Name: using three-color single-molecule fret to study the correlation of protein interactions
Uploaded: 2018-01-30T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Three-color Single-molecule FRET to Study the Correlation of Protein Interactions at JoVE.com

Bu eser Alman Araştırma Vakfı (INST 39/969-1) ve Avrupa Araştırma Konseyi aracılığıyla ERC hibe sözleşmesi n. 681891 tarafından finanse edilmektedir.

1. Kurulum ve önkoşulları
<ol><li>Çok renkli smFRET ölçümleri bir prizma tipi TIRFM üzerinde gerçekleştirin. İki renkli kurulumuna ilişkin bir açıklama gibi bir Jüpiter yayın verilir başvuru12.<ol>
<li>Çok renkli TIRFM oluşturun. Genel bir düzen 9' detaylı.</li>
		<li>Kullanım değiştirilebilir, Diod pompalı katı hal mekanik panjurlar uyarma yolları kullanımı gereksiz hale sürekli dalga lazerler.</li>
		<li>Amaç girmek için arka taraftan uya...

<ol>
	<li>Nooren, I. M. A., Thornton, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+protein-protein+interactions.">Diversity of protein-protein interactions.</a> EMBO J. 22 (14), 3486-3492 (2003).</li><li>Marsh, J. A., Teichmann, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure,+dynamics,+assembly,+and+evolution+of+protein+complexes.">Structure, dynamics, assembly, and evolution of protein complexes.</a> Annu Rev Biochem. 84, 551-575 (2015).</li><li>Henzler-Wildman, K., Kern, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+personalities+of+proteins.">Dynamic personalities of proteins.</a> Nature. 450 (7172), 964-972 (2007).</li><li>Hohng, S., Joo, C., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Molecule+Three-Color+FRET.">Single-Molecule Three-Color FRET.</a> Biophys J. 87 (2), 1328-1337 (2004).</li><li>Person, B., Stein, I. H., Steinhauer, C., Vogelsang, J., Tinnefeld, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlated+movement+and+bending+of+nucleic+acid+structures+visualized+by+multicolor+single-molecule+spectroscopy.">Correlated movement and bending of nucleic acid structures visualized by multicolor single-molecule spectroscopy.</a> ChemPhysChem. 10 (9-10), 1455-1460 (2009).</li><li>Lee, J., Lee, S., Ragunathan, K., Joo, C., Ha, T., Hohng, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+four-color+FRET.">Single-molecule four-color FRET.</a> Angew Chem Int Ed. 49 (51), 9922-9925 (2010).</li><li>Ratzke, C., Berkemeier, F., Hugel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heat+shock+protein+90's+mechanochemical+cycle+is+dominated+by+thermal+fluctuations.">Heat shock protein 90's mechanochemical cycle is dominated by thermal fluctuations.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (1), 161-166 (2012).</li><li>Ratzke, C., Hellenkamp, B., Hugel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Four-colour+FRET+reveals+directionality+in+the+Hsp90+multicomponent+machinery.">Four-colour FRET reveals directionality in the Hsp90 multicomponent machinery.</a> Nat Commun. 5, 4192 (2014).</li><li>G&#246;tz, M., Wortmann, P., Schmid, S., Hugel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Multicolor+Single-Molecule+FRET+Approach+to+Study+Protein+Dynamics+and+Interactions+Simultaneously.">A Multicolor Single-Molecule FRET Approach to Study Protein Dynamics and Interactions Simultaneously.</a> Methods Enzymol. 581, 487-516 (2016).</li><li>Yengo, C. M., Berger, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+anisotropy+and+resonance+energy+transfer:+Powerful+tools+for+measuring+real+time+protein+dynamics+in+a+physiological+environment.">Fluorescence anisotropy and resonance energy transfer: Powerful tools for measuring real time protein dynamics in a physiological environment.</a> Curr Opin Pharmacol. 10 (6), 731-737 (2010).</li><li>Wortmann,P , ., Götz M, ., Hugel T , . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperative+Nucleotide+Binding+in+Hsp90+and+Its+Regulation+by+Aha1.">Cooperative Nucleotide Binding in Hsp90 and Its Regulation by Aha1.</a> Biophys J. 113, 1711-1718 (2017).</li><li>D&#246;rfler, T., Eilert, T., R&#246;cker, C., Nagy, J., Michaelis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+Information+from+Single-molecule+FRET+Experiments+Using+the+Fast+Nano-positioning+System.">Structural Information from Single-molecule FRET Experiments Using the Fast Nano-positioning System.</a> J Vis Exp. (120), e54782 (2017).</li><li>Stephanopoulos, N., Francis, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choosing+an+effective+protein+bioconjugation+strategy.">Choosing an effective protein bioconjugation strategy.</a> Nature chemical biology. 7 (12), 876-884 (2011).</li><li>S&#225;nchez-Rico, C., Voith von Voithenberg, L., Warner, L., Lamb, D. C., Sattler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Fluorophore+Attachment+on+Protein+Conformation+and+Dynamics+Studied+by+spFRET+and+NMR+Spectroscopy.">Effects of Fluorophore Attachment on Protein Conformation and Dynamics Studied by spFRET and NMR Spectroscopy.</a> Chemistry (Weinheim an der Bergstrasse, Germany). , (2017).</li><li>Roy, R., Hohng, S., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+single-molecule+FRET.">A practical guide to single-molecule FRET.</a> Nat Methods. 5 (6), 507-516 (2008).</li><li>Lee, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-color+alternating-laser+excitation+of+single+molecules:+monitoring+multiple+interactions+and+distances.">Three-color alternating-laser excitation of single molecules: monitoring multiple interactions and distances.</a> Biophys J. 92 (1), 303-312 (2007).</li><li>Kapanidis, A. N., Lee, N. K., Laurence, T. A., Doose, S., Margeat, E., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-aided+molecule+sorting:+analysis+of+structure+and+interactions+by+alternating-laser+excitation+of+single+molecules.">Fluorescence-aided molecule sorting: analysis of structure and interactions by alternating-laser excitation of single molecules.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (24), 8936-8941 (2004).</li><li>Hohlbein, J., Craggs, T. D., Cordes, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternating-laser+excitation:+single-molecule+FRET+and+beyond.">Alternating-laser excitation: single-molecule FRET and beyond.</a> Chem Soc Rev. 43 (4), 1156-1171 (2014).</li><li>Hellenkamp, B., Wortmann, P., Kandzia, F., Zacharias, M., Hugel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multidomain+structure+and+correlated+dynamics+determined+by+self-consistent+FRET+networks.">Multidomain structure and correlated dynamics determined by self-consistent FRET networks.</a> Nat Methods. 14, 174-180 (2017).</li><li>Rabiner, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tutorial+on+hidden+Markov+models+and+selected+applications+in+speech+recognition.">A tutorial on hidden Markov models and selected applications in speech recognition.</a> Proc IEEE. 77 (2), 257-286 (1989).</li><li>Fink, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Markov Models for Pattern Recognition. , (2014).</li><li>Giudici, P., Ryden, T., Vandekerkhove, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Likelihood-Ratio+Tests+for+Hidden+Markov+Models.">Likelihood-Ratio Tests for Hidden Markov Models.</a> Biometrics. 56 (3), 742-747 (2000).</li><li>Visser, I., Raijmakers, M. E. J., Molenaar, P. C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confidence+intervals+for+hidden+Markov+model+parameters.">Confidence intervals for hidden Markov model parameters.</a> Br J Math Stat Psychol. 53 (2), 317-327 (2000).</li><li>McKinney, S. A., Joo, C., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Single-Molecule+FRET+Trajectories+Using+Hidden+Markov+Modeling.">Analysis of Single-Molecule FRET Trajectories Using Hidden Markov Modeling.</a> Biophys J. 91 (5), 1941-1951 (2006).</li><li>Bronson, J. E., Fei, J., Hofman, J. M., Gonzalez, R. L., Wiggins, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Learning+Rates+and+States+from+Biophysical+Time+Series:+A+Bayesian+Approach+to+Model+Selection+and+Single-Molecule+FRET+Data.">Learning Rates and States from Biophysical Time Series: A Bayesian Approach to Model Selection and Single-Molecule FRET Data.</a> Biophys J. 97 (12), 3196-3205 (2009).</li><li>Greenfeld, M., Pavlichin, D. S., Mabuchi, H., Herschlag, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Molecule+Analysis+Research+Tool+(SMART):+an+integrated+approach+for+analyzing+single+molecule+data.">Single Molecule Analysis Research Tool (SMART): an integrated approach for analyzing single molecule data.</a> PLoS ONE. 7 (2), e30024 (2012).</li><li>Schmid, S., G&#246;tz, M., Hugel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Molecule+Analysis+beyond+Dwell+Times:+Demonstration+and+Assessment+in+and+out+of+Equilibrium.">Single-Molecule Analysis beyond Dwell Times: Demonstration and Assessment in and out of Equilibrium.</a> Biophys J. 111 (7), 1375-1384 (2016).</li><li>Taipale, M., Jarosz, D. F., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HSP90+at+the+hub+of+protein+homeostasis:+emerging+mechanistic+insights.">HSP90 at the hub of protein homeostasis: emerging mechanistic insights.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (7), 515-528 (2010).</li><li>Trepel, J., Mollapour, M., Giaccone, G., Neckers, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+dynamic+HSP90+complex+in+cancer.">Targeting the dynamic HSP90 complex in cancer.</a> Nat Rev Cancer. 10 (8), 537-549 (2010).</li><li>Wayne, N., Bolon, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dimerization+of+Hsp90+is+required+for+in+vivo+function.+Design+and+analysis+of+monomers+and+dimers.">Dimerization of Hsp90 is required for in vivo function. Design and analysis of monomers and dimers.</a> J Biol Chem. 282 (48), 35386-35395 (2007).</li><li>Ali, M. M. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+an+Hsp90-nucleotide-p23/Sba1+closed+chaperone+complex.">Crystal structure of an Hsp90-nucleotide-p23/Sba1 closed chaperone complex.</a> Nature. 440 (7087), 1013-1017 (2006).</li><li>Southworth, D. R., Agard, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species-dependent+ensembles+of+conserved+conformational+states+define+the+Hsp90+chaperone+ATPase+cycle.">Species-dependent ensembles of conserved conformational states define the Hsp90 chaperone ATPase cycle.</a> Mol Cell. 32 (5), 631-640 (2008).</li><li>Blanchard, S. C., Kim, H. D., Gonzalez, R. L., Puglisi, J. D., Chu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=tRNA+dynamics+on+the+ribosome+during+translation.">tRNA dynamics on the ribosome during translation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (35), 12893-12898 (2004).</li><li>Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Oxygen+Scavenging+System+for+Improvement+of+Dye+Stability+in+Single-Molecule+Fluorescence+Experiments.">An Oxygen Scavenging System for Improvement of Dye Stability in Single-Molecule Fluorescence Experiments.</a> Biophys J. 94 (5), 1826-1835 (2008).</li><li>Swoboda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+oxygen+scavenging+for+photostability+without+pH+drop+in+single-molecule+experiments.">Enzymatic oxygen scavenging for photostability without pH drop in single-molecule experiments.</a> ACS Nano. 6 (7), 6364-6369 (2012).</li><li>Rognoni, L., Stigler, J., Pelz, B., Yl&#228;nne, J., Rief, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+force+sensing+of+filamin+revealed+in+single-molecule+experiments.">Dynamic force sensing of filamin revealed in single-molecule experiments.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (48), 19679-19684 (2012).</li><li>Okumus, B., Wilson, T. J., Lilley, D. M. J., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicle+encapsulation+studies+reveal+that+single+molecule+ribozyme+heterogeneities+are+intrinsic.">Vesicle encapsulation studies reveal that single molecule ribozyme heterogeneities are intrinsic.</a> Biophys J. 87 (4), 2798-2806 (2004).</li><li>Boukobza, E., Sonnenfeld, A., Haran, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilization+in+Surface-Tethered+Lipid+Vesicles+as+a+New+Tool+for+Single+Biomolecule+Spectroscopy.">Immobilization in Surface-Tethered Lipid Vesicles as a New Tool for Single Biomolecule Spectroscopy.</a> J Phys Chem B. 105 (48), 12165-12170 (2001).</li><li>Levene, M. J., Korlach, J., Turner, S. W., Foquet, M., Craighead, H. G., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zero-mode+waveguides+for+single-molecule+analysis+at+high+concentrations.">Zero-mode waveguides for single-molecule analysis at high concentrations.</a> Science. 299 (5607), 682-686 (2003).</li><li>Panaretou, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP+binding+and+hydrolysis+are+essential+to+the+function+of+the+Hsp90+molecular+chaperone+in+vivo.">ATP binding and hydrolysis are essential to the function of the Hsp90 molecular chaperone in vivo.</a> EMBO J. 17 (16), 4829-4836 (1998).</li></ol>

Biz karmaşık protein sistemi ve adım adım açıklamasını bu ölçümlerin analiz için üç renkli smFRET verileri elde etmek için deneysel bir işlem mevcut. Bu yaklaşım doğrudan birden fazla etkileşim siteleri veya konformasyon değişiklikler arasındaki ilişki değerlendirmek için benzersiz imkanı sunuyor.
Proteinler üzerinde uygun çok renkli tek molekül verilerini elde etmek için düşük gürültü seviyesi, tekrarlanabilir ölçümler işlemi yapılması önemlidir. Bu...

Çoğu protein işlevlerine konformasyon değişiklikler ve geçici dernekler zaman ölçeği1,2,3geniş bir dizi tarafından aracılı diğer molekülleri ile dinamik komplekslerinde yerine getirmek. Bir dış enerji kaynağı (Örneğin, ATP) bu dinamik etkileşimler yön için işlevsel bir döngü içinde kurşun ve sonuçta sigara denge kararlı durum hücrede, yaşam için önkoşul korumak için birleştiğinde.
Bu moleküler makineler tam anlamak için yapısal çalışmaları tarafından destekli bir statik tanım yeterli değildir. Buna ek olarak, temel Kinetik modeli bilgisine sahip ve Kinetik hızı sabitler belirlemek için önemlidir. Birkaç varolan yöntemler araştırmacılar faiz, Örneğin, yüzey plasmon rezonans, gevşeme yöntemleri (Örneğin, atlama veya durdu-akış spektroskopik bir okuma ile iki molekül arasında ikili etkileşimleri dinamikleri çalışmaya olanak sağlar. teknikleri) ve Nükleer manyetik rezonans. Ancak, çoğu durumda toplu deneyler için doğal sayı ortalaması nedeniyle basit iki durumlu sistemleri (Örneğin, bir bağlı ve bir ilişkisiz devlet) sınırlı onların geçerliliği uygulanır. Nerede daha fazla Birleşik veya ara ürün söz konusu durumlarda, onlar hızı sabitler yalnızca karmaşık bir karışımı verim. Optik veya manyetik cımbız veya iki renkli smFRET, Yani, bir donör ve yüzey immobilize örnek ile bir alıcısı fluorophore gibi tek molekül yöntemleri hızı sabitler için tüm konformasyon değişiklikleri gözlenen kurtarabilirsiniz. Ancak, birden fazla bağlama sitesi etkileyen etkileşimlerine gelince, bu yöntemler sınırlı kalır ve olası korelasyon iki (veya daha fazla) etkileşimleri hakkında bilgi-ecek var olmak yanına varılabilir yolu ile dolaylı sonuçlar deneyler bir dizi sadece.
Çok renkli smFRET4,5,6,7,8,9 doğrudan, gerçek zamanlı ve altında bu bileşenler arasındaki etkileşim çalışma fırsatı sunuyor yakınındaki fizyolojik şartlarda10. Bu bir örneğin, uyum bağımlı bağlayıcı bir ligand veya başka bir protein8,9,11araştırmak için izin verir. Burada sunulan genel yaklaşım belirli konumlarda, ölçüm odası yüzeye bir protein eklemek ve floresan yoğunluğu üzerinde bir prizma tipi TIRFM (için Ayrıntılar bkz: 9 saat içinde izlemek için ilgi protein(s) etiket etmektir , 12). farklı boya kayma yakınlığı sonra aralarında enerji transferi dan belirlenebilir. Stratejileri etiketleme protein ( 13' te gözden) protein değişiklik gösterebilir ve14smFRET ölçümleri aktarımında önlemek için kurallar yok.
Bir donör boya enerji farklı alıcısı boyalar çok renkli smFRET deneyinde transfer bu yana, tüm boyalar göreli konumunu bir boya tek başına15,16uyarma erişilebilir durumda değil. Ama lazer uyarma (ALEX17ve olarak gözden geçirilmiş 18) alternatif ile birlikte bu yöntem tüm spatio-temporal bilgi alt ikinci ve alt nanometre çözünürlük sağlar.
Prensipte, hesaplanan bir çok renkli smFRET denemede tüm Floresans yoğunluklarını ALEX ile birlikte yüksek çözünürlüklü yapısal bilgi arası boya mesafeler kullanarak elde edilebilir. Ancak, burada ayıklama çok renkli smFRET vazgeçilmez nerede Kinetik modellerin yanı sıra durumu kimliğini doğrulamak ve ayrılık ele. "Sadece" yapı belirlenmesi üç taraflı kur çevrimi tarafından istendiğinde, yüksek sinyal gürültü oranı ile daha basit iki renkli smFRET deneyler bir dizi gerçekleştirilen12,19olabilir.
Kısmi Floresans kullandığımız (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq1.jpg">) iki fluorophores7arasında enerji transferi için bir proxy gibi. PF floresan yoğunluğu iki renkli deney FRET verimliliğini benzer hesaplanır:
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq2.jpg">
Nerede, <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq3v2.jpg"> emisyon kanal em şiddeti uyarma renk exile sonra ise c en uzun dalga boyu ile alıcısı. Algılama kanalları örnek odası ama kayıt farklı spektral aralıklar Floresan ışık aynı pozisyonda temsil eder. Tanımlayıcının uyarma ve emisyon için bu protokol için kullanılır (Örneğin, "mavi," "yeşil" ve "kırmızı").
Deneysel eksiklikleri nedeniyle ölçülen Floresans yoğunluklarda sadece enerji transferi aynı zamanda fluorophore ve kurulum özellikleri bağlıdır. İki fluorophores arasında gerçek enerji transfer verimi elde etmek için ölçülen yoğunluklarda düzeltilmesi gerekiyor. Aşağıdaki yordam başvuru9üzerinde temel alır. Belirgin sızıntı (lk, bir fluorophore bir kanalda gelen fotonlar tespiti için başka bir boya belirlenmiş Yani ) ve belirgin gama düzeltme faktörleri (ag, Yani, boya Floresans kuantum verimi ve algılama verimliliği kanal) olay beyazlatma bir alıcısı göstermek tek molekül izleri elde edilir.
Donör boya her olası alıcısı kanal içine kaçağı tüm veri noktaları nerede alıcısı boya ağartılmış ama hala floresan verici kaydedilen Floresans izlemeler hesaplanır (<img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq4.jpg">):
<img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq5.jpg">
Sızıntı çubuk grafik sayılarının belirgin sızıntı faktörü kullanılır. Sızıntı için Düzeltme yapıldıktan sonra izleri aynı kümesinden belirgin gama faktörü belirlenir. Floresans Alıcısı Kanal değişikliği Floresans alıcısı boya ağartma üzerine donör kanal değişikliği tarafından bölünerek hesaplanır:
<img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq6.jpg">
C daha uzun dalga boyu ile alıcısı için algılama kanal olduğu yerde. Elde edilen dağıtım sayılarının belirgin düzeltme faktörü kullanılır.
Her kanaldaki düzeltilmiş yoğunluklarda tarafından elde edilir:
<img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq7.jpg">
PF sonra göre hesaplanır:
<img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq8.jpg">
Farklı popülasyonlar PFs tarafından yayılmış çok boyutlu uzayda ayrılabilir. Pozisyon ve genişliği her devletin çok boyutlu Gauss işlevlerle veri yaklaştırarak belirlenir. Tüm PF izlemeler üzerinde dayalı bir küresel HMM sonraki optimizasyonu gözlenen Kinetik nicel bir açıklamasını sağlar. Oranları küçük değişiklikler bile algılanabilir.
HMMs bir devlet modeli gürültülü zaman izlemeler koleksiyonundan gösterilirken bir yol sağlar. Sistem olarak ayrı, bir dizi birinde herhangi bir zamanda ve gerçek gözlem (Yani, emisyon) gizli durumlar bu gizli devlet20olasılıkçı bir fonksiyonu olduğunu kabul edilir. TIRFM smFRET veri söz konusu olduğunda, emisyon olasılıklar bben devlet ben başına sürekli Gauss olasılık yoğunluğu işlevleri tarafından modellenebilir. Düzenli aralıklı ayrık zaman noktalarda, bir başka bir duruma geçişler zaman değişmeyen ve yalnızca geçerli durumuna bağlıdır geçiş olasılık göre oluşabilir. Geçiş matrisi A tüm gizli durumlar arasında bu geçiş olasılıklar birIJ içerir. Başlangıç durumu dağıtım <img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq9.jpg"> duruma özgü değerler verir <img alt="Equation 10" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq10.jpg"> bir zaman izleme noktası ilk saat için. Bir maksimum olabilirlik yaklaşım kullanarak, bu parametreler en iyi ileri geri ve Baum-Welch algoritmaları20,21ile verileri tanımlamak için optimize edilebilir. Bu maksimum olabilirlik estimators (MLE) sonuçlanır. Son olarak, büyük olasılıkla gözlemler yörüngesini üretilen devlet sıra Viterbi algoritması ile anlaşılmaktadır olabilir. SmFRET veri24,25,26 diğer HMM analizleri aksine biz bir sadece "veri ama özü Kinetik devlet modeli gerek kalmadan veri kümesinden Işınma Zamanı uygun için düzeltme" olarak HMM kullanmayın çubuk grafikler27. HMM analiz şirket içinde komut dosyalarını Igor Pro kullanarak yapılır. Kod uygulaması başvuru21tarihinde temel alır. Biz bir yazılım seti ve örnek veri bizim Web sayfasında bölüm 5 ve 6 bu iletişim kuralı (https://www.singlemolecule.uni-freiburg.de/software/3d-fret) / izleyebilmek için sağlar. Dolu bilgisayar yazılımı elde edilebilir üzerinde rica.
Zaman PF ile veri noktaları < -1 veya PF > 2 herhangi bir algılama kanaldaki en az emisyon olasılık tüm durumları (10-200) atanır. Bu yapay geçişleri bu veri noktalarında engeller.
Emisyon değerler için parametreleri 3D PF histogram Gauss işlevleri ile uyum 5,7 adımda anlatıldığı gibi elde edilir. Bu parametreler HMM en iyileştirme sırasında sabit tutulur.
Sunulan yaklaşımda başlangıç durumu dağıtım vektör ve geçiş matrisi genel olarak izlemeler tüm topluluğu tanımlamak için kullanılır. Onlar başvuru27göre veri kümesinden tüm N molekülleri göre güncelleştirilir.
Başlangıç durumu dağıtım için başlangıç parametreleri PF çubuk grafik (Adım 5.3) 2D projeksiyonlar belirlenir ve geçiş olasılıklar için 0,05 değerler dışında aynı durumda kalmak gibi seçilen ayarlanır belirli bir eyalet dışına çıkmasına olasılık birlik için normalleştirilmiş.
Bir olasılık profil çıkarma yöntemi için onların belirsizlik için anlamlı tahminleri olarak hizmet tüm geçiş oranları21,22, güven aralıkları (CIS) vermek için kullanılır. Özel bir oranın CI sınırları hesaplamak için geçiş olasılık ilgi MLE dışında bir değere sabittir. Bu test modeli λ verimleri '. Olasılığını bir olasılık oranı (LR) test <img alt="Equation 16" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq16.jpg"> veri kümesi 0 göre gerçekleştirilir:
<img alt="Equation 11" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq11.jpg">
Zaman aşıyor LR 3.841, bir 2x% 95 parametreli parametre ulaşılır için bağlı % 95 güven-dağıtım ile bir özgürlük derecesi22,23.
Yöntemin gücünü Hsp90 kullanarak gösterilmiştir. Bu bol protein bakteri ve Ökaryotlar bulunur ve hücresel stres yanıt28parçasıdır. Bu bir kanser tedavi29gelecek vaat eden uyuşturucu hedeftir. Hsp90 bir homodimer bir nükleotit bağlama cep her alt birim30N-terminal etki alanında olduğunu. En az iki genel olarak farklı biçimler, kapalı bir ve bir N-terminal açık, V şeklinde conformation19,31,32arasında geçişler uygulayabilir. Dimerik doğa doğrudan Hsp90 İki nükleotid bağlama siteler arasında Interplay soruyu da gündeme getiriyor.
Aşağıda, biz veri toplama ve analizi Maya Hsp90 ve nükleotit bir üç renkli smFRET deney için adım adım bir protokol sağlar. Fluorescently etiketli AMP-PNP conformation bağımlı bağlantısını (AMP PNP *, ATP hydrolyzable olmayan bir analog) analiz edilir. Açıklanan yordamın uygulanması Hsp90 konformasyon değişiklikleri nükleotit bağlama ve aynı zamanda çalışma ruhsatı ve böylece cooperativity Hsp90 ve iki nükleotid bağlama cepler arasında ortaya koymaktadır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1301">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Setup</td>
			<td style="width:445px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td style="width:347px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">vibration-damped optical table&#160;&#160;</td>
			<td style="width:445px;">Newport, Irvine, CA, USA</td>
			<td style="width:167px;">RS2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">OBIS 473nm LX 75mW LASER</td>
			<td style="width:445px;">Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA</td>
			<td style="width:167px;">1185052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">OBIS 532nm LS 50mW LASER</td>
			<td style="width:445px;">Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA</td>
			<td style="width:167px;">1261779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">OBIS 594nm LS 60mW LASER</td>
			<td style="width:445px;">Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA</td>
			<td style="width:167px;">1233470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">OBIS 637nm LX 140mW LASER</td>
			<td style="width:445px;">Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA</td>
			<td style="width:167px;">1196625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">laser control unit</td>
			<td style="width:445px;">Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA</td>
			<td style="width:167px;">1234465</td>
			<td style="width:347px;">Scientific Remote</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">aspheric telescope lenses</td>
			<td style="width:445px;">Thorlabs Inc, Newton, New Jersey, USA</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>d=25.4mm, f=50mm and f=100mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">CF ex1</td>
			<td style="width:445px;">AHF analysentechnik AG, T&#252;bingen, Germany</td>
			<td style="width:167px;">ZET 473/10</td>
			<td>cleanup filter excitation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">CF ex2</td>
			<td style="width:445px;">AHF analysentechnik AG, T&#252;bingen, Germany</td>
			<td style="width:167px;">ZET 532/10</td>
			<td>cleanup filter excitation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">CF ex3</td>
			<td style="width:445px;">AHF analysentechnik AG, T&#252;bingen, Germany</td>
			<td style="width:167px;">ZET 594/10</td>
			<td>cleanup filter excitation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">CF ex4</td>
			<td style="width:445px;">Thorlabs Inc, Newton, New Jersey, USA</td>
			<td>FL635-10</td>
			<td>cleanup filter excitation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">DM ex1</td>
			<td style="width:445px;">AHF analysentechnik AG, T&#252;bingen, Germany</td>
			<td style="width:167px;">ZQ594RDC</td>
			<td>dichroic mirror excitation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">DM ex2</td>
			<td style="width:445px;">AHF analysentechnik AG, T&#252;bingen, Germany</td>
			<td style="width:167px;">570DCXR</td>
			<td>dichroic mirror excitation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">DM ex3</td>
			<td style="width:445px;">AHF analysentechnik AG, T&#252;bingen, Germany</td>
			<td style="width:167px;">ZQ491RDC</td>
			<td>dichroic mirror excitation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">AOTFnC-Vis</td>
			<td style="width:445px;">AA Opto-Electronic, Orsay, France</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">&#955;/4 plate</td>
			<td style="width:445px;">Thorlabs Inc, Newton, New Jersey, USA</td>
			<td style="width:167px;">AQWP05M-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">CFI Apo TIRF 100x</td>
			<td style="width:445px;">Nikon Instruments Inc, Melville, NY, USA</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>high-NA objective</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">piezo focus positioner MIPOS 250 CAP</td>
			<td style="width:445px;">piezosystem jena GmbH, Jena, Germany</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>Piezo Controller NV 40/1 CLE</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">piezo stepper</td>
			<td style="width:445px;">Newport, Irvine, CA, USA</td>
			<td>PZA12</td>
			<td>PZC200-KT NanoPZ Actuator Kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">achromatic aspheric lenses</td>
			<td style="width:445px;">Qioptiq Photonics GmbH &#38; Co. KG, G&#246;ttingen, Germany</td>
			<td style="width:167px;">G322-304-000</td>
			<td>d=50mm, f=200mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">adjustable optical slit</td>
			<td style="width:445px;">Owis GmbH, Staufen i. Br., Germany</td>
			<td>27.160.1212</td>
			<td>max. aperture 12 x 12 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">DM det1</td>
			<td style="width:445px;">AHF analysentechnik AG, T&#252;bingen, Germany</td>
			<td style="width:167px;">T 600 LPXR</td>
			<td>dichroic mirror detection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">DM det2</td>
			<td style="width:445px;">AHF analysentechnik AG, T&#252;bingen, Germany</td>
			<td style="width:167px;">H 560 LPXR superflat</td>
			<td>dichroic mirror detection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">DM det3</td>
			<td style="width:445px;">AHF analysentechnik AG, T&#252;bingen, Germany</td>
			<td style="width:167px;">HC BS R635</td>
			<td>dichroic mirror detection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">BP det1</td>
			<td style="width:445px;">AHF analysentechnik AG, T&#252;bingen, Germany</td>
			<td style="width:167px;">525/40 BrightLine HC</td>
			<td>bandpass filter detection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">BP det2</td>
			<td style="width:445px;">AHF analysentechnik AG, T&#252;bingen, Germany</td>
			<td style="width:167px;">586/20 BrightLine HC</td>
			<td>bandpass filter detection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">BP det3</td>
			<td style="width:445px;">AHF analysentechnik AG, T&#252;bingen, Germany</td>
			<td style="width:167px;">631/36 BrightLine HC</td>
			<td>bandpass filter detection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">BP det4</td>
			<td style="width:445px;">AHF analysentechnik AG, T&#252;bingen, Germany</td>
			<td style="width:167px;">700/75 ET Bandpass</td>
			<td>bandpass filter detection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">optical shutters detection</td>
			<td style="width:445px;">Vincent Associates, Rochester, NY, USA</td>
			<td style="width:167px;">Uniblitz VS25S2T0&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">EMCCD iXon Ultra 897</td>
			<td style="width:445px;">Andor Technology Ltd, Belfast, Northern Ireland</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">digital I/O card, PCIe-6535</td>
			<td style="width:445px;">National Instruments, Austin, Texas, USA</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">syringe pump</td>
			<td style="width:445px;">Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA</td>
			<td style="width:167px;">PHD22/2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Name</td>
			<td style="width:445px;">Company</td>
			<td style="width:167px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Flow chamber</td>
			<td style="width:445px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">quartz slides</td>
			<td style="width:445px;">G. Finkenbeiner Inc, Waltham, MA, USA</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>Spectrosil2000, h=3mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">TEGADERM film</td>
			<td style="width:445px;">3M Deutschland GmbH, Neuss, Germany</td>
			<td style="width:167px;">1626W</td>
			<td>10 x 12cm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">spray adhesive</td>
			<td style="width:445px;">3M Deutschland GmbH, Neuss, Germany</td>
			<td style="width:167px;">Photo Mount 050777</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">glycerol</td>
			<td style="width:445px;">Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany</td>
			<td style="width:167px;">Immersol G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">immersion oil</td>
			<td style="width:445px;">OLYMPUS EUROPA SE &#38; CO. KG, Hamburg, Germany</td>
			<td>IMMOIL-F30CC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">prism</td>
			<td style="width:445px;">Vogelsberger Quarzglastechnik GmbH, Hauzenberg, Germany</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>Suprasil1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">aluminium prism holder</td>
			<td style="width:445px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>custom built</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">hollow setscrews</td>
			<td style="width:445px;">Thorlabs Inc, Newton, New Jersey, USA</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>with custom drilling</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Tygon S3 E-3603 tubing</td>
			<td style="width:445px;">neoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany</td>
			<td style="width:167px;">2-4450</td>
			<td>ACF00001</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">PTFE tubing</td>
			<td style="width:445px;">Bohlender GmbH, Gr&#252;nsfeld, Germany</td>
			<td style="width:167px;">S1810-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Name</td>
			<td style="width:445px;">Company</td>
			<td style="width:167px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Sample</td>
			<td style="width:445px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">yeast Hsp90 D61C, Q385C_biotin</td>
			<td style="width:445px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>UniProt ID P02829</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Maleimide derivatives of Atto488, Atto550</td>
			<td style="width:445px;">ATTO-TEC GmbH, Siegen, Germany</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">AMP-PNP*</td>
			<td style="width:445px;">Jena Bioscience, Jena, Germany</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td style="width:347px;">&#947;-[(6-Aminohexyl)-imido]-AMP-PNP-Atto647N</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Fluospheres</td>
			<td style="width:445px;">Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td style="width:167px;">F8764</td>
			<td>amine-modified, 0.2 &#956;m, yellow-green fluorescent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Name</td>
			<td style="width:445px;">Company</td>
			<td style="width:167px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Software</td>
			<td style="width:445px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Andor Solis</td>
			<td style="width:445px;">Andor Technology Ltd, Belfast, Northern Ireland</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>version 4.30</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">LabVIEW</td>
			<td style="width:445px;">National Instruments, Austin, Texas, USA</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>version 2012, 32bit; misc. hardware control</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">MDS control software</td>
			<td style="width:445px;">AA Opto-Electronic, Orsay, France</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>version 2.03a</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Coherent Connection</td>
			<td style="width:445px;">Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>version 3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Igor Pro</td>
			<td style="width:445px;">WaveMetrics Inc, Portland, OR, USA</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>version 6.37</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using three-color single-molecule fret to study the correlation of protein interactions

Tek molekül Förster rezonans enerji transferi (smFRET) biomolecules dinamiklerini incelemek için yaygın olarak kullanılan bir biyofiziksel teknik haline gelmiştir. İçin bir hücre proteinler birçok moleküler makineler işlevsel bir döngü ile birlikte etkileşim ortakları onların görevi yerine getirmek için harekete geçmeliyiz. Uzantısı iki renkli çok renge smFRET, aynı anda birden fazla etkileşimi veya konformasyonal değişim sonda olanak verir. Bu sadece smFRET deneyler için yeni bir boyut ekler aynı zamanda olay sırasını doğrudan çalışmaya ve immobilize bir örnek ve bir toplam iç yansıma Floresans kullanırken ilişkili etkileşimleri algılamaya benzersiz imkanı sunuyor mikroskop (TIRFM). Bu nedenle, çok renkli smFRET nicel bir şekilde ve daha önce ulaşılmaz bir detay çalışmak biyomoleküler kompleksleri için çok yönlü bir araçtır.
Burada, çok renkli smFRET deneyler protein üzerinde özel zorlukların üstesinden gelmek nasıl gösterir. Biz ayrıntılı protokol veri almak için ve Kinetik bilgi ayıklamak için mevcut. Bu izleme seçim ölçütü, devlet ayrılık ve devlet yörüngeleri 3D ensemble gizli Markov modeli (HMM) kullanarak gürültülü veri kurtarma içerir. Diğer yöntemlerine göre Kinetik bilgi Işınma Zamanı histogramlar ancak doğrudan HMM kurtarılır değil. Maksimum olabilirlik çerçevesinde eleştirel Kinetik modelini değerlendir ve anlamlı belirsizlikler için oranları sağlamak için bize izin verir.
Isı şok protein 90 (Hsp90) bizim yöntemi uygulayarak, biz nükleotit bağlama ve küresel konformasyon değişiklikleri protein disentangle edebiliyoruz. Bu doğrudan Hsp90 dimer ve iki nükleotid bağlama cepler arasında cooperativity gözlemlemek için bize sağlar.

Çok renkli smFRET ölçümleri iki veya daha fazla farklı etkileşim siteler arasında korelasyon doğrudan algılanmasını sağlar. Bu teknik çok bileşenli sistemler, protein kompleksleri gibi araştırmak için benzersiz işler. Açıklayıcı bir örnek olarak hizmet veren bir üç renkli smFRET deneyi, sunu üzerinde odaklanıyoruz.
Genel iş akışı yöntemi şekil 1' de gösterilen. İlk...

Watch this Scientific Journal Video about Using Three-color Single-molecule FRET to Study the Correlation of Protein Interactions at JoVE.com

Using Three-color Single-molecule FRET to Study the Correlation of Protein Interactions

Üç renkli tek molekül FRET Protein etkileşimleri korelasyon çalışma için kullanma

Burada, üç renkli smFRET veri ve onun analizi ile 3D ensemble gizli Markov modeli elde etmek için bir iletişim kuralı mevcut. Bu yaklaşım ile bilim adamları Kinetik bilgi cooperativity veya ilişkili etkileşimler de dahil olmak üzere karmaşık protein sistemlerden ayıklayabilirsiniz.

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) has become a widely used biophysical technique to study the dynamics of biomolecules. For ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Fluorescence Anisotropy as a Tool to Study Protein-protein Interactions

Protein-protein etkileşimleri çalışmak için aracı olarak floresan Anizotropi

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is ...

Structural Information from Single-molecule FRET Experiments Using the Fast Nano-positioning System

Tek molekülün yapısal bilgiler Hızlı Nano konumlandırma Sisteminin Kullanılması Deneyler FRET

Single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET) can be used to obtain structural information on biomolecular complexes in real-time. ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

İskele Lipozomlar kullanarak Lipid-proksimal protein-protein etkileşimleri Sulandırın için<em&gt; İn Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

Biyomolekül Yapısının Belirlenmesi İçin Tek Molekül Seviyesinde Yüksek Hassasiyetteki FRET

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions

İntraselüler Protein-protein etkileşimleri çalışmaya Biotinylated hücre Penetran peptidler

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

Proteinler kovalent immobilizasyon için tek molekül kuvvet spektroskopisi

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

OaAEP1-Mediated Enzymatic Synthesis and Immobilization of Polymerized Protein for Single-Molecule Force Spectroscopy

OaAEP1-Tek Moleküllü Kuvvet Spektroskopisi İçin Polimerize Proteinin Aracılı Enzimatik Sentezi ve Immobilizasyonu

Chemical and bio-conjugation techniques have been developed rapidly in recent years and allow the building of protein polymers. However, a controlled ...

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

In Vivo Hidroksil Radikal Protein Ayak İzi Caenorhabditis elegans Protein Etkileşimleri Çalışması için

Fast oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting (HRPF) method used to study protein structure, protein-ligand interactions, ...

Making Precise and Accurate Single-Molecule FRET Measurements using the Open-Source smfBox

Açık Kaynaklı smfBox kullanarak Hassas ve Doğru Tek Moleküllü FRET Ölçümleri Yapma

The smfBox is a recently developed cost-effective, open-source instrument for single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET), which makes ...