Name: using three-color single-molecule fret to study the correlation of protein interactions
Uploaded: 2018-01-30T14:00:00
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Este trabajo es financiado por la Fundación alemana de investigación (INST 39/969-1) y el Consejo Europeo de investigación a través del acuerdo de subvención del CEI n. 681891.

1. instalación y requisitos previos
<ol><li>Realizar las mediciones smFRET varios colores en un prisma de tipo TIRFM. Una descripción de una configuración de dos colores como una publicación de Zeus se da en referencia a12.<ol>
<li>Construir un TIRFM multicolor. Una disposición general se detalla en el 9.</li>
		<li>Uso cambiable, diodo bombeó el láser de onda continua de estado sólido, que hacen innecesario el uso de obturadores mecánicos en las vías de excitac...

<ol>
	<li>Nooren, I. M. A., Thornton, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+protein-protein+interactions.">Diversity of protein-protein interactions.</a> EMBO J. 22 (14), 3486-3492 (2003).</li><li>Marsh, J. A., Teichmann, S. 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Presentamos el procedimiento experimental para obtener datos smFRET tricolor para un sistema complejo de proteína y una descripción paso a paso del análisis de estas mediciones. Este enfoque ofrece la única posibilidad de evaluar directamente la correlación entre múltiples sitios de interacción o cambios conformacionales.
Para obtener datos de una sola molécula de multicolores adecuados en proteínas es importante realizar mediciones reproducibles en un bajo nivel de ruido. Esto puede ...

Muchas proteínas cumplen con su función en dinámicos complejos con otras moléculas, mediadas por cambios conformacionales y asociaciones transitorias en una amplia gama de escalas temporales1,2,3. Junto a una fuente externa de energía (e.g., ATP) estas interacciones dinámicas pueden conducir a direccionalidad en un ciclo funcional y, en definitiva, mantener el estado estacionario de no equilibrio en una célula, el requisito previo para la vida.
Para entender completamente estas máquinas moleculares, no es suficiente una descripción estática guiada por los estudios estructurales. Además, es esencial tener conocimiento del modelo cinético subyacente y para determinar las constantes de tipo cinético. Varios métodos existentes permiten a los investigadores estudiar la dinámica de las interacciones binarias entre dos moléculas de interés, por ejemplo, resonancia de plasmón superficial, métodos de relajación con una lectura espectroscópica (por ejemplo, salto o flujo detenido técnicas) y resonancia magnética nuclear. Sin embargo, su aplicabilidad es en la mayoría de los casos que se limita a simples sistemas de dos Estados (por ejemplo, un límite y un estado independiente) debido a la inherente a los experimentos de mayor promedio. En los casos donde están involucrados más Estados o productos intermedios, rinden sólo una mezcla compleja de las constantes de velocidad. Métodos de una sola molécula como pinzas ópticas o magnéticas o smFRET bicolor, es decir, un donante y un fluoróforo aceptor, con una muestra de superficie inmovilizada pueden recuperar las constantes de velocidad para todos observar cambios conformacionales. Sin embargo, cuando se trata de interacciones que afectan a más de un enlace, estos métodos siguen siendo limitados y la información sobre las interacciones de la posible correlación de los dos (o más) sólo será accesible a través de conclusiones indirectas de un conjunto de experimentos.
SmFRET multicolor4,5,6,7,8,9 ofrece la oportunidad de estudiar la interacción entre estos componentes directamente, en tiempo real y bajo condiciones fisiológicas cerca de10. Esto permite investigar por ejemplo, la Unión dependiente de la conformación de un ligando u otra proteína8,9,11. El enfoque general que se presenta aquí es a etiqueta de la proteína de interés en posiciones específicas, para unir una proteína a la superficie de la cámara de medición y seguimiento de la intensidad de fluorescencia con el tiempo en un tipo de prisma TIRFM (para detalles ver 9 , 12). la proximidad espacial de los diferentes tintes puede ser determinada luego de la transferencia de energía entre ellos. Etiquetado estrategias puede variar de proteína a proteína (revisada en 13) y directrices para evitar artefactos en smFRET medidas existen14.
Ya que un tinte de donantes puede transferir energía al aceptador diferentes tintes en un experimento de varios colores smFRET, la posición relativa de los colorantes no es accesible desde la excitación de un tinte solo15,16. Pero en combinación con alternancia de excitación láser (ALEX17y ha comentado en 18) este método proporciona toda la información espacio-temporal en fracciones de segundos y resolución sub-nanométrica.
En principio, alta resolución información estructural se logra mediante el uso de las distancias entre tintes calcula a partir de la combinación de todas intensidades de fluorescencia en un experimento smFRET multicolor con ALEX. Sin embargo, aquí nos enfocamos en la identificación de estado y separación así como la extracción de modelos cinéticos, donde varios color smFRET es indispensable. Cuando se desea "sólo" determinación estructural mediante triangulación, un conjunto de experimentos de dos colores smFRET más simples con alta relación de señal a ruido puede ser realizado12,19.
Utilizamos el parcial de la fluorescencia (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq1.jpg">) como un proxy para la transferencia de energía entre dos fluoróforos7. El PF es calculado de la intensidad de fluorescencia similar a la eficacia de traste de un experimento de dos colores:
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq2.jpg">
Donde, <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq3v2.jpg"> es la intensidad en el canal de emisión em después de excitación con color ex, y c es el aceptante con la longitud de onda más larga. Canales de detección representan la misma posición en la cámara de la muestra pero discos diferentes rangos espectrales de la luz de la fluorescencia. Utilizan el mismo identificador de excitación y emisión en este protocolo (es decir, "azul", "verde" y "rojo").
Debido a deficiencias experimentales las intensidades de fluorescencia medidos dependen no sólo en la transferencia de energía, sino también de propiedades fluoróforo y configuración. Para obtener la verdadera eficiencia de transferencia entre dos fluoróforos, las intensidades medidas tienen que corregirse. El siguiente procedimiento se basa en la referencia9. Factores de corrección para salida aparente (LC, es decir, la detección de fotones de un fluoróforo en un canal designada para otro tinte) y gamma aparente (ag, es decir, el rendimiento cuántico de fluorescencia del colorante y la eficiencia de la detección del canal) se obtiene de rastros de una sola molécula que muestran un aceptor evento de blanqueo.
La salida del tinte en cada canal de aceptador posible donante se calcula desde todos los puntos de datos en los rastros de fluorescencia grabado donde el tinte del aceptador de la blanqueada pero el donante es todavía fluorescente (<img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq4.jpg">):
<img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq5.jpg">
La media del histograma de salida se utiliza como el factor de salida aparente. Después de la corrección de fugas, el factor gamma aparente se determina desde el mismo conjunto de rastros. Se calcula dividiendo el cambio de fluorescencia en el canal del receptor por el cambio de fluorescencia en el canal de donantes sobre la decoloración del tinte aceptador:
<img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq6.jpg">
Donde c es otra vez el canal de detección para el aceptante con la longitud de onda más larga. La mediana de la distribución resultante se utiliza como el factor de corrección aparente.
Las intensidades corregidas en cada canal se obtienen por:
<img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq7.jpg">
Luego se calcula el PF según:
<img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq8.jpg">
Diferentes poblaciones pueden ser separadas en el espacio multidimensional atravesado por la s PF. La posición y la anchura de cada Estado se determina introduciendo los datos con funciones Gaussianas multidimensionales. Optimización posterior de un HMM global basado en los restos PF proporciona una descripción cuantitativa de la cinética observada. Incluso pequeños cambios de las tasas son detectables.
HMMs proporcionan una manera de inferir un modelo de estado de una colección de huellas de ruido tiempo. El sistema se considera en uno de una serie de discretos, Estados ocultos en cualquier momento y en la observación real (es decir, la emisión) es una función probabilística de este estado oculto20. En el caso de los datos de TIRFM smFRET, la emisión probabilidades b por el estado puede ser modelados por funciones de densidad de probabilidad gaussiana continua. En los puntos regularmente espaciados de tiempo discreto, las transiciones de uno a otro estado pueden ocurrir según la probabilidad de transición que es tiempo-invariante y sólo depende del estado actual. La matriz de transición A contiene estas probabilidades de transición unij entre todos los Estados ocultos. La distribución de estado inicial <img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq9.jpg"> da las probabilidades de estado específico <img alt="Equation 10" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq10.jpg"> para el primer punto de tiempo de un seguimiento de tiempo. Usando un enfoque de probabilidad máxima, estos parámetros pueden optimizarse para describir mejor los datos con el adelante-atrás y Baum-Welch algoritmos20,21. Esto produce los estimadores de máxima verosimilitud (MLE). Por último, se puede inferir la secuencia de estado que es muy probable que la trayectoria de observaciones con el algoritmo de Viterbi. A diferencia de otros análisis HMM de smFRET datos24,25,26 no utilizamos el HMM como una mera "atenuación" de los datos, pero extracto el modelo cinético de estado del conjunto de datos sin la necesidad para la instalación de tiempo de permanencia histogramas de27. HMM el análisis es hecho con scripts internos con Igor Pro. Aplicación del código se basa en la referencia21. Le ofrecemos un kit de software y los datos de ejemplares en nuestra pagina web para seguir las secciones 5 y 6 del presente Protocolo (https://www.singlemolecule.uni-freiburg.de/software/3d-fret). Software completo está disponible bajo petición.
Puntos en los datos con PF de tiempo < -1 o PF > 2 en cualquier canal de detección se asigna la probabilidad de emisión mínima para todos los Estados (10-200). Esto evita que las transiciones artificiales en estos puntos de datos.
Los parámetros para las probabilidades de emisión se obtienen a partir del ajuste del histograma PF 3D con funciones Gaussian como se describe en el paso 5.7. Estos parámetros se mantienen fijos durante la optimización de lo HMM.
En el enfoque presentado, el vector de distribución del estado inicial y la matriz de transición se utilizan a nivel mundial para describir todo el conjunto de huellas. Que se actualicen en todas las moléculas de N del conjunto de datos según referencia27base.
Parámetros de inicio para la distribución de estado inicial se determinan las proyecciones 2D del histograma PF (paso 5.3) y las probabilidades de transición estén en 0.05 a excepción de las probabilidades de permanecer en el mismo estado, que se eligen tales que la probabilidad de salir de un determinado Estado se normaliza a la unidad.
Un método de generación de perfiles de probabilidad se utiliza para dar intervalos de confianza (IC) para toda transición tarifas21,22, que sirven como significativas estimaciones de su incertidumbre. Para calcular los límites de la CI para una velocidad específica, la probabilidad de transición de interés se fija en un valor distinto de la EAM. Esto rinde la prueba modelo λ'. Una prueba de la razón (LR) de probabilidad de la probabilidad <img alt="Equation 16" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq16.jpg"> teniendo en cuenta el conjunto de datos 0 se realiza según:
<img alt="Equation 11" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq11.jpg">
El 95% de confianza limitado por el parámetro se alcanza cuando LR excede de 3.841, el cuantil del 95% de un x2-distribución con un grado de libertad22,23.
El poder del método se demuestra con la Hsp90. Esta proteína abundante se encuentra en bacterias y eucariotas y es parte de la respuesta de estrés celular28. Es un blanco de droga prometedor en el tratamiento de cáncer29. Hsp90 es un homodímero con un bolsillo de unión de nucleótido en el dominio N-terminal de cada subunidad30. Pueden experimentar transiciones entre al menos dos conformaciones distintas a nivel mundial, uno cerrado y uno N-terminal conformación abierta en forma de V,19,31,32. La naturaleza dimérica plantea directamente la cuestión de la interacción entre los dos sitios de unión de nucleótido en Hsp90.
A continuación, proporcionamos un protocolo paso a paso para la adquisición de datos y el análisis de un experimento smFRET tricolor en levadura Hsp90 y nucleótidos. La Unión dependiente de la conformación de la fluorescencia etiquetada AMP-PNP (PNP AMP *, un análogo no hidrolizables de la ATP) se analiza. La aplicación del procedimiento descrito permite el estudio de la Unión de nucleótidos y al mismo tiempo los cambios conformacionales de la Hsp90 y tal modo revela la cooperatividad entre los dos bolsillos de unión de nucleótido de Hsp90.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1301">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Setup</td>
			<td style="width:445px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td style="width:347px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">vibration-damped optical table&#160;&#160;</td>
			<td style="width:445px;">Newport, Irvine, CA, USA</td>
			<td style="width:167px;">RS2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">OBIS 473nm LX 75mW LASER</td>
			<td style="width:445px;">Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA</td>
			<td style="width:167px;">1185052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">OBIS 532nm LS 50mW LASER</td>
			<td style="width:445px;">Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA</td>
			<td style="width:167px;">1261779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">OBIS 594nm LS 60mW LASER</td>
			<td style="width:445px;">Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA</td>
			<td style="width:167px;">1233470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">OBIS 637nm LX 140mW LASER</td>
			<td style="width:445px;">Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA</td>
			<td style="width:167px;">1196625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">laser control unit</td>
			<td style="width:445px;">Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA</td>
			<td style="width:167px;">1234465</td>
			<td style="width:347px;">Scientific Remote</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">aspheric telescope lenses</td>
			<td style="width:445px;">Thorlabs Inc, Newton, New Jersey, USA</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>d=25.4mm, f=50mm and f=100mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">CF ex1</td>
			<td style="width:445px;">AHF analysentechnik AG, T&#252;bingen, Germany</td>
			<td style="width:167px;">ZET 473/10</td>
			<td>cleanup filter excitation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">CF ex2</td>
			<td style="width:445px;">AHF analysentechnik AG, T&#252;bingen, Germany</td>
			<td style="width:167px;">ZET 532/10</td>
			<td>cleanup filter excitation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">CF ex3</td>
			<td style="width:445px;">AHF analysentechnik AG, T&#252;bingen, Germany</td>
			<td style="width:167px;">ZET 594/10</td>
			<td>cleanup filter excitation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">CF ex4</td>
			<td style="width:445px;">Thorlabs Inc, Newton, New Jersey, USA</td>
			<td>FL635-10</td>
			<td>cleanup filter excitation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">DM ex1</td>
			<td style="width:445px;">AHF analysentechnik AG, T&#252;bingen, Germany</td>
			<td style="width:167px;">ZQ594RDC</td>
			<td>dichroic mirror excitation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">DM ex2</td>
			<td style="width:445px;">AHF analysentechnik AG, T&#252;bingen, Germany</td>
			<td style="width:167px;">570DCXR</td>
			<td>dichroic mirror excitation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">DM ex3</td>
			<td style="width:445px;">AHF analysentechnik AG, T&#252;bingen, Germany</td>
			<td style="width:167px;">ZQ491RDC</td>
			<td>dichroic mirror excitation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">AOTFnC-Vis</td>
			<td style="width:445px;">AA Opto-Electronic, Orsay, France</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">&#955;/4 plate</td>
			<td style="width:445px;">Thorlabs Inc, Newton, New Jersey, USA</td>
			<td style="width:167px;">AQWP05M-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">CFI Apo TIRF 100x</td>
			<td style="width:445px;">Nikon Instruments Inc, Melville, NY, USA</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>high-NA objective</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">piezo focus positioner MIPOS 250 CAP</td>
			<td style="width:445px;">piezosystem jena GmbH, Jena, Germany</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>Piezo Controller NV 40/1 CLE</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">piezo stepper</td>
			<td style="width:445px;">Newport, Irvine, CA, USA</td>
			<td>PZA12</td>
			<td>PZC200-KT NanoPZ Actuator Kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">achromatic aspheric lenses</td>
			<td style="width:445px;">Qioptiq Photonics GmbH &#38; Co. KG, G&#246;ttingen, Germany</td>
			<td style="width:167px;">G322-304-000</td>
			<td>d=50mm, f=200mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">adjustable optical slit</td>
			<td style="width:445px;">Owis GmbH, Staufen i. Br., Germany</td>
			<td>27.160.1212</td>
			<td>max. aperture 12 x 12 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">DM det1</td>
			<td style="width:445px;">AHF analysentechnik AG, T&#252;bingen, Germany</td>
			<td style="width:167px;">T 600 LPXR</td>
			<td>dichroic mirror detection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">DM det2</td>
			<td style="width:445px;">AHF analysentechnik AG, T&#252;bingen, Germany</td>
			<td style="width:167px;">H 560 LPXR superflat</td>
			<td>dichroic mirror detection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">DM det3</td>
			<td style="width:445px;">AHF analysentechnik AG, T&#252;bingen, Germany</td>
			<td style="width:167px;">HC BS R635</td>
			<td>dichroic mirror detection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">BP det1</td>
			<td style="width:445px;">AHF analysentechnik AG, T&#252;bingen, Germany</td>
			<td style="width:167px;">525/40 BrightLine HC</td>
			<td>bandpass filter detection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">BP det2</td>
			<td style="width:445px;">AHF analysentechnik AG, T&#252;bingen, Germany</td>
			<td style="width:167px;">586/20 BrightLine HC</td>
			<td>bandpass filter detection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">BP det3</td>
			<td style="width:445px;">AHF analysentechnik AG, T&#252;bingen, Germany</td>
			<td style="width:167px;">631/36 BrightLine HC</td>
			<td>bandpass filter detection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">BP det4</td>
			<td style="width:445px;">AHF analysentechnik AG, T&#252;bingen, Germany</td>
			<td style="width:167px;">700/75 ET Bandpass</td>
			<td>bandpass filter detection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">optical shutters detection</td>
			<td style="width:445px;">Vincent Associates, Rochester, NY, USA</td>
			<td style="width:167px;">Uniblitz VS25S2T0&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">EMCCD iXon Ultra 897</td>
			<td style="width:445px;">Andor Technology Ltd, Belfast, Northern Ireland</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">digital I/O card, PCIe-6535</td>
			<td style="width:445px;">National Instruments, Austin, Texas, USA</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">syringe pump</td>
			<td style="width:445px;">Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA</td>
			<td style="width:167px;">PHD22/2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Name</td>
			<td style="width:445px;">Company</td>
			<td style="width:167px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Flow chamber</td>
			<td style="width:445px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">quartz slides</td>
			<td style="width:445px;">G. Finkenbeiner Inc, Waltham, MA, USA</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>Spectrosil2000, h=3mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">TEGADERM film</td>
			<td style="width:445px;">3M Deutschland GmbH, Neuss, Germany</td>
			<td style="width:167px;">1626W</td>
			<td>10 x 12cm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">spray adhesive</td>
			<td style="width:445px;">3M Deutschland GmbH, Neuss, Germany</td>
			<td style="width:167px;">Photo Mount 050777</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">glycerol</td>
			<td style="width:445px;">Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany</td>
			<td style="width:167px;">Immersol G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">immersion oil</td>
			<td style="width:445px;">OLYMPUS EUROPA SE &#38; CO. KG, Hamburg, Germany</td>
			<td>IMMOIL-F30CC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">prism</td>
			<td style="width:445px;">Vogelsberger Quarzglastechnik GmbH, Hauzenberg, Germany</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>Suprasil1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">aluminium prism holder</td>
			<td style="width:445px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>custom built</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">hollow setscrews</td>
			<td style="width:445px;">Thorlabs Inc, Newton, New Jersey, USA</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>with custom drilling</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Tygon S3 E-3603 tubing</td>
			<td style="width:445px;">neoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany</td>
			<td style="width:167px;">2-4450</td>
			<td>ACF00001</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">PTFE tubing</td>
			<td style="width:445px;">Bohlender GmbH, Gr&#252;nsfeld, Germany</td>
			<td style="width:167px;">S1810-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Name</td>
			<td style="width:445px;">Company</td>
			<td style="width:167px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Sample</td>
			<td style="width:445px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">yeast Hsp90 D61C, Q385C_biotin</td>
			<td style="width:445px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>UniProt ID P02829</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Maleimide derivatives of Atto488, Atto550</td>
			<td style="width:445px;">ATTO-TEC GmbH, Siegen, Germany</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">AMP-PNP*</td>
			<td style="width:445px;">Jena Bioscience, Jena, Germany</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td style="width:347px;">&#947;-[(6-Aminohexyl)-imido]-AMP-PNP-Atto647N</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Fluospheres</td>
			<td style="width:445px;">Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td style="width:167px;">F8764</td>
			<td>amine-modified, 0.2 &#956;m, yellow-green fluorescent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Name</td>
			<td style="width:445px;">Company</td>
			<td style="width:167px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Software</td>
			<td style="width:445px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Andor Solis</td>
			<td style="width:445px;">Andor Technology Ltd, Belfast, Northern Ireland</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>version 4.30</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">LabVIEW</td>
			<td style="width:445px;">National Instruments, Austin, Texas, USA</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>version 2012, 32bit; misc. hardware control</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">MDS control software</td>
			<td style="width:445px;">AA Opto-Electronic, Orsay, France</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>version 2.03a</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Coherent Connection</td>
			<td style="width:445px;">Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>version 3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Igor Pro</td>
			<td style="width:445px;">WaveMetrics Inc, Portland, OR, USA</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>version 6.37</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using three-color single-molecule fret to study the correlation of protein interactions

Transferencia de energía de resonancia de una sola molécula Förster (smFRET) se ha convertido en una técnica ampliamente utilizada biofísica para estudiar la dinámica de las biomoléculas. Para muchas máquinas moleculares en las proteínas de una célula tienen que actuar junto con socios de la interacción en un ciclo funcional para cumplir con su tarea. La extensión de dos colores en multicolor smFRET permite sondear simultáneamente más de una interacción o cambio conformacional. Esto no sólo añade una nueva dimensión a los experimentos smFRET pero también ofrece la posibilidad única para estudiar directamente la secuencia de acontecimientos y detectar interacciones correlacionadas cuando se utiliza una muestra inmovilizada y una fluorescencia de la reflexión interna total microscopio (TIRFM). Por lo tanto, smFRET multicolor es una herramienta versátil para el estudio de complejos biomoleculares en términos cuantitativos y en un detalle previamente inalcanzable.
Aquí, demostramos cómo superar los problemas especiales de varios colores smFRET experimentos con proteínas. Presentamos protocolos detallados para la obtención de los datos y para extraer información cinética. Esto incluye criterios de selección de la traza, separación del estado y la recuperación de las trayectorias de estado de los datos de ruido utilizando un conjunto 3D modelo oculto de Markov (HMM). En comparación con otros métodos, la información cinética no se recupera de los histogramas de tiempo de permanencia pero directamente en el HMM. El marco de la máxima verosimilitud nos permite evaluar críticamente el modelo cinético y proveer incertidumbres significativas para las tasas.
Al aplicar nuestro método a la proteína de choque térmico 90 (Hsp90), somos capaces de desentrañar el enlace de nucleótidos y los globales cambios conformacionales de la proteína. Esto nos permite observar directamente la cooperatividad entre los dos bolsillos de unión de nucleótido del dimer de Hsp90.

SmFRET multicolor medidas permiten la detección directa de la correlación entre dos o más sitios de interacción diferentes. Esto hace que la técnica única para investigar sistemas de varios componentes, tales como complejos de la proteína. Nos centramos en la presentación de un experimento smFRET tricolor, que sirve como un ejemplo ilustrativo.
El flujo de trabajo general del método se muestra en la <strong class="xfig"...

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Using Three-color Single-molecule FRET to Study the Correlation of Protein Interactions

Uso del traste de una sola molécula a estudiar la correlación de las interacciones proteína

Aquí, presentamos un protocolo para obtener datos smFRET tricolor y su análisis con un conjunto 3D modelo de Markov ocultos. Con este enfoque, los científicos pueden extraer información cinética de sistemas complejos de la proteína, incluyendo cooperatividad o interacción correlacionadas.

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) has become a widely used biophysical technique to study the dynamics of biomolecules. For ...

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Péptidos de penetración celular biotinilado para estudiar interacciones de proteínas intracelulares

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

Inmovilización covalente de las proteínas para la espectroscopia de fuerza sola molécula

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

OaAEP1-Mediated Enzymatic Synthesis and Immobilization of Polymerized Protein for Single-Molecule Force Spectroscopy

Síntesis enzimática mediada por OaAEP1 e inmovilización de proteína polimerizada para espectroscopia de fuerza de una sola molécula

Chemical and bio-conjugation techniques have been developed rapidly in recent years and allow the building of protein polymers. However, a controlled ...

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

En Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting para el Estudio de Interacciones Proteicas en Caenorhabditis elegans

Fast oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting (HRPF) method used to study protein structure, protein-ligand interactions, ...

Making Precise and Accurate Single-Molecule FRET Measurements using the Open-Source smfBox

Realización de mediciones FRET precisas y precisas de una sola molécula utilizando el smfBox de código abierto

The smfBox is a recently developed cost-effective, open-source instrument for single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET), which makes ...