Name: using three-color single-molecule fret to study the correlation of protein interactions
Uploaded: 2018-01-30T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Three-color Single-molecule FRET to Study the Correlation of Protein Interactions at JoVE.com

Este trabalho é financiado pela Fundação de pesquisa alemã (INST 39/969-1) e o Conselho Europeu de investigação através da Convenção de subvenção ERC n. 681891.

1. instalação e pré-requisitos
<ol><li>Realizar as medições de cor multi smFRET em um TIRFM de prisma-tipo. Uma descrição de uma configuração de duas cores como uma publicação de JoVE é dado referência a12.<ol>
<li>Construa um TIRFM de várias cor. Um layout geral é detalhado em 9.</li>
		<li>Uso comutável, diodo bombeou onda contínua lasers de estado sólido, que tornam a utilização de obturadores mecânicos nos caminhos de excitação desnecessárias.<...

<ol>
	<li>Nooren, I. M. A., Thornton, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+protein-protein+interactions.">Diversity of protein-protein interactions.</a> EMBO J. 22 (14), 3486-3492 (2003).</li><li>Marsh, J. A., Teichmann, S. 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Apresentamos o procedimento experimental para obter dados de três cores smFRET para um sistema complexo de proteínas e uma descrição passo a passo da análise dessas medições. Essa abordagem oferece a possibilidade única de avaliar diretamente a correlação entre vários sites de interação ou mudanças conformacionais.
A fim de obter dados de único-molécula multi cores adequados em proteínas é importante realizar as medições podem ser reproduzidas em um baixo nível de ruído. ...

Muitas proteínas cumprem sua função em dinâmicos complexos com outras moléculas, mediadas por mudanças conformacionais e associações transientes em uma ampla gama de escalas temporais1,2,3. Acoplado a uma fonte de energia externa (por exemplo, ATP) essas interações dinâmicas podem levar a direcionalidade de um ciclo funcional e, finalmente, manter o estado de desequilíbrio constante em uma célula, o pré-requisito para a vida.
A fim de compreender plenamente essas máquinas moleculares, uma descrição estática guiada por estudos estruturais não é suficiente. Além disso, é essencial ter conhecimento do modelo cinético subjacente e determinar as constantes de velocidade cinética. Vários métodos existentes permitem aos pesquisadores estudar a dinâmica de interações de binárias entre duas moléculas de interesse, por exemplo, ressonância de plasmon de superfície, métodos de relaxamento com uma leitura espectroscópico (por exemplo, o salto ou fluxo parou técnicas) e ressonância magnética nuclear. No entanto, sua aplicabilidade é na maioria dos casos limitados a simples sistemas de dois Estados (por exemplo, um limite e um estado desacoplado) devido a média de inerente às experiências em massa. Em casos onde a mais Estados ou intermediários estão envolvidos, rendem apenas uma mistura complexa das constantes de velocidade. Único-molécula métodos tais como Pinça óptica ou magnética ou smFRET de duas cores, ou seja, um doador e um aceitador fluoróforo, com uma amostra de superfície-imobilizado podem recuperar as constantes de taxa para todos observadas mudanças conformacionais. No entanto, quando se trata de interações que afetam o sítio de ligação a mais de um, esses métodos permanecem limitados e as informações sobre as interações de possível correlação dos dois (ou mais) só será acessíveis via indirectas conclusões de um conjunto de experiências.
Multi cor smFRET4,5,6,7,8,9 oferece a oportunidade de estudar a interação entre esses componentes directamente, em tempo real e sob condições fisiológicas perto de10. Isso permite que um para investigar, por exemplo, a vinculação dependente da conformação de um ligante ou outra proteína8,9,11. A abordagem global apresentada aqui é para rotular as somáticas de interesse em posições específicas, para anexar uma proteína para a superfície da câmara de medição e para controlar a intensidade da fluorescência ao longo do tempo em um prisma-tipo TIRFM (para detalhes veja 9 , 12). a proximidade espacial das tinturas diferentes então pode ser determinada a partir a transferência de energia entre eles. Estratégias de rotulagem pode variar de proteína a proteína (revista em 13) e orientações para evitar artefatos nas medições smFRET existem14.
Desde que um corante doador pode transferir energia para aceitador diferentes corantes em um experimento smFRET multi cor, a posição relativa de todos os corantes não é acessível a partir da excitação de um corante sozinho15,16. Mas em combinação com a alternância de excitação do laser (ALEX17e revisto em 18) este método fornece todas as informações de espaço-temporal em segundo e resolução de sub nanômetros.
No principal, de alta resolução, informações estruturais podem ser conseguidas usando-se as distâncias de tintura inter calculadas a partir da combinação de todas as intensidades de fluorescência em um smFRET de cor multi experiência com ALEX. No entanto, aqui focamos na identificação de estado e de separação, bem como a extração de modelos cinéticos, onde smFRET multi cor é indispensável. Quando "só" determinação de estrutura por triangulação é desejada, um conjunto de experiências mais simples de duas cores smFRET com alta relação sinal-ruído pode ser realizada de12,19.
Nós usamos a fluorescência parcial (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq1.jpg">) como um proxy para a transferência de energia entre dois fluorophores7. A PF é calculado a partir da intensidade de fluorescência análoga à eficiência de traste de um experimento de duas cores:
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq2.jpg">
Onde, <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq3v2.jpg"> é a intensidade de emissão canal em após excitação com cor ex, e c é o aceitador com o comprimento de onda mais longo. Canais de deteção representam a mesma posição na câmara de amostra, mas registros diferentes intervalos espectrais da luz da fluorescência. O mesmo identificador para excitação e emissão são utilizados neste protocolo (ou seja, "azul", "verde" e "vermelho").
Por causa de deficiências experimentais as intensidades de fluorescência medido dependem não só sobre a transferência de energia mas também Propriedades fluoróforo e instalação. Para obter a eficiência de transferência de energia verdadeira entre dois fluorophores, as intensidades medidas tem que ser corrigido. O procedimento a seguir baseia-se na referência9. Fatores de correção para vazamento aparente (LC, ou seja, a detecção de fótons de um fluoróforo num canal designada para outro corante) e aparente gama (ag, ou seja, o rendimento quântico de fluorescência do corante e a eficiência de deteção do canal) são obtidos a partir de vestígios de único-molécula que mostram um aceitador evento de branqueamento.
O escapamento do doador corante em todos os canais possíveis aceitador é calculado a partir de todos os pontos de dados nos vestígios de fluorescência gravada onde o corante aceitador branqueada, mas o doador é ainda fluorescente (<img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq4.jpg">):
<img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq5.jpg">
A mediana do histograma escapamento é usada como o fator de vazamento aparente. Após a correção para detecção de fugas, o fator gama aparente é determinado a partir do mesmo conjunto de traços. É calculado dividindo-se a mudança da fluorescência no canal aceitador pela mudança de fluorescência no canal ao descoramento do corante aceitador de doador:
<img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq6.jpg">
Onde c é novamente o canal de deteção para o aceitador com o comprimento de onda mais longo. A mediana da distribuição resultante é usada como o fator de correção aparente.
As intensidades corrigidas em cada canal são obtidas por:
<img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq7.jpg">
A PF é então calculado de acordo com:
<img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq8.jpg">
Diferentes populações podem ser separadas no espaço multidimensional ocupado pela s da PF. A posição e a largura de cada Estado é determinado pelo ajuste os dados com funções Gaussian multidimensionais. Otimização subsequente de um HMM global com base em todos os vestígios PF fornece uma descrição quantitativa de cinética observada. Mesmo as pequenas alterações das taxas são detectáveis.
HMMs fornecem uma maneira de se inferir um modelo de estado de uma coleção de traços de tempo barulhento. O sistema é considerado em parte de um conjunto de discreta, Estados ocultos em um determinado momento e a observação real (ou seja, a emissão) é uma função probabilística deste estado oculto20. No caso dos dados de smFRET TIRFM, a emissão probabilidades beu por Estado, pode ser modelado por funções de densidade de probabilidade gaussiana contínua. Em pontos regularmente espaçados de tempo discreto, transições de um para outro Estado podem ocorrer de acordo com a probabilidade de transição que é invariante no tempo e só depende do estado atual. A matriz de transição A contém estas probabilidades de transição umij entre todos os Estados-Membros escondidos. A distribuição de estado inicial <img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq9.jpg"> dá as probabilidades específicas de estado <img alt="Equation 10" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq10.jpg"> para o primeiro ponto de tempo de um rastreamento de tempo. Usando uma abordagem de máxima probabilidade, estes parâmetros podem ser otimizados para melhor descrevem os dados com o para diante-para trás e Baum-Welch algoritmos20,21. Isso produz os estimadores de máxima verossimilhança (MLE). Finalmente, a sequência de estado que provavelmente produzido a trajetória de observações pode ser inferida com o algoritmo de Viterbi. Em contraste com outras analises HMM smFRET dados24,25,26 não usamos o HMM como um mero "suavização" da dados, mas o modelo de estado cinético extraído do conjunto de dados sem a necessidade para caber o tempo de permanência histogramas de27. HMM análise é feita com in-house scripts usando Igor Pro. Aplicação do código baseia-se na referência21. Nós fornecemos um kit de software e dados exemplares na nossa página da Web para seguir seções 5 e 6 do presente protocolo (https://www.singlemolecule.uni-freiburg.de/software/3d-fret). Software completo está disponível mediante pedido.
Pontos nos dados com PF < -1 ou PF > 2 em qualquer canal de deteção são atribuídos a probabilidade de emissão mínima para todos os Estados (10-200). Isso impede que transições artificiais nestes pontos de dados.
Os parâmetros para as probabilidades de emissão são obtidos a partir do ajuste do histograma PF 3D com funções Gaussian conforme descrito na etapa 5.7. Esses parâmetros são mantidos fixos durante a otimização do HMM.
Na abordagem apresentada, o vetor de distribuição do estado inicial e a matriz de transição são utilizados mundialmente para descrever todo o conjunto de traços. Eles são atualizados com base em todas as moléculas de N do conjunto de dados de acordo com a referência27.
Parâmetros para a distribuição de estado inicial são determinados de projeções 2D do histograma PF (etapa 5.3) e as probabilidades de transição são definidas como 0,05 com exceção as probabilidades de permanecer no mesmo estado, que são escolhidos tais que a probabilidade de sair de um determinado estado é normalizada à unidade.
Um método de criação de perfil de probabilidade é usado para dar intervalos de confiança (CIs) para todos os transição taxas21,22, que servem como estimativas significativas para sua incerteza. Para calcular os limites da IC para uma taxa específica, a probabilidade de transição de juros é fixa para um valor diferente do MLE. Isto rende o teste modelo λ'. Um teste de ratio (LR) probabilidade da probabilidade <img alt="Equation 16" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq16.jpg"> dado o conjunto de dados 0 é realizada de acordo com:
<img alt="Equation 11" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq11.jpg">
A confiança de 95% vinculada para o parâmetro é alcançado quando LR excede 3,841, o Quantil de 95% de um X2-distribuição com um grau de liberdade22,23.
O poder do método é demonstrado usando o Hsp90. Esta proteína abundante é encontrada em bactérias e eucariotas e é parte do estresse celular resposta28. É um alvo de droga promissora no tratamento de câncer29. Hsp90 é um homodímero com um bolso de ligação de nucleotídeos do domínio N-terminal de cada subunidade30. Ele pode sofrer transições pelo menos duas conformações distintas globalmente, um fechado e um N-terminal conformação aberta, em forma de V19,31,32. A natureza dimérica diretamente a questão da interação entre os dois locais de ligação de nucleotídeos em Hsp90.
A seguir, fornecemos um protocolo passo a passo para a aquisição de dados e análise de um experimento de smFRET três cores na levedura Hsp90 e nucleotídeos. A vinculação dependente da conformação do AMP-PNP fluorescente etiquetadas (AMP-PNP *, um analog não hidrolisável do ATP) é analisada. A aplicação do procedimento descrito permite o estudo da ligação de nucleótidos e ao mesmo tempo as mudanças conformacionais de Hsp90 e, assim, revela a cooperatividade entre os dois bolsos de vinculação de nucleotídeo de Hsp90.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1301">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Setup</td>
			<td style="width:445px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td style="width:347px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">vibration-damped optical table&#160;&#160;</td>
			<td style="width:445px;">Newport, Irvine, CA, USA</td>
			<td style="width:167px;">RS2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">OBIS 473nm LX 75mW LASER</td>
			<td style="width:445px;">Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA</td>
			<td style="width:167px;">1185052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">OBIS 532nm LS 50mW LASER</td>
			<td style="width:445px;">Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA</td>
			<td style="width:167px;">1261779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">OBIS 594nm LS 60mW LASER</td>
			<td style="width:445px;">Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA</td>
			<td style="width:167px;">1233470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">OBIS 637nm LX 140mW LASER</td>
			<td style="width:445px;">Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA</td>
			<td style="width:167px;">1196625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">laser control unit</td>
			<td style="width:445px;">Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA</td>
			<td style="width:167px;">1234465</td>
			<td style="width:347px;">Scientific Remote</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">aspheric telescope lenses</td>
			<td style="width:445px;">Thorlabs Inc, Newton, New Jersey, USA</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>d=25.4mm, f=50mm and f=100mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">CF ex1</td>
			<td style="width:445px;">AHF analysentechnik AG, T&#252;bingen, Germany</td>
			<td style="width:167px;">ZET 473/10</td>
			<td>cleanup filter excitation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">CF ex2</td>
			<td style="width:445px;">AHF analysentechnik AG, T&#252;bingen, Germany</td>
			<td style="width:167px;">ZET 532/10</td>
			<td>cleanup filter excitation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">CF ex3</td>
			<td style="width:445px;">AHF analysentechnik AG, T&#252;bingen, Germany</td>
			<td style="width:167px;">ZET 594/10</td>
			<td>cleanup filter excitation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">CF ex4</td>
			<td style="width:445px;">Thorlabs Inc, Newton, New Jersey, USA</td>
			<td>FL635-10</td>
			<td>cleanup filter excitation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">DM ex1</td>
			<td style="width:445px;">AHF analysentechnik AG, T&#252;bingen, Germany</td>
			<td style="width:167px;">ZQ594RDC</td>
			<td>dichroic mirror excitation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">DM ex2</td>
			<td style="width:445px;">AHF analysentechnik AG, T&#252;bingen, Germany</td>
			<td style="width:167px;">570DCXR</td>
			<td>dichroic mirror excitation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">DM ex3</td>
			<td style="width:445px;">AHF analysentechnik AG, T&#252;bingen, Germany</td>
			<td style="width:167px;">ZQ491RDC</td>
			<td>dichroic mirror excitation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">AOTFnC-Vis</td>
			<td style="width:445px;">AA Opto-Electronic, Orsay, France</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">&#955;/4 plate</td>
			<td style="width:445px;">Thorlabs Inc, Newton, New Jersey, USA</td>
			<td style="width:167px;">AQWP05M-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">CFI Apo TIRF 100x</td>
			<td style="width:445px;">Nikon Instruments Inc, Melville, NY, USA</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>high-NA objective</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">piezo focus positioner MIPOS 250 CAP</td>
			<td style="width:445px;">piezosystem jena GmbH, Jena, Germany</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>Piezo Controller NV 40/1 CLE</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">piezo stepper</td>
			<td style="width:445px;">Newport, Irvine, CA, USA</td>
			<td>PZA12</td>
			<td>PZC200-KT NanoPZ Actuator Kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">achromatic aspheric lenses</td>
			<td style="width:445px;">Qioptiq Photonics GmbH &#38; Co. KG, G&#246;ttingen, Germany</td>
			<td style="width:167px;">G322-304-000</td>
			<td>d=50mm, f=200mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">adjustable optical slit</td>
			<td style="width:445px;">Owis GmbH, Staufen i. Br., Germany</td>
			<td>27.160.1212</td>
			<td>max. aperture 12 x 12 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">DM det1</td>
			<td style="width:445px;">AHF analysentechnik AG, T&#252;bingen, Germany</td>
			<td style="width:167px;">T 600 LPXR</td>
			<td>dichroic mirror detection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">DM det2</td>
			<td style="width:445px;">AHF analysentechnik AG, T&#252;bingen, Germany</td>
			<td style="width:167px;">H 560 LPXR superflat</td>
			<td>dichroic mirror detection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">DM det3</td>
			<td style="width:445px;">AHF analysentechnik AG, T&#252;bingen, Germany</td>
			<td style="width:167px;">HC BS R635</td>
			<td>dichroic mirror detection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">BP det1</td>
			<td style="width:445px;">AHF analysentechnik AG, T&#252;bingen, Germany</td>
			<td style="width:167px;">525/40 BrightLine HC</td>
			<td>bandpass filter detection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">BP det2</td>
			<td style="width:445px;">AHF analysentechnik AG, T&#252;bingen, Germany</td>
			<td style="width:167px;">586/20 BrightLine HC</td>
			<td>bandpass filter detection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">BP det3</td>
			<td style="width:445px;">AHF analysentechnik AG, T&#252;bingen, Germany</td>
			<td style="width:167px;">631/36 BrightLine HC</td>
			<td>bandpass filter detection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">BP det4</td>
			<td style="width:445px;">AHF analysentechnik AG, T&#252;bingen, Germany</td>
			<td style="width:167px;">700/75 ET Bandpass</td>
			<td>bandpass filter detection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">optical shutters detection</td>
			<td style="width:445px;">Vincent Associates, Rochester, NY, USA</td>
			<td style="width:167px;">Uniblitz VS25S2T0&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">EMCCD iXon Ultra 897</td>
			<td style="width:445px;">Andor Technology Ltd, Belfast, Northern Ireland</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">digital I/O card, PCIe-6535</td>
			<td style="width:445px;">National Instruments, Austin, Texas, USA</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">syringe pump</td>
			<td style="width:445px;">Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA</td>
			<td style="width:167px;">PHD22/2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Name</td>
			<td style="width:445px;">Company</td>
			<td style="width:167px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Flow chamber</td>
			<td style="width:445px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">quartz slides</td>
			<td style="width:445px;">G. Finkenbeiner Inc, Waltham, MA, USA</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>Spectrosil2000, h=3mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">TEGADERM film</td>
			<td style="width:445px;">3M Deutschland GmbH, Neuss, Germany</td>
			<td style="width:167px;">1626W</td>
			<td>10 x 12cm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">spray adhesive</td>
			<td style="width:445px;">3M Deutschland GmbH, Neuss, Germany</td>
			<td style="width:167px;">Photo Mount 050777</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">glycerol</td>
			<td style="width:445px;">Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany</td>
			<td style="width:167px;">Immersol G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">immersion oil</td>
			<td style="width:445px;">OLYMPUS EUROPA SE &#38; CO. KG, Hamburg, Germany</td>
			<td>IMMOIL-F30CC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">prism</td>
			<td style="width:445px;">Vogelsberger Quarzglastechnik GmbH, Hauzenberg, Germany</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>Suprasil1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">aluminium prism holder</td>
			<td style="width:445px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>custom built</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">hollow setscrews</td>
			<td style="width:445px;">Thorlabs Inc, Newton, New Jersey, USA</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>with custom drilling</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Tygon S3 E-3603 tubing</td>
			<td style="width:445px;">neoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany</td>
			<td style="width:167px;">2-4450</td>
			<td>ACF00001</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">PTFE tubing</td>
			<td style="width:445px;">Bohlender GmbH, Gr&#252;nsfeld, Germany</td>
			<td style="width:167px;">S1810-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Name</td>
			<td style="width:445px;">Company</td>
			<td style="width:167px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Sample</td>
			<td style="width:445px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">yeast Hsp90 D61C, Q385C_biotin</td>
			<td style="width:445px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>UniProt ID P02829</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Maleimide derivatives of Atto488, Atto550</td>
			<td style="width:445px;">ATTO-TEC GmbH, Siegen, Germany</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">AMP-PNP*</td>
			<td style="width:445px;">Jena Bioscience, Jena, Germany</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td style="width:347px;">&#947;-[(6-Aminohexyl)-imido]-AMP-PNP-Atto647N</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Fluospheres</td>
			<td style="width:445px;">Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td style="width:167px;">F8764</td>
			<td>amine-modified, 0.2 &#956;m, yellow-green fluorescent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Name</td>
			<td style="width:445px;">Company</td>
			<td style="width:167px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Software</td>
			<td style="width:445px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Andor Solis</td>
			<td style="width:445px;">Andor Technology Ltd, Belfast, Northern Ireland</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>version 4.30</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">LabVIEW</td>
			<td style="width:445px;">National Instruments, Austin, Texas, USA</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>version 2012, 32bit; misc. hardware control</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">MDS control software</td>
			<td style="width:445px;">AA Opto-Electronic, Orsay, France</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>version 2.03a</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Coherent Connection</td>
			<td style="width:445px;">Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>version 3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Igor Pro</td>
			<td style="width:445px;">WaveMetrics Inc, Portland, OR, USA</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>version 6.37</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using three-color single-molecule fret to study the correlation of protein interactions

Transferência de energia de ressonância do único-molécula Förster (smFRET) tornou-se uma técnica amplamente utilizada biofísica para estudar a dinâmica de biomoléculas. Para muitas máquinas moleculares em proteínas uma célula tem de agir em conjunto com parceiros de interação em um ciclo funcional a cumprir sua tarefa. A extensão de duas cores para cor multi smFRET possibilita a sonda simultaneamente mais de uma interação ou mudança conformacional. Isto não só acrescenta uma nova dimensão às experiências de smFRET, mas também oferece a possibilidade única de estudar diretamente a sequência de eventos e para detectar interações correlacionadas ao usar uma amostra de imobilizado e uma fluorescência de reflexão interna total microscópio (TIRFM). Portanto, multi cor smFRET é uma ferramenta versátil para estudar biomolecular complexos de forma quantitativa e em um detalhe anteriormente inatingível.
Aqui, demonstramos como superar os desafios especiais de multi-cor smFRET experimentos sobre proteínas. Apresentamos a protocolos detalhados para obtenção dos dados e para extrair as informações cinéticas. Isso inclui os critérios de seleção de rastreamento, separação do estado e a recuperação de trajetórias de estado a partir dos dados ruidosos usando um ensemble 3D Hidden modelo de Markov (HMM). Em comparação com outros métodos, as informações cinéticas não são recuperadas de histogramas de tempo de interrupção mas diretamente do HMM. O quadro de máxima verossimilhança nos permite avaliar criticamente o modelo cinético e prever as taxas significativas incertezas.
Através da aplicação de nosso método para a proteína de choque do calor 90 (Hsp90), somos capazes de separar a ligação de nucleotídeos e as globais mudanças conformacionais da proteína. Isso nos permite observar diretamente a cooperatividade entre os dois bolsos de vinculação do nucleotide do dímero Hsp90.

Medições de cor multi smFRET permitem a detecção directa de correlação entre dois ou mais sites de interação distintos. Isso torna a técnica exclusiva para investigar sistemas multicomponentes, tais como os complexos da proteína. Focalizamos a apresentação de um experimento de três cores de smFRET aqui, que serve como um exemplo ilustrativo.
O fluxo de trabalho geral do método é mostrado na Fi...

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Using Three-color Single-molecule FRET to Study the Correlation of Protein Interactions

Usando três cores único-molécula FRET para estudar a correlação de interações da proteína

Aqui, apresentamos um protocolo para obter dados de três cores de smFRET e sua análise com um ensemble 3D Hidden Markov modelo. Com esta abordagem, cientistas podem extrair informações cinéticas de sistemas complexos proteína, incluindo cooperatividade ou interações correlacionadas.

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) has become a widely used biophysical technique to study the dynamics of biomolecules. For ...

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JoVE Journal

Biochemistry

Fluorescence Anisotropy as a Tool to Study Protein-protein Interactions

Anisotropia de fluorescência como uma ferramenta para estudar as interações proteína-proteína

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is ...

Bioquímica

Structural Information from Single-molecule FRET Experiments Using the Fast Nano-positioning System

Informação estrutural de uma única molécula de FRET experimentos usando a Nano-posicionamento sistema rápido

Single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET) can be used to obtain structural information on biomolecular complexes in real-time. ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Usando andaime lipossomas para reconstituir interações proteína-proteína Lipid-proximal<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

FRET de alta precisão em nível de molécula única para determinação de estrutura de biomoléculas

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions

Peptídeos biotinylated célula-penetrante para estudar interações da proteína-proteína intracelular

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

Imobilização covalente de proteínas para a espectroscopia de força única molécula

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

OaAEP1-Mediated Enzymatic Synthesis and Immobilization of Polymerized Protein for Single-Molecule Force Spectroscopy

Síntese Enzimática Mediada oOAEP1 e Imobilização de Proteína Polimerizada para Espectroscopia de Força De Molécula Única

Chemical and bio-conjugation techniques have been developed rapidly in recent years and allow the building of protein polymers. However, a controlled ...

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting para o Estudo de Interações Proteicas em Caenorhabditis elegans

Fast oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting (HRPF) method used to study protein structure, protein-ligand interactions, ...

Making Precise and Accurate Single-Molecule FRET Measurements using the Open-Source smfBox

Fazendo medições de FRET de molécula única precisas e precisas usando o smfBox de código aberto

The smfBox is a recently developed cost-effective, open-source instrument for single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET), which makes ...