Name: quantification of endogenous auxin and cytokinin during internode culture of ipecac
Uploaded: 2018-03-15T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Endogenous Auxin and Cytokinin During Internode Culture of Ipecac at JoVE.com

ونحن ممتنون للسيد أكيرا موراكامي من قسم العلوم التطبيقية وجامعة تويو والسيد كودي تانيجوشى المركز التكنولوجيا الزراعية جونما للمساعدة التقنية. ونحن ممتنون أيضا للبروفيسور شوساكو كاشيوادا والدكتور Uma الج يجلاب، جامعة تويو لاقتراحاتهم. وأيد في مركز أبحاث هذه الدراسة جزئيا للحياة، والعلوم البيئية، جامعة تويو.

ملاحظة: استخدمت عرق الذهب (C. يهيجون) في هذه الدراسة نظراً لأنها تسهل تحليل phytohormones الذاتية.
1-النمو الظروف للحث على العارض يطلق النار على من عرق الذهب
<ol><li>تعد خالية من فيتوهورموني المتوسطة B5 تعديلها لدرجة الحموضة 5.710، وإضافة الصمغ جيلان 0.2%. تعقيم بالتعقيم.</...

<ol>
	<li>Haberlandt, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kulturversuche+mit+isolierten+Pflanzenzellen.">Kulturversuche mit isolierten Pflanzenzellen.</a> Sitzungsber. Math.-Naturwiss. Kl. Akad. Wiss. Wien. 111, 69-92 (1902).</li><li>Skoog, F., Miller, C. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+regulation+of+growth+and+organ+formation+in+plant+tissues+cultured+in+vitro.">Chemical regulation of growth and organ formation in plant tissues cultured in vitro.</a> Symp Soc Exp Biol. 11, 118-130 (1957).</li><li>Ganeshan, S., Caswell, K. L., Kartha, K. K., Chibbar, R. N., Khachatourians, G. G., McHughen, A., Scorza, R., Nip, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Transgenic plants and crops. , 69-84 (2002).</li><li>Teshima, D., Ikeda, K., Satake, M., Aoyama, T., Shimomura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+emetic+alkaloid+by+in+vitro+culture+of+Cephaelis+ipecacuanha.">Production of emetic alkaloid by in vitro culture of Cephaelis ipecacuanha.</a> Plant Cell Rep. 7 (4), 278-280 (1988).</li><li>Chatterjee, S. K., Nandi, R. P., Ghosh, N. C., Atal, C. K., Kapur, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultivation+and+utilixzation+of+medicinal+plants.">Cultivation and utilixzation of medicinal plants.</a> Regional Research Laboratory, Council of Scientific and Industrial Research. , 295-301 (1982).</li><li>Yoshimatsu, K., Shimomura, K., Bajaj, Y. P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biotechnology in Agriculture and Forestry 21, Medicinal and Aromatic Plants IV. , 87-103 (1993).</li><li>Ideda, K., Teshima, D., Aoyama, T., Satake, M., Shimomura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+propagation+of+Cephaelis+ipecacuanha.">Clonal propagation of Cephaelis ipecacuanha.</a> Plant Cell Rep. 7 (4), 288-291 (1988).</li><li>Yoshimatsu, K., Shimomura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+shoot+formation+on+internodal+segments+and+alkaloid+formation+in+the+regenerates+of+Cephaelis+ipecacuanha+A.+Richard.">Efficient shoot formation on internodal segments and alkaloid formation in the regenerates of Cephaelis ipecacuanha A. Richard.</a> Plant Cell Rep. 9 (10), 567-570 (1991).</li><li>Koike, I., Taniguchi, K., Shimomura, K., Umehara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+endogenous+indole-3-acetic+acid+and+cytokinins+during+adventitious+shoot+formation+in+ipecac.">Dynamics of endogenous indole-3-acetic acid and cytokinins during adventitious shoot formation in ipecac.</a> J. Plant Growth Regul. , (2017).</li><li>Gamborg, O. L., Miller, R. A., Ojima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutrient+requirements+of+suspension+cultures+of+soybean+root+cells.">Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells.</a> Exp. Cell Res. 50 (1), 151-158 (1968).</li><li>Watad, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adventitious+shoot+formation+from+carnation+stem+segments:+a+comparison+of+different+culture+procedures.">Adventitious shoot formation from carnation stem segments: a comparison of different culture procedures.</a> Scientia Hortic. 65 (4), 313-320 (1996).</li><li>Ajithkumar, D., Seeni, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+clonal+multiplication+through+in+vitro+axillary+shoot+proliferation+of+Aegle+marmelos+(L.)+Corr.,+a+medicinal+tree.">Rapid clonal multiplication through in vitro axillary shoot proliferation of Aegle marmelos (L.) Corr., a medicinal tree.</a> Plant Cell Rep. 17 (5), 422-426 (1998).</li><li>Tiwari, V., Tiwari, K. N., Singh, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+studies+of+cytokinins+on+in+vitro+propagation+of+Bacopa+monniera.">Comparative studies of cytokinins on in vitro propagation of Bacopa monniera.</a> Plant Cell Tiss. Org. Cult. 66 (1), 9-16 (2001).</li><li>Rao, M. S., Purohit, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+shoot+bud+differentiation+and+plantlet+regeneration+in+Celastrus+paniculatus+Willd.">In vitro shoot bud differentiation and plantlet regeneration in Celastrus paniculatus Willd.</a> Biol. Plant. 50 (4), 501-506 (2006).</li><li>Sanikhani, M., Frello, S., Serek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TDZ+induces+shoot+regeneration+in+various+Kalancho&#235;+blossfeldiana+Poelln+cultivars+in+the+absence+of+auxin.">TDZ induces shoot regeneration in various Kalancho&#235; blossfeldiana Poelln cultivars in the absence of auxin.</a> Plant Cell Tiss. Org. Cult. 85 (1), 75-82 (2006).</li><li>Yoshimoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+negatively+regulates+cell+death+by+controlling+NPR1-dependent+salicylic+acid+signaling+during+senescence+and+the+innate+immune+response+in+Arabidopsis.">Autophagy negatively regulates cell death by controlling NPR1-dependent salicylic acid signaling during senescence and the innate immune response in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 21 (9), 2914-2927 (2009).</li><li>Schaller, G. E., Bishopp, A., Kieber, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yin-yang+of+hormones:+cytokinin+and+auxin+interactions+in+plant+development.">The yin-yang of hormones: cytokinin and auxin interactions in plant development.</a> Plant Cell. 27 (1), 44-63 (2015).</li></ol>

لتحديد توزيع phytohormones المشاركة في أورجانوجينيسيس، من المهم أن استخدام المواد النباتية التي يمكن ملاحظتها organogenesis في المتوسط خالية من فيتوهورموني، لأنه عندما يتم تطبيق phytohormones مناشئ explants لحمل البراعم أو الجذور، وهي تؤثر explant كله، مما يجعل من الصعب تقييم اللدونة الملازمة للنباتات في تمايز ا...

واقترح غوتليب هابيرلاندت (1854-1945) مفهوم "توتيبوتينسي"، بالنبات الذي الخلايا يمكن تقسيم والتفريق وتجديد محطات كاملة حتى بعد تلك التفرقة السابقة إلى أنواع محددة من الخلايا في النباتات الناضجة1. في زراعة الأنسجة، ما إذا كان يمكن فعل تجديد النبات أو لا يتحدد بتركيبة وتركيز phytohormones مناشئ التطبيقية في الأجلين المتوسط والنمو. وجد سكوغ وميلر يمكن التي يسببها العارض يطلق النار على من دشبذ التبغ في الثقافة المتوسطة التي تحتوي على نسبة عالية من CKs إلى auxins، بينما يمكن الناجمين عن جذور العارض في المتوسطة التي تحتوي على نسبة منخفضة من2. منذ ذلك الاستنتاج، زراعة الأنسجة وقد استخدمت على نطاق واسع لنشر المحاصيل الهامة اقتصاديا والتجديد للنباتات المعدلة وراثيا3. يمكن التي يسببها العارض يطلق النار على من الأنسجة عدا أرض قمية تبادل لإطلاق النار، مثل الأوراق والجذور، وإينتيرنوديس. العلاج فيتوهورموني مطلوب لاستحثاث يطلق النار العرضي في معظم الأنواع النباتية. بيد أن التركيزات المثلى وتركيبات تختلف حسب الأنواع وبين الأنسجة المستخدمة ك explants. وهكذا، بذل الكثير من الجهد يذهب إلى تحديد التركيزات المثلى وتركيبات من فيتوهورمونيس للتجارب.
يهيجون كارابيتشيا (الخبز). L. أندرسون (عرق الذهب) هو النباتات طبية التي تحتوي على قلويدات مثل اميتيني وسيفايليني، أساسا في الجذور4. مقتطفات الجذر تستخدم مقشع، قيء، وأموبيسيدي5. على الرغم من عرق الذهب ينمو بشكل طبيعي في الغابات المطيرة الاستوائية من البرازيل، أنها مترددة في وضع البذور في الثقافة، ويقلل من معدل الإنبات أثناء تخزين البذور في اليابان، مع أن المناخ الأكثر برودة6. بدلاً من ذلك، فإنه يتم نشر بزراعة الأنسجة، في تبادل لإطلاق النار العرضي الذي هو تشكيل في إينتيرنوديس7،الأسلوب الأكثر كفاءة8. من المثير للاهتمام، يمكن فعل العارض يطلق النار على في هذه الأنواع دون علاج فيتوهورموني8.
وتتشكل يطلق النار العرضي على البشرة في منطقة قمي شرائح internodal دون كالوسينج، ولكن ليس في المنطقة القاعدية9. هذا الاختلاف يشير إلى قطبية الأنسجة في قطاعات internodal، الذي على الأرجح تحت لائحة فيتوهورمونال. ويسمح نظام الثقافة عرق الذهب فرصة فريدة لتحليل التغيرات في مستويات فيتوهورموني الذاتية خلال تبادل لإطلاق النار العرضي تشكيل. أعرض هنا ونحن لدينا طريقة لتحليل مستويات الذاتية اكسين واحد (حمض اندول-3-أنهيدريد (IAA)) وأربعة CKs (isopentenyl الأدنين (iP)، إيسوبينتينيل الأدنين المواد (حقوق الملكية الفكرية)، ترانس-أنها (tZ)، و عبر-أنها المواد (تزر)) في internodal شرائح من خلال استخدام LC-MS/MS.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:677px;" width="678">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">[2H5]indole-3-acetic acid</td>
			<td style="width:176px;">Olchemlm Ltd</td>
			<td style="width:119px;">031 1531</td>
			<td style="width:167px;">Internal standard for LC-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">[2H5]trans-zeatin</td>
			<td style="width:176px;">Olchemlm Ltd</td>
			<td style="width:119px;">030 0301</td>
			<td>Internal standard for LC-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">[2H5]trans-zeatin riboside</td>
			<td style="width:176px;">Olchemlm Ltd</td>
			<td style="width:119px;">030 0311</td>
			<td>Internal standard for LC-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">[2H6]N6-isopentenyl adenine</td>
			<td style="width:176px;">Olchemlm Ltd</td>
			<td style="width:119px;">030 0161</td>
			<td>Internal standard for LC-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">[2H6]N6-isopentenyl adenosine</td>
			<td style="width:176px;">Olchemlm Ltd</td>
			<td style="width:119px;">030 0171</td>
			<td>Internal standard for LC-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">indole-3-acetic acid</td>
			<td style="width:176px;">Wako</td>
			<td>098 00181</td>
			<td>standard for LC-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">trans-zeatin</td>
			<td style="width:176px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">Z0876 5MG</td>
			<td>standard for LC-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">trans-zeatin riboside</td>
			<td style="width:176px;">Wako</td>
			<td>262 01081</td>
			<td>standard for LC-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">N6-isopentenyl adenine</td>
			<td style="width:176px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:119px;">D7674 1G</td>
			<td>standard for LC-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">N6-isopentenyl adenosine</td>
			<td style="width:176px;">ACROS ORGANICS</td>
			<td style="width:119px;">22648 1000</td>
			<td>standard for LC-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">acetonitrile hypergrade for LC-MS LiChrosolv</td>
			<td style="width:176px;">MERCK</td>
			<td style="width:119px;">1.00029.1000</td>
			<td>solvent for LC-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Water for chromatography LiChrosolv</td>
			<td style="width:176px;">MERCK</td>
			<td style="width:119px;">1.15333.1000</td>
			<td>solvent for LC-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HPLC</td>
			<td style="width:176px;">SHIMADZU</td>
			<td style="width:119px;">Prominence</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MS</td>
			<td style="width:176px;">Sciex</td>
			<td style="width:119px;">3200QTRAP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Oasis HLB 30 mg/1 cc</td>
			<td style="width:176px;">Waters</td>
			<td style="width:119px;">WAT094225</td>
			<td>cartridge column</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Oasis MCX 30 mg/1 cc</td>
			<td style="width:176px;">Waters</td>
			<td style="width:119px;">186000252</td>
			<td>cartridge column</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">screw neck total recovery vial</td>
			<td style="width:176px;">Waters</td>
			<td style="width:119px;">186002805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">blue, 12 x 32mm screw neck cap and PTFE/silicone septum</td>
			<td style="width:176px;">Waters</td>
			<td style="width:119px;">186000274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Acquity UPLC BEH C18, 2.1x100 mm</td>
			<td style="width:176px;">Waters</td>
			<td style="width:119px;">186002350</td>
			<td>UPLC column</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Proshell 120 EC-C18, 2.1x50 mm</td>
			<td style="width:176px;">Agilent</td>
			<td style="width:119px;">699775-902</td>
			<td>UPLC column</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Digital microscope</td>
			<td style="width:176px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;">DHS1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TissueLyser II</td>
			<td style="width:176px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:119px;">85300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Surgical blade</td>
			<td style="width:176px;">Feather</td>
			<td style="width:119px;">No. 22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Scalpel handle</td>
			<td style="width:176px;">Feather</td>
			<td style="width:119px;">No. 4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">Savant SpeedVac/Refregerated vapor trap</td>
			<td style="width:176px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">SPD111/RVT4104</td>
			<td>vacuum concentrartor</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Disposable glass tobe (13x100 mm)</td>
			<td style="width:176px;">IWAKI</td>
			<td style="width:119px;">9832-1310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sterile petri dish</td>
			<td style="width:176px;">INA OPTICA</td>
			<td style="width:119px;">I-90-20</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of endogenous auxin and cytokinin during internode culture of ipecac

تشكيل إطلاق النار العرضي أسلوب هام للدعوة للمحاصيل الهامة اقتصاديا والتجديد للنباتات المعدلة وراثيا. العلاج فيتوهورموني مطلوب لاستحثاث يطلق النار العرضي في معظم الأنواع. عما إذا كان يمكن أن يتسبب العارض يطلق النار على تتحدد بالتوازن بين اكسين وسيتوكينين (كورونا) مستويات. يذهب الكثير من الجهد في تحديد التركيزات المثلى وتركيبات من فيتوهورمونيس في كل الأنسجة المستخدمة اكسبلانتس وفي كل نوع من الأنواع النباتية. في عرق الذهب، يمكن فعل بيد من يطلق النار العرضي في قطاعات internodal في المتوسط الثقافة دون علاج فيتوهورموني. وهذا ما يسمح اللدونة الملازمة لعرق الذهب للتمايز الخلية التي يتم تقييمها. للحث على براعم العارض في عرق الذهب، نحن مثقف شرائح internodal في 24 درجة مئوية تحت 15 µmol م2 ق1 من الضوء في حلقة مفرغة الظلام الضوء/10-ح 14-ح على خالية من فيتوهورموني المتوسطة B5 توطد مع الصمغ جيلان 0.2 في المائة لمدة 5 أسابيع. للتحقيق في ديناميات فيتوهورموني خلال تبادل لإطلاق النار العرضي تشكيل، نحن تقاس حمض اندول-3-أنهيدريد الذاتية و CKs في القطاعات السائل اللوني-جنبا إلى جنب الكتلي LC-MS/MS. هذا الأسلوب يسمح تحليل حمض اندول-3-أنهيدريد الذاتية ومستويات CKs بطريقة بسيطة. يمكن تطبيقها للتحقيق في ديناميات اكسين الذاتية وكورونا خلال organogenesis في الأنواع النباتية الأخرى.

وشكلت في الأسبوعش 1، لم يطلق النار العرضي. في الأسبوع 2nd ، ظهرت براعم صغيرة. 3rd والأسابيعال 4، العدد يطلق النار على زيادة معظمها في منطقتي قمي (الأول والثاني) (الشكل 2أ). في الأسبوعال 5، عدد من يطلق النار كان حوالي 7 المنطق...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Endogenous Auxin and Cytokinin During Internode Culture of Ipecac at JoVE.com

Quantification of Endogenous Auxin and Cytokinin During Internode Culture of Ipecac

التحديد الكمي اكسين الذاتية وسيتوكينين خلال الثقافة Internode من عرق الذهب

يمكن الناجمين عن العارض يطلق النار على شرائح internodal من عرق الذهب بدون علاج فيتوهورموني. تقييم ديناميات فيتوهورموني خلال تبادل لإطلاق النار العرضي تشكيل، قمنا بقياس اكسين الذاتية وسيتوكينين في قطاعات internodal قبل LC-MS/MS.

Adventitious shoot formation is an important technique for the propagation of economically important crops and for the regeneration of transgenic plants. ...

The overall goal of this procedure is to describe how endogenous phytohormone levels change during adventitious shoot formation in ipecac. This method can help answer key questions related to tissue regeneration in the plant tissue culture wheel. The main advantage of this technique is the endogenous level of Indole-3-acetic acid and cytokinines can be simply analyzed with high sensitivity.The implication of this technique extend throughout establishment of plant tissue degeneration because changes in endogenous phytohormone level trigger adventitious shoot formation. To begin, prepare a phytohormone-free B5 medium and add 0.2 percent gellan gum. Then, autoclave the medium to sterilize it.Using a surgical scalpel on a sterile acrylic plate, slice eight millimeter internodal segments of ipecac plantlets and place them on the medium. Then, culture the ipecac segments at 24 degrees Celsius under 15 micromole per square meter seconds of light in a 14-hour light, 10-hour dark cycle for five weeks. After culturing the ipecac segments, identify regions one through four in each segment.Once a week, use a microscope to count the number of adventitious shoots in each region. First, place a five millimeter zirconia bead into four two-milliliter sample tubes. Then, use a surgical scalpel on a sterile acrylic plate to cut the ipecac segments into regions I through IV.Then collect eight segments from each region into one sample tube.Weigh each of the samples and freeze them in liquid nitrogen. Next, use a bead-based homogenizer to crush the frozen samples. Use a vortex mixer to suspend the samples in one milliliter of the acetonitrile with 500 picograms of each internal standard of oxen and CKs.Home the samples at four degrees Celsius for one hour. And then centrifuge the samples at 3500 G for five minutes at room temperature. Wash the pellet in 80 percent acetal nitrile with one percent acetic acid.Then repeat the centrifugation and use a disposable class tube to combine the supernatants. Add 600 microliters of water with one percent acetic acid to the combined supernatant. Then use a vacuum concentrator to evaporate the acetal nitrile.Load the sample solutions into individual equilibrated HLB cartridges. And wash the cartridges with one milliliter of water with one percent acetic acid. Then allude all of the hormones with two milliliters of 80 percent acetyl nitrile with one percent acetic acid in a glass tube.Using a vacuum concentrator, evaporate the acetal nitrile to obtain extract in water with one percent acetic acid. Load the sample solutions into individual equilibrated MCX cartridges and wash the cartridges with one milliliter of water with one percent acetic acid. Then allude IAA in a glass tube, with two milliliters of 30 percent acetal nitrile with one percent acetic acid.Then wash the cartridges with two milliliters of 80 percent acetal nitrile with one percent acetic acid. Next, wash the cartridges with two milliliters of water and one milliliter of water with five percent aqueous ammonia in a draft chamber. Allude the CKs in a glass tube with two milliliters of 60 percent acetal nitrile with five percent aqueous ammonia in a draft chamber.Then use a vacuum concentrator to evaporate the solvent of each hormone fraction. Stir the samples at minus thirty degrees Celsius until LCMSMS analysis. First, dissolve each hormone extract in a tube with 600 microliters of methanol.Then transfer the solution to a screw-neck total recovery vial and use a vacuum concentrator to evaporate the solvent. Dissolve the IAA fraction in 20 microliters of 30 percent acetal nitrile and the CK fractions in 20 microliters of water with one percent acetic acid. Next use a triple quadrupole MS system equipped with an HPLC system to analyze the samples in positive ion mode.Finally quantify endogenous IAA in CK levels against a standard curve of the ration of unlabeled to deuterium label standards. In this protocol endogenous oxidant cytokinin in adventitious chutes was measured via LCMSMS for five weeks. At the first week, no adventitious chutes had formed and the first small chutes appeared during the second week.During the third and fourth weeks, the number of chutes increased mostly in regents one and two. During the fifth week the number of chutes was approximately seven in region one, and five in region two. Before culture, the IAA level was slightly higher in region one than in regions two, three, and four.During the first week, the IAA level increased greatly in region four, and decreased slightly in regions one, two, and three. By five weeks of culture an IAA concentration gradient emerged. With levels increasing from region one to region four.Before culture, there were only trace levels of most of the CKs. At the first week, the tZR level increased to 13.8 picograms per milligram in region two. And 18.1 picograms per milligram in region three.In contrast the levels of tZ, iP and iPR changed only slightly during culture. While attempting this procedure it's important to remember that endogenous part hormone are stable. After it's developed man, this technique paves the way for researchers in the field of plant tissue culture.To explore adventitious formation in other organisms. After watching this video, you should have a good understanding of how to analyze endogenous Indole-3-acetic acid and cytokinines.

Research

JoVE Journal

Environment

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. I. Collection of Virus Samples

EPA الطريقة 1615. قياس الفيروسة المعوية ونوروفيروس حدوثها في المياه عن طريق الثقافة وRT-QPCR. I. جمع عينات الفيروسات

EPA Method 1615 was developed with a goal of providing a standard method for measuring enteroviruses and noroviruses in environmental and drinking waters. ...

Quantification of Heavy Metals and Other Inorganic Contaminants on the Productivity of Microalgae

الكمي من المعادن الثقيلة والملوثات غير العضوية الأخرى على الإنتاجية من الطحالب

Increasing demand for renewable fuels has researchers investigating the feasibility of alternative feedstocks, such as microalgae. Inherent advantages ...

Simultaneous DNA-RNA Extraction from Coastal Sediments and Quantification of 16S rRNA Genes and Transcripts by Real-time PCR

الحمض النووي الريبي في وقت واحد استخراج من الرواسب الساحلية والكمي ل16S الجينات الريباسي والنصوص التي في الوقت الحقيقي PCR

Real Time Polymerase Chain Reaction also known as quantitative PCR (q-PCR) is a widely used tool in microbial ecology to quantify gene abundances of ...

Capturing Flow-weighted Water and Suspended Particulates from Agricultural Canals During Drainage Events

الالتقاط مرجح تدفق الماء والجسيمات العالقة من القنوات الزراعية خلال أحداث الصرف

The purpose of this study is to describe the methods used to capture flow-weighted water and suspended particulates from farm canals during drainage ...

The Effect of the Application of Thyme Essential Oil on Microbial Load During Meat Drying

أثر تطبيق النفط الزعتر على الحمولة الميكروبية أثناء تجفيف اللحوم

Meat is a high protein meal that is used in the preparation of jerky, a popular food snack, where preservation and safety are important. To assure food ...

Stress Distribution During Cold Compression of Rocks and Mineral Aggregates Using Synchrotron-based X-Ray Diffraction

توزيع الإجهاد أثناء ضغط الباردة من الصخور والركام المعدنية باستخدام المستندة إلى السنكروتروني حيود الأشعة السينية

We report detailed procedures for performing compression experiments on rocks and mineral aggregates within a multi-anvil deformation apparatus (D-DIA) ...

Chemical Isolation, Quantification, and Separation of Skin Lipids from Reptiles

العزل الكيميائية والتقدير الكمي، وفصل الدهون الجلد من الزواحف

Reptiles signal to conspecifics using lipids in their skin, primarily to enable mate tracking and assessment. The isolation of these lipids has utility in ...

Split Point Analysis and Uncertainty Quantification of Thermal-Optical Organic/Elemental Carbon Measurements

تحليل نقطة الانقسام وعدم اليقين القياس الكمي للقياسات الكربونية العضوية/عنصري الحرارية البصرية

Researchers from myriad fields frequently seek to quantify and classify concentrations of carbonaceous aerosols as organic carbon (OC) or elemental carbon ...

Processing Embryo, Eggshell, and Fungal Culture for Scanning Electron Microscopy

معالجة الجنين، قشر البيض، والثقافة الفطرية لمسح المجهر الإلكتروني

Although scanning electron microscopy (SEM) is being widely used for the ultra-structural analysis of various biological and non-biological samples, ...