller mellomprodukter er involvert, gir de bare en kompleks blanding av hastighet konstanter. Single-molekylet metoder som optisk eller magnetiske pinsett eller to farger smFRET, dvs. en giver og ett acceptor fluorophore, med en overflate-immobilisert prøve kan gjenopprette rate konstanter for alle observerte conformational endringer. Men når det kommer til interaksjoner påvirker flere binding området, disse metodene er fortsatt begrenset og informasjon om mulig sammenheng av to (eller flere) interaksjoner bare være tilgjengelige via indirekte konklusjoner fra et sett av eksperimenter.
Multi-farge smFRET4,5,6,7,8,9 tilbyr muligheten til å studere samspillet mellom disse komponentene direkte på sanntid og under nær-fysiologiske forhold10. Dette tillater en å undersøke for eksempel konformasjon-avhengige binding av en ligand eller en annen protein8,9,11. Den generelle tilnærmingen presenteres her er å merke protein(s) rundt på bestemte stillinger, knytte en protein på overflaten av måling kammeret og spore fluorescens intensiteten over tid på et prisme-type TIRFM (for detaljer se 9 , 12). romlige nærhet til ulike fargestoffer kan deretter bestemmes fra energi-overføring mellom dem. Merking strategier kan variere fra protein protein (omtalt i 13) og retningslinjer for å unngå gjenstander i smFRET målinger finnes14.
Siden en donor fargestoff kan overføre energi til forskjellige acceptor fargestoffer i et multi-farge smFRET eksperiment, er den relative plasseringen av alle fargestoffer ikke tilgjengelig fra magnetisering av ett fargestoff alene15,16. Men i kombinasjon med vekslende laser eksitasjon (ALEX17og vurdert i 18) denne metoden gir alle spatio-temporale informasjon på sub-sekunders og sub nanometer oppløsning.
Rektor, høy oppløsning strukturinformasjon kan oppnås ved hjelp av Inter fargestoff avstander beregnet ut fra kombinasjonen av alle fluorescens bakgrunnsintensitetene i en multi-farge smFRET eksperimentere med ALEX. Men fokusere her vi på staten identifikasjon og separasjon samt utvinning av kinetic modeller, der multi-farge smFRET er uunnværlig. Når "bare" proteinstrukturer ved triangulering er ønsket, kan et sett med enklere to farger smFRET eksperimenter med høy signal-til-støy-forhold være utført12,19.
Vi bruker den delvis fluorescensen (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq1.jpg">) som en proxy for energi-overføring mellom to fluorophores7. PF beregnes fra fluorescens intensiteten tilsvarende bånd effektiviteten av en tofarget eksperiment:
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq2.jpg">
Der <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq3v2.jpg"> er intensiteten i utslipp kanal em etter eksitasjon med farge ex, og c er acceptor med den lengste bølgelengden. Oppdagelsen kanalene representerer samme posisjon i prøven kammer, men posten forskjellige spectral områder fluorescens lyset. Den samme IDen for eksitasjon og utslipp brukes i denne protokollen (dvs. "blue" "grønn" og "rød").
På grunn av eksperimentelle mangler av målt fluorescens intensiteten ikke bare på energi-overføring, men også på fluorophore og oppsett. For å få den sanne energieffektiviteten for overføring mellom to fluorophores, må de målte intensiteter korrigeres. Følgende er basert på referanse9. Korreksjonsfaktorer for tilsynelatende lekkasje (Luk, dvs., gjenkjenning av fotoner fra en fluorophore i en kanal dedikert til et annet fargestoff) og tilsynelatende gamma (ag, dvs. fluorescens quantum avkastningen av fargestoff og effektiviteten deteksjon av kanalen) hentes fra single-molekylet spor som viser en godkjenner bleking hendelsen.
Lekkasje av donor fargestoff i hver mulig acceptor kanalen beregnes fra alle datapunktene i innspilte fluorescens spor hvor acceptor fargestoff bleket men giveren er fortsatt fluorescerende (<img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq4.jpg">):
<img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq5.jpg">
Medianen for lekkasje histogrammet brukes som tilsynelatende lekkasje faktoren. Etter korrigering for lekkasje bestemmes tilsynelatende gamma faktoren fra samme sett med spor. Det beregnes ved endring av fluorescens i acceptor kanalen ved endring av fluorescens i donor kanalen ved bleking acceptor fargestoff:
<img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq6.jpg">
Hvor c igjen er oppdagelsen kanalen for acceptor med den lengste bølgelengden. Medianen til den endelige fordelingen brukes som tilsynelatende korrigeringsfaktoren.
Korrigert intensiteten i hver enkelt kanal oppnås ved:
<img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq7.jpg">
PF beregnes slik:
<img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq8.jpg">
Ulike befolkningsgrupper kan skilles i multi-dimensjonale rommet spredt av PF-s. Posisjonen og bredden av hver stat bestemmes ved å tilpasse dataene med multi-dimensjonale Gaussian funksjoner. Etterfølgende optimalisering av en global HMM basert på alle PF spor gir en kvantitativ beskrivelse av den observerte kinetics. Selv små endringer av prisene er synlig.
HMMs er en måte inferring staten modell fra en samling med støyende tid spor. Systemet anses å være i ett av et sett med diskret, skjulte stater til enhver tid og faktiske observasjon (dvs. utslipp) er en sannsynlig funksjon av dette skjult tilstand20. Ved TIRFM smFRET data, kan de utslipp sannsynligheter bjeg per stat jeg modelleres ved kontinuerlig Gaussian sannsynlig tetthet funksjoner. På jevnlig spredte diskret tidspunkt, kan overganger fra én til en annen stat oppstå etter overgangen sannsynlighet som hensyn til tid og bare avhengig av gjeldende status. Overgangen matrix A inneholder disse overgang sannsynligheter enij mellom alle skjulte. Starttilstand distribusjon <img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq9.jpg"> gir state-spesifikke sannsynlighetene <img alt="Equation 10" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq10.jpg"> for første gang punktet av en tid sporing. Med en maksimal sannsynlighet tilnærming, kan disse parametrene optimaliseres best beskriver dataene med forover-bakover og Baum-Welch algoritmer20,21. Dette gir maksimal sannsynlighet grunnlaget har (MLE). Endelig kan tilstand sekvensen som mest sannsynlig produsert banen observasjoner konkluderes med Viterbi algoritmen. I motsetning til andre HMM analyser av smFRET data24,25,26 bruker vi ikke HMM som en ren "utjevning" av dataene men utdrag kinetic staten modellen fra datasettet uten behov for å feste holdetiden histogrammer27. HMM analyse er gjort med interne skript ved hjelp av Igor Pro. Implementeringen av koden er basert på referanse21. Vi tilbyr en programvare kit og eksemplarisk data på vår for å kunne følge deler 5 og 6 i denne protokollen (https://www.singlemolecule.uni-freiburg.de/software/3d-fret). Full programvare er tilgjengelig på forespørsel.
Tid poeng i dataene med PF < -1 eller PF > 2 i noen oppdagelsen kanalen tilordnes minimale utslipp sannsynligheten for alle stater (10-200). Dette hindrer kunstig overganger på datapunktene.
Parameterne for utslipp sannsynlighetene er Hentet fra passformen til 3D PF histogrammet Gaussian funksjoner som beskrevet i trinn 5.7. Disse parametrene holdes fast i optimalisering av HMM.
I presentert tilnærming brukes starttilstand distribusjon vektoren og overgangen matrisen globalt å beskrive hele ensemblet i spor. De oppdateres basert på alle N molekyler fra datasettet ifølge referanse27.
Startparametere for starttilstand distribusjon bestemmes fra 2D projeksjoner av PF histogrammet (trinn 5.3) og overgang sannsynlighetene er satt til 0,05 med unntak av sannsynlighetene opphold i denne stat, som er valgt slik at sannsynligheten for å forlate en viss tilstand er normalisert Unity.
Sannsynligheten profilering metode brukes til å gi tillit intervaller (CIs) for alle overgang priser21,22, som fungerer som meningsfull estimater for deres usikkerhet. Vil beregne grensene for CI for en bestemt hastighet, er overgang sannsynligheten av interesse festet til en annen verdi enn MLE. Dette gir test modell λ'. En sannsynlighet forholdet (LR) test sannsynlighet <img alt="Equation 16" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq16.jpg"> gitt datasettet 0 er utført i henhold til:
<img alt="Equation 11" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq11.jpg">
95% tillit bundet for parameteren er nådd når LR overskrider 3.841, 95% quantile av en x2-distribusjon med en grad av frihet22,23.
Kraften i metoden er demonstrert ved hjelp av Hsp90. Dette rikelig protein i bakterier og eukaryoter og er del av mobilnettet stress respons28. Det er en lovende stoffet mål i kreft behandling29. Hsp90 er en homodimer med en nukleotid binding lomme i N-terminal domene hver delenhet30. Det kan gjennomgå overganger mellom minst to globalt distinkte konformasjonen, en lukket og en N-terminal åpen, V-formet konformasjon19,31,32. Dimeric natur reiser direkte spørsmål om samspillet mellom de to nukleotid bindende områdene i Hsp90.
Nedenfor gir vi en trinnvis protokoll for datainnsamling og analyse av et tre farger smFRET forsøk på gjær Hsp90 og nukleotid. Konformasjon-avhengige binding av fluorescently merket AMP-PNP (AMP-PNP *, en ikke-hydrolyzable analog ATP) er analysert. Programmet beskrevet prosedyren tillater studie av nukleotid bindingen og samtidig conformational forandringene av Hsp90 og avslører dermed cooperativity mellom to nukleotid bindende lommene på Hsp90.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1301">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Setup</td>
			<td style="width:445px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td style="width:347px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">vibration-damped optical table&#160;&#160;</td>
			<td style="width:445px;">Newport, Irvine, CA, USA</td>
			<td style="width:167px;">RS2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">OBIS 473nm LX 75mW LASER</td>
			<td style="width:445px;">Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA</td>
			<td style="width:167px;">1185052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">OBIS 532nm LS 50mW LASER</td>
			<td style="width:445px;">Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA</td>
			<td style="width:167px;">1261779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">OBIS 594nm LS 60mW LASER</td>
			<td style="width:445px;">Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA</td>
			<td style="width:167px;">1233470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">OBIS 637nm LX 140mW LASER</td>
			<td style="width:445px;">Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA</td>
			<td style="width:167px;">1196625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">laser control unit</td>
			<td style="width:445px;">Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA</td>
			<td style="width:167px;">1234465</td>
			<td style="width:347px;">Scientific Remote</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">aspheric telescope lenses</td>
			<td style="width:445px;">Thorlabs Inc, Newton, New Jersey, USA</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>d=25.4mm, f=50mm and f=100mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">CF ex1</td>
			<td style="width:445px;">AHF analysentechnik AG, T&#252;bingen, Germany</td>
			<td style="width:167px;">ZET 473/10</td>
			<td>cleanup filter excitation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">CF ex2</td>
			<td style="width:445px;">AHF analysentechnik AG, T&#252;bingen, Germany</td>
			<td style="width:167px;">ZET 532/10</td>
			<td>cleanup filter excitation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">CF ex3</td>
			<td style="width:445px;">AHF analysentechnik AG, T&#252;bingen, Germany</td>
			<td style="width:167px;">ZET 594/10</td>
			<td>cleanup filter excitation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">CF ex4</td>
			<td style="width:445px;">Thorlabs Inc, Newton, New Jersey, USA</td>
			<td>FL635-10</td>
			<td>cleanup filter excitation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">DM ex1</td>
			<td style="width:445px;">AHF analysentechnik AG, T&#252;bingen, Germany</td>
			<td style="width:167px;">ZQ594RDC</td>
			<td>dichroic mirror excitation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">DM ex2</td>
			<td style="width:445px;">AHF analysentechnik AG, T&#252;bingen, Germany</td>
			<td style="width:167px;">570DCXR</td>
			<td>dichroic mirror excitation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">DM ex3</td>
			<td style="width:445px;">AHF analysentechnik AG, T&#252;bingen, Germany</td>
			<td style="width:167px;">ZQ491RDC</td>
			<td>dichroic mirror excitation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">AOTFnC-Vis</td>
			<td style="width:445px;">AA Opto-Electronic, Orsay, France</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">&#955;/4 plate</td>
			<td style="width:445px;">Thorlabs Inc, Newton, New Jersey, USA</td>
			<td style="width:167px;">AQWP05M-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">CFI Apo TIRF 100x</td>
			<td style="width:445px;">Nikon Instruments Inc, Melville, NY, USA</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>high-NA objective</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">piezo focus positioner MIPOS 250 CAP</td>
			<td style="width:445px;">piezosystem jena GmbH, Jena, Germany</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>Piezo Controller NV 40/1 CLE</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">piezo stepper</td>
			<td style="width:445px;">Newport, Irvine, CA, USA</td>
			<td>PZA12</td>
			<td>PZC200-KT NanoPZ Actuator Kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">achromatic aspheric lenses</td>
			<td style="width:445px;">Qioptiq Photonics GmbH &#38; Co. KG, G&#246;ttingen, Germany</td>
			<td style="width:167px;">G322-304-000</td>
			<td>d=50mm, f=200mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">adjustable optical slit</td>
			<td style="width:445px;">Owis GmbH, Staufen i. Br., Germany</td>
			<td>27.160.1212</td>
			<td>max. aperture 12 x 12 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">DM det1</td>
			<td style="width:445px;">AHF analysentechnik AG, T&#252;bingen, Germany</td>
			<td style="width:167px;">T 600 LPXR</td>
			<td>dichroic mirror detection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">DM det2</td>
			<td style="width:445px;">AHF analysentechnik AG, T&#252;bingen, Germany</td>
			<td style="width:167px;">H 560 LPXR superflat</td>
			<td>dichroic mirror detection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">DM det3</td>
			<td style="width:445px;">AHF analysentechnik AG, T&#252;bingen, Germany</td>
			<td style="width:167px;">HC BS R635</td>
			<td>dichroic mirror detection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">BP det1</td>
			<td style="width:445px;">AHF analysentechnik AG, T&#252;bingen, Germany</td>
			<td style="width:167px;">525/40 BrightLine HC</td>
			<td>bandpass filter detection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">BP det2</td>
			<td style="width:445px;">AHF analysentechnik AG, T&#252;bingen, Germany</td>
			<td style="width:167px;">586/20 BrightLine HC</td>
			<td>bandpass filter detection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">BP det3</td>
			<td style="width:445px;">AHF analysentechnik AG, T&#252;bingen, Germany</td>
			<td style="width:167px;">631/36 BrightLine HC</td>
			<td>bandpass filter detection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">BP det4</td>
			<td style="width:445px;">AHF analysentechnik AG, T&#252;bingen, Germany</td>
			<td style="width:167px;">700/75 ET Bandpass</td>
			<td>bandpass filter detection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">optical shutters detection</td>
			<td style="width:445px;">Vincent Associates, Rochester, NY, USA</td>
			<td style="width:167px;">Uniblitz VS25S2T0&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">EMCCD iXon Ultra 897</td>
			<td style="width:445px;">Andor Technology Ltd, Belfast, Northern Ireland</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">digital I/O card, PCIe-6535</td>
			<td style="width:445px;">National Instruments, Austin, Texas, USA</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">syringe pump</td>
			<td style="width:445px;">Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA</td>
			<td style="width:167px;">PHD22/2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Name</td>
			<td style="width:445px;">Company</td>
			<td style="width:167px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Flow chamber</td>
			<td style="width:445px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">quartz slides</td>
			<td style="width:445px;">G. Finkenbeiner Inc, Waltham, MA, USA</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>Spectrosil2000, h=3mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">TEGADERM film</td>
			<td style="width:445px;">3M Deutschland GmbH, Neuss, Germany</td>
			<td style="width:167px;">1626W</td>
			<td>10 x 12cm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">spray adhesive</td>
			<td style="width:445px;">3M Deutschland GmbH, Neuss, Germany</td>
			<td style="width:167px;">Photo Mount 050777</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">glycerol</td>
			<td style="width:445px;">Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany</td>
			<td style="width:167px;">Immersol G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">immersion oil</td>
			<td style="width:445px;">OLYMPUS EUROPA SE &#38; CO. KG, Hamburg, Germany</td>
			<td>IMMOIL-F30CC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">prism</td>
			<td style="width:445px;">Vogelsberger Quarzglastechnik GmbH, Hauzenberg, Germany</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>Suprasil1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">aluminium prism holder</td>
			<td style="width:445px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>custom built</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">hollow setscrews</td>
			<td style="width:445px;">Thorlabs Inc, Newton, New Jersey, USA</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>with custom drilling</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Tygon S3 E-3603 tubing</td>
			<td style="width:445px;">neoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany</td>
			<td style="width:167px;">2-4450</td>
			<td>ACF00001</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">PTFE tubing</td>
			<td style="width:445px;">Bohlender GmbH, Gr&#252;nsfeld, Germany</td>
			<td style="width:167px;">S1810-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Name</td>
			<td style="width:445px;">Company</td>
			<td style="width:167px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Sample</td>
			<td style="width:445px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">yeast Hsp90 D61C, Q385C_biotin</td>
			<td style="width:445px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>UniProt ID P02829</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Maleimide derivatives of Atto488, Atto550</td>
			<td style="width:445px;">ATTO-TEC GmbH, Siegen, Germany</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">AMP-PNP*</td>
			<td style="width:445px;">Jena Bioscience, Jena, Germany</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td style="width:347px;">&#947;-[(6-Aminohexyl)-imido]-AMP-PNP-Atto647N</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Fluospheres</td>
			<td style="width:445px;">Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td style="width:167px;">F8764</td>
			<td>amine-modified, 0.2 &#956;m, yellow-green fluorescent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Name</td>
			<td style="width:445px;">Company</td>
			<td style="width:167px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Software</td>
			<td style="width:445px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Andor Solis</td>
			<td style="width:445px;">Andor Technology Ltd, Belfast, Northern Ireland</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>version 4.30</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">LabVIEW</td>
			<td style="width:445px;">National Instruments, Austin, Texas, USA</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>version 2012, 32bit; misc. hardware control</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">MDS control software</td>
			<td style="width:445px;">AA Opto-Electronic, Orsay, France</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>version 2.03a</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Coherent Connection</td>
			<td style="width:445px;">Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>version 3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Igor Pro</td>
			<td style="width:445px;">WaveMetrics Inc, Portland, OR, USA</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>version 6.37</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using three-color single-molecule fret to study the correlation of protein interactions

Single-molekylet han selvmord resonans energi-overføring (smFRET) har blitt en utbredt Biofysiske teknikk for å studere dynamikken i biomolecules. For mange molekylær maskiner i en celle proteiner må handle sammen med interaksjon partnere i en funksjonell syklus å oppfylle sin oppgave. Utvidelsen av to-farge til flere smFRET gjør det mulig å samtidig undersøke flere interaksjon eller conformational endres. Dette er ikke bare legger en ny dimensjon til smFRET eksperimenter, men det tilbyr en enestående mulighet til å studere direkte hendelsesforløpet og oppdage korrelert interaksjoner ved en immobilisert prøve og en total intern refleksjon fluorescens mikroskopet (TIRFM). Derfor er multi-farge smFRET et allsidig verktøy for å studere biomolecular komplekser i en kvantitativ måte og i en tidligere uoppnåelig detalj.
Her viser vi hvordan å overvinne de spesielle utfordringene multi-farge smFRET eksperimenter på proteiner. Vi presenterer detaljert protokoller for å skaffe data og trekke ut kinetic. Dette inkluderer spor utvalgskriterier, staten separasjon og utvinning av staten baner fra støyende dataene med en 3D ensemble Hidden Markov Model (HMM). Sammenlignet med andre metoder, kinetisk informasjonen ikke er gjenopprettet fra bor tid histogrammer men direkte fra HMM. Maksimal sannsynlighet rammeverket tillater oss å kritisk vurdere kinetic modellen og gi meningsfull usikkerhet for priser.
Ved å bruke vår metode varme sjokk protein 90 (Hsp90), kan vi greie nukleotid bindingen og globale conformational endringer av protein. Dette tillater oss å direkte observere cooperativity mellom to nukleotid bindende lommene på Hsp90-dimer.

Multi-farge smFRET målinger kan direkte deteksjon av sammenheng mellom to eller flere forskjellige samhandling områder. Dette gjør teknikken unike undersøke multi-komponent systemer, for eksempel protein komplekser. Vi fokuserer på presentasjonen av et tre farger smFRET eksperiment her, som fungerer som et illustrerende eksempel.
Den generelle arbeidsflyten av metoden er vist i figur 1. Den fø...

Watch this Scientific Journal Video about Using Three-color Single-molecule FRET to Study the Correlation of Protein Interactions at JoVE.com

Using Three-color Single-molecule FRET to Study the Correlation of Protein Interactions

Bruker tre farger Single-molekylet bånd å studere sammenhengen av Protein interaksjoner

Her presenterer vi en protokoll for å få tre farger smFRET data og analyse med en 3D ensemble Hidden Markov Model. Med denne tilnærmingen, kan forskere trekke kinetic informasjon fra komplekse protein-systemer, inkludert cooperativity eller korrelert interaksjoner.

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) has become a widely used biophysical technique to study the dynamics of biomolecules. For ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Fluorescence Anisotropy as a Tool to Study Protein-protein Interactions

Fluorescens anisotropi som et verktøy for å studere protein-protein interaksjoner

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is ...

Structural Information from Single-molecule FRET Experiments Using the Fast Nano-positioning System

Strukturell Informasjon fra Single-molekyl FRET Eksperimenter Bruke Fast Nano-posisjonering System

Single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET) can be used to obtain structural information on biomolecular complexes in real-time. ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Bruke Stillas liposomer for å rekonstituere Lipid-proksimale Protein-protein interaksjoner<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

Høy presisjon FRET ved enkeltmolekylivå for biomolekylstrukturbestemmelse

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions

Biotinylated celle-gjennomtrengende peptider å studere intracellulær Protein-protein interaksjoner

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

Kovalente immobilisering av proteiner for ett molekyl Force spektroskopi

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

OaAEP1-Mediated Enzymatic Synthesis and Immobilization of Polymerized Protein for Single-Molecule Force Spectroscopy

OaAEP1-mediert enzymatisk syntese og immobilisering av polymerisert protein for enkeltmolekylet kraftspektroskopi

Chemical and bio-conjugation techniques have been developed rapidly in recent years and allow the building of protein polymers. However, a controlled ...

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for studiet av proteininteraksjoner i Caenorhabditis elegans

Fast oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting (HRPF) method used to study protein structure, protein-ligand interactions, ...

Making Precise and Accurate Single-Molecule FRET Measurements using the Open-Source smfBox

Foreta presise og nøyaktige FRET-målinger med ett molekyl ved hjelp av åpen kildekode-smfBox

The smfBox is a recently developed cost-effective, open-source instrument for single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET), which makes ...