Name: a protocol for the production of integrase-deficient lentiviral vectors for crispr/cas9-mediated gene knockout in dividing cells
Uploaded: 2017-12-12T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells at JoVE.com

نود أن نشكر إدارة علم الأعصاب، كلية الطب في جامعة ديوك، ومكتب عميد الكلية "العلوم الأساسية"، وجامعة ديوك. كما نشكر أعضاء الأساسية النواقل الفيروسية ديوك للتعليقات على المخطوطة. وكان بلازميد بلينتي CRISPRv2 هدية من تشانغ فنغ (معهد واسع). نظام الوقف والتغليف بما في ذلك psPAX2 والبلازميدات، منظمة-ز، pMD2.G، والقس برسف كان هدية نوع من ترونو ديدييه (لوزان، سويسرا). وقدمت الدعم المالي لهذا العمل "جامعة من ولاية كارولينا الجنوبية مدرسة الطب"، منح RDF18080-E202 (B.K).

1-استزراع الخلايا HEK-293T وبذر خلايا تعداء
ملاحظة: "الكلي الجنينية" البشرية 293T وتزرع الخلايا (HEK-293T) في دميم، وسائل الإعلام الجلوكوز عالية وتستكمل مع مصل العجل البقري 10% وتستكمل مع المروجين للحديد والنمو، و 1 × الحل مضاد حيوي فطري (100 x حل يحتوي على 10,000 وحدات البنسلين ، ستربتوميسين 10...

<ol>
	<li>Horvath, P., Barrangou, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas,+the+immune+system+of+bacteria+and+archaea.">CRISPR/Cas, the immune system of bacteria and archaea.</a> Science. 327 (5962), 167-170 (2010).</li><li>Marraffini, L. A., Sontheimer, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+interference:+RNA-directed+adaptive+immunity+in+bacteria+and+archaea.">CRISPR interference: RNA-directed adaptive immunity in bacteria and archaea.</a> Nat Rev Genet. 11 (3), 181-190 (2010).</li><li>Kim, H., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+genome+engineering+with+programmable+nucleases.">A guide to genome engineering with programmable nucleases.</a> Nat Rev Genet. 15 (5), 321-334 (2014).</li><li>Bellec, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CFTR+inactivation+by+lentiviral+vector-mediated+RNA+interference+and+CRISPR-Cas9+genome+editing+in+human+airway+epithelial+cells.">CFTR inactivation by lentiviral vector-mediated RNA interference and CRISPR-Cas9 genome editing in human airway epithelial cells.</a> Curr Gene Ther. 15 (5), 447-459 (2015).</li><li>Kennedy, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+hepatitis+B+virus+DNA+accumulation+in+chronically+infected+cells+using+a+bacterial+CRISPR/Cas+RNA-guided+DNA+endonuclease.">Suppression of hepatitis B virus DNA accumulation in chronically infected cells using a bacterial CRISPR/Cas RNA-guided DNA endonuclease.</a> Virology. 476, 196-205 (2015).</li><li>Roehm, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+HSV-1+Replication+by+Gene+Editing+Strategy.">Inhibition of HSV-1 Replication by Gene Editing Strategy.</a> Sci Rep. 6, 23146 (2016).</li><li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCR5+gene+disruption+via+lentiviral+vectors+expressing+Cas9+and+single+guided+RNA+renders+cells+resistant+to+HIV-1+infection.">CCR5 gene disruption via lentiviral vectors expressing Cas9 and single guided RNA renders cells resistant to HIV-1 infection.</a> PLoS One. 9 (12), e115987 (2014).</li><li>Kantor, B., Bailey, R. M., Wimberly, K., Kalburgi, S. N., Gray, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+gene+transfer+to+the+central+nervous+system.">Methods for gene transfer to the central nervous system.</a> Adv Genet. 87, 125-197 (2014).</li><li>Lebbink, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+combinational+CRISPR/Cas9+gene-editing+approach+can+halt+HIV+replication+and+prevent+viral+escape.">A combinational CRISPR/Cas9 gene-editing approach can halt HIV replication and prevent viral escape.</a> Sci Rep. 7, 41968 (2017).</li><li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9-Mediated+CCR5+Ablation+in+Human+Hematopoietic+Stem/Progenitor+Cells+Confers+HIV-1+Resistance+In+Vivo.">CRISPR/Cas9-Mediated CCR5 Ablation in Human Hematopoietic Stem/Progenitor Cells Confers HIV-1 Resistance In Vivo.</a> Mol Ther. , (2017).</li><li>Yiu, G., Tieu, E., Nguyen, A. T., Wong, B., Smit-McBride, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+Disruption+of+VEGF-A+Expression+in+Human+Retinal+Pigment+Epithelial+Cells+Using+CRISPR-Cas9+Endonuclease.">Genomic Disruption of VEGF-A Expression in Human Retinal Pigment Epithelial Cells Using CRISPR-Cas9 Endonuclease.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 57 (13), 5490-5497 (2016).</li><li>Kabadi, A. M., Ousterout, D. G., Hilton, I. B., Gersbach, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+CRISPR/Cas9-based+genome+engineering+from+a+single+lentiviral+vector.">Multiplex CRISPR/Cas9-based genome engineering from a single lentiviral vector.</a> Nucleic Acids Res. 42 (19), e147 (2014).</li><li>Fu, Y., Sander, J. D., Reyon, D., Cascio, V. M., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+CRISPR-Cas+nuclease+specificity+using+truncated+guide+RNAs.">Improving CRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs.</a> Nat Biotechnol. 32 (3), 279-284 (2014).</li><li>Hsu, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+targeting+specificity+of+RNA-guided+Cas9+nucleases.">DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases.</a> Nat Biotechnol. 31 (9), 827-832 (2013).</li><li>Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+RNA-guided+genome+editing+in+human+cells+via+delivery+of+purified+Cas9+ribonucleoproteins.">Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins.</a> Genome Res. 24 (6), 1012-1019 (2014).</li><li>Pattanayak, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+profiling+of+off-target+DNA+cleavage+reveals+RNA-programmed+Cas9+nuclease+specificity.">High-throughput profiling of off-target DNA cleavage reveals RNA-programmed Cas9 nuclease specificity.</a> Nat Biotechnol. 31 (9), 839-843 (2013).</li><li>Shalem, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+CRISPR-Cas9+knockout+screening+in+human+cells.">Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells.</a> Science. 343 (6166), 84-87 (2014).</li><li>Schaefer, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unexpected+mutations+after+CRISPR-Cas9+editing+in+vivo.">Unexpected mutations after CRISPR-Cas9 editing in vivo.</a> Nat Methods. 14 (6), 547-548 (2017).</li><li>Choi, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentivirus+pre-packed+with+Cas9+protein+for+safer+gene+editing.">Lentivirus pre-packed with Cas9 protein for safer gene editing.</a> Gene Ther. 23 (7), 627-633 (2016).</li><li>Platt, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas9+knockin+mice+for+genome+editing+and+cancer+modeling.">CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling.</a> Cell. 159 (2), 440-455 (2014).</li><li>Truong, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+intein-mediated+split-Cas9+system+for+gene+therapy.">Development of an intein-mediated split-Cas9 system for gene therapy.</a> Nucleic Acids Res. 43 (13), 6450-6458 (2015).</li><li>Nelson, C. E., Gersbach, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+Delivery+Vehicles+for+Genome+Editing.">Engineering Delivery Vehicles for Genome Editing.</a> Annu Rev Chem Biomol Eng. 7, 637-662 (2016).</li><li>Jaalouk, D. E., Crosato, M., Brodt, P., Galipeau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+histone+deacetylation+in+293GPG+packaging+cell+line+improves+the+production+of+self-inactivating+MLV-derived+retroviral+vectors.">Inhibition of histone deacetylation in 293GPG packaging cell line improves the production of self-inactivating MLV-derived retroviral vectors.</a> Virol J. 3, 27 (2006).</li><li>Ellis, B. L., Potts, P. R., Porteus, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creating+higher+titer+lentivirus+with+caffeine.">Creating higher titer lentivirus with caffeine.</a> Hum Gene Ther. 22 (1), 93-100 (2011).</li><li>Hoban, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+Genome+Editing+Reagents+to+Hematopoietic+Stem/Progenitor+Cells.">Delivery of Genome Editing Reagents to Hematopoietic Stem/Progenitor Cells.</a> Curr Protoc Stem Cell Biol. 36, 1-10 (2016).</li><li>Bayer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large+U3+deletion+causes+increased+in+vivo+expression+from+a+nonintegrating+lentiviral+vector.">A large U3 deletion causes increased in vivo expression from a nonintegrating lentiviral vector.</a> Mol Ther. 16 (12), 1968-1976 (2008).</li><li>Kantor, B., Ma, H., Webster-Cyriaque, J., Monahan, P. E., Kafri, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+activation+of+unintegrated+HIV-1+genomes+by+gut-associated+short+chain+fatty+acids+and+its+implications+for+HIV+infection.">Epigenetic activation of unintegrated HIV-1 genomes by gut-associated short chain fatty acids and its implications for HIV infection.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (44), 18786-18791 (2009).</li><li>Ortinski, P. I., O'Donovan, B., Dong, X., Kantor, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrase-Deficient+Lentiviral+Vector+as+an+All-in-One+Platform+for+Highly+Efficient+CRISPR/Cas9-Mediated+Gene+Editing.">Integrase-Deficient Lentiviral Vector as an All-in-One Platform for Highly Efficient CRISPR/Cas9-Mediated Gene Editing.</a> Mol Ther Methods Clin Dev. 5, 153-164 (2017).</li><li>Kantor, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notable+reduction+in+illegitimate+integration+mediated+by+a+PPT-deleted,+nonintegrating+lentiviral+vector.">Notable reduction in illegitimate integration mediated by a PPT-deleted, nonintegrating lentiviral vector.</a> Mol Ther. 19 (3), 547-556 (2011).</li><li>Berkhout, B., Verhoef, K., van Wamel, J. L., Back, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+instability+of+live,+attenuated+human+immunodeficiency+virus+type+1+vaccine+strains.">Genetic instability of live, attenuated human immunodeficiency virus type 1 vaccine strains.</a> J Virol. 73 (2), 1138-1145 (1999).</li><li>Gomez-Gonzalo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hepatitis+B+virus+X+protein+induces+HIV-1+replication+and+transcription+in+synergy+with+T-cell+activation+signals:+functional+roles+of+NF-kappaB/NF-AT+and+SP1-binding+sites+in+the+HIV-1+long+terminal+repeat+promoter.">The hepatitis B virus X protein induces HIV-1 replication and transcription in synergy with T-cell activation signals: functional roles of NF-kappaB/NF-AT and SP1-binding sites in the HIV-1 long terminal repeat promoter.</a> J Biol Chem. 276 (38), 35435-35443 (2001).</li><li>Kim, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+zinc+finger+fusions+targeting+Sp1-binding+sites+and+the+trans-activator-responsive+element+potently+repress+transcription+and+replication+of+HIV-1.">Artificial zinc finger fusions targeting Sp1-binding sites and the trans-activator-responsive element potently repress transcription and replication of HIV-1.</a> J Biol Chem. 280 (22), 21545-21552 (2005).</li><li>Ortinski, P. I., Lu, C., Takagaki, K., Fu, Z., Vicini, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+distinct+alpha+subunits+of+GABAA+receptor+regulates+inhibitory+synaptic+strength.">Expression of distinct alpha subunits of GABAA receptor regulates inhibitory synaptic strength.</a> J Neurophysiol. 92 (3), 1718-1727 (2004).</li><li>Van Lint, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factor+binding+sites+downstream+of+the+human+immunodeficiency+virus+type+1+transcription+start+site+are+important+for+virus+infectivity.">Transcription factor binding sites downstream of the human immunodeficiency virus type 1 transcription start site are important for virus infectivity.</a> J Virol. 71 (8), 6113-6127 (1997).</li><li>Van Lint, C., Ghysdael, J., Paras, P., Burny, A., Verdin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transcriptional+regulatory+element+is+associated+with+a+nuclease-hypersensitive+site+in+the+pol+gene+of+human+immunodeficiency+virus+type+1.">A transcriptional regulatory element is associated with a nuclease-hypersensitive site in the pol gene of human immunodeficiency virus type 1.</a> J Virol. 68 (4), 2632-2648 (1994).</li><li>Xu, W., Russ, J. L., Eiden, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+residual+promoter+activity+in+gamma-retroviral+self-inactivating+(SIN)+vectors.">Evaluation of residual promoter activity in gamma-retroviral self-inactivating (SIN) vectors.</a> Mol Ther. 20 (1), 84-90 (2012).</li><li>. Testing for Replication Competent Retrovirus (RCR)/Lentivirus (RCL) in Retroviral and Lentiviral Vector Based Gene Therapy Products - Revisiting Current FDA Recommendations Available from: <a target="_blank" href="https://sites.duke.edu/dvvc/files/2016/05/FDA-recommendation-for-RCR-testing.pdf">https://sites.duke.edu/dvvc/files/2016/05/FDA-recommendation-for-RCR-testing.pdf</a> (2017)</li><li>. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories Available from: <a target="_blank" href="https://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/bmbl.pdf">https://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/bmbl.pdf</a> (2017)</li><li>Dull, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+third-generation+lentivirus+vector+with+a+conditional+packaging+system.">A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system.</a> J Virol. 72 (11), 8463-8471 (1998).</li><li>Liu, X. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Editing+DNA+Methylation+in+the+Mammalian+Genome.">Editing DNA Methylation in the Mammalian Genome.</a> Cell. 167 (1), 233-247 (2016).</li><li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+genome+editing+using+Staphylococcus+aureus+Cas9.">In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9.</a> Nature. 520 (7546), 186-191 (2015).</li><li>Zetsche, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cpf1+is+a+single+RNA-guided+endonuclease+of+a+class+2+CRISPR-Cas+system.">Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system.</a> Cell. 163 (3), 759-771 (2015).</li></ol>

إيدلفس وقد بدأت في الظهور كالوسيلة للاختيار في فيفو الجينات-التحرير، ولا سيما في سياق الأمراض الوراثية، ويرجع ذلك إلى حد كبير إلى انخفاض خطر الطفرات المرتبطة بناقلات هذه المقارنة لإدماج تسليم منصات22 , 28-في المخطوطة الحالية، سعينا إلى تفاصيل البروتوكو...

تحرير الجينات الدقيقة تشكل حجر الزاوية للتطورات الطبية الحيوية الرئيسية التي تنطوي على وضع استراتيجيات جديدة للتصدي للأمراض الوراثية. في طليعة تكنولوجيا الجينات--تحرير بالطريقة التي تعتمد على استخدام جلوستيريد rاجولارلي--أنانتيرسباسيد sهورت فاليندروميك صابيتس (كريسبر)/نظام Cas9 التي تم تحديدها في البداية كمكون للبكتيريا مناعة ضد الغزو المواد الجينية الفيروسية (إعادة النظر في المراجع1،2). ميزة كبيرة للنظام كريسبر/Cas9 على غيرها من أدوات تحرير الجينات، مثل نوكلياسيس إصبع الزنك (زفنس) والنسخ المستجيب المنشط--مثل نوكلياسيس (تالينس) (واستعرضت في مرجع3)، هي البساطة النسبية لتصميم بلازميد و بناء مكونات كريسبر – ميزة التي لديه بدعم التوسع في تحرير الجينات من عدد قليل من المختبرات المتخصصة إلى مجتمع بحث أوسع كثيرا. بالإضافة إلى ذلك، غذت بساطة البرمجة كريسبر/Cas9 وقدرته على الاعتراف بهدف متعدد زيادة شعبيتها كتكنولوجيا فعالة من حيث التكلفة وسهلة الاستخدام. بين الأساليب المختلفة المتاحة للباحثين لتقديم هذه المكونات تحرير الجينات للخلايا، يبقى النواقل الفيروسية بكثير النظام الأكثر شعبية وأكثر كفاءة.
ناقلات لينتيفيرال (LVs) ظهرت كوسيلة الاختيار لتقديم عناصر كريسبر/Cas9 النظام في فيفو لتطبيقات متنوعة4،5،،من67. جعل العديد من الميزات الرئيسية LVs خياراً شعبيا لهذه العملية بما في ذلك قدرتها على إصابة الفاصل وعدم تقسيم الخلايا، الاستمناع منخفضة، والسمية الخلوية الحد الأدنى (استعرض في المرجع8). نتيجة لذلك استخدمت العلاج الجيني بوساطة LV في علاجات للأمراض المعدية، مثل فيروس نقص المناعة البشرية-1 و HBV هامبورغ-1، وكذلك في تصحيح العيوب الكامنة وراء الأمراض الوراثية البشرية، مثل التليف الكيسي والأجسام القريبة من الأرض والأوعية الدموية البقعي 4 , 5 , 7 , 9 , 10 , 11-وعلاوة على ذلك، LVs قد عدلت فعلياً تنفيذ تحرير متعدد الجينات في المكاني الجينوم متميزة باستخدام نظام ناقل واحد12.
ومع ذلك، الخاصية المتأصلة من LVs الاندماج في جينوم مضيف يمكن مطفرة وغالباً ما يعوق فائدتها كوسائل إيصال التحوير، لا سيما في ظروف سريرية. وعلاوة على ذلك، منذ LVs ستابلي المتكاملة أعرب عن المتسلسلات في مستويات عالية على نحو مستدام، وهذا النظام غير ملائمة لإيصال الجينات تحرير مكونات مثل كريسبر/Cas9؛ أوفيريكسبريسيون Cas9--دليل الحمض النووي الريبي (جرنا)، والبروتينات مشابهة مثل زفنس، ترتبط بمستويات مرتفعة من الآثار قبالة المستهدفة، والتي تشمل الطفرات غير مرغوب فيها13،14،،من1516 , 17 ويمكن أن يحتمل أن تعزز سيتوتوكسيسيتي18. ولذلك، لتحقيق دقة تحرير الجينات مع الحد الأدنى من الآثار خارج الهدف، يتحتم لتصميم النظم التي تسمح لتعبير الجينات تحرير مكونات عابرة.
وفي السنوات الأخيرة، وضعت مجموعة متنوعة من منصات التسليم لعابر إكسبريس كريسبر/Cas9 في الخلايا16،19،،من2021 (استعرض في المرجع22). وتشمل هذه الأساليب التي تعتمد على مباشرة إدخال Cas9 المنقي جنبا إلى جنب مع الكشف الدليل المناسب في الخلايا، والتي تبين أن يكون أكثر فعالية في تحرير الجينات المستهدفة بالمقارنة بوساطة بلازميد تعداء16. وقد أثبتت الدراسات أن ريبونوكليوبروتين (رنب) دليل مجمعات تتكون من الحمض النووي الريبي/Cas9 الجزيئات سرعة تسليم بعد وساطة الانقسام الحمض النووي في أهدافها، مما يدل على أن التعبير القصير الأجل لهذه المكونات تكفي لتحقيق قوة الجينات تحرير16. ومن المتصور عدم إدماج أنظمة النواقل الفيروسية مثل النواقل الفيروسية المرتبطة بالغدة (أعفس) يمكن أن توفر بديلاً مجديا لتسليم الآلات تحرير الجينات إلى الخلايا. ولسوء الحظ، كابسيدس إف تمتلك قدرة التعبئة أقل بكثير مما LVs (< 5 كيلو بايت)، مما يعوق بشدة قدرتها على حزمة أدوات كريسبر متعدد العناصر داخل ناقل واحد (استعرض في المرجع8). تجدر الإشارة إلى أن إضافة المركبات التي تمنع هيستون ديسيتيلاسيس (مثلاً، بوتيراتي الصوديوم23) أو تعيق دورة الخلية (مثلاً، الكافيين24) أظهرت زيادة التتر لينتيفيرال. وعلى الرغم من التقدم الذي أحرز مؤخرا، ما زال يعرقل النظم تعبير عابر التي وضعت حتى الآن من أوجه قصور عديدة، مثل انخفاض كفاءة الإنتاج، مما يؤدي إلى انخفاض الفيروسية التتر، وكفاءة توصيل منخفض من الفيروسات التي تم إنشاؤها من خلال وهذا النهج25.
ناقلات تفتقر إلى إينتيجراسي لينتيفيرال (إيدلفس) تمثل تقدما كبيرا في تطوير مركبات إيصال الجينات، كما أنها تجمع بين القدرة على التعبئة والتغليف من LVs مع فائدة إضافية للصيانة مثل إف ابيسومال في الخلايا. تساعد هذه الميزات إيدلفس إلى حد كبير الالتفاف حول القضايا الرئيسية المرتبطة بإدماج ناقلات، overexpression المقارنة المستمرة يحتمل أن تكون عناصر سمية جينية والتكامل بوساطة المحدثة للطفرات. قد تجلى سابقا أنه يمكن تعديل إيدلفس بنجاح لتعزيز التعبير الجيني ابيسومال26،27. فيما يتعلق بالتسليم بوساطة إيدلف كريسبر/Cas9، التتر الإنتاج المنخفض والتعبير أدنى الجينومات تنقلها ابيسومي بالنسبة لأنظمة لينتيفيرال إينتيجراسي-يتقن يحد من فائدتها كأدوات حسن النية لتقديم التحرير الجينوم بنيات المحورة وراثيا. نحن مؤخرا أظهرت أن التعبير التحوير والتتر الفيروسية المرتبطة بإنتاج إيدلف تتعزز كثيرا بإدراج مواقع لعامل النسخ حزمة الخدمة Sp1 ضمن كاسيت التعبير الفيروسية28الربط. قوة دعم إيدلفس تم التعديل الجيني بوساطة كريسبر التحرير سواء في المختبر (في الخلايا HEK-293T) و في فيفو (في الدماغ بعد الانقسامية الخلايا العصبية)، في حين حمل الطفرات خارج الهدف الحد الأدنى مقارنة بالمقابلة إيكلف بوساطة نظم28. عموما، قمنا بتطوير رواية، أدوات كريسبر المدمجة، والكل في واحد على منصة إيدلف وأوجز مختلف مزايا استخدام وسيلة إيصال لتحرير الجينات المحسنة.
هنا، بروتوكول إنتاج نظام إيدلف-كريسبر/Cas9 وصف، بما في ذلك الخطوات المختلفة التي تنطوي عليها في الجمعية، وتنقية، والتركيز، والمعايرة إيدلفس، فضلا عن استراتيجيات للتحقق من فعالية الجينات تحرير هذه العوامل الناقلة للمرض. هذا البروتوكول هو قابلة بسهولة لتلبية احتياجات مختلفة من المحققين وهو مصمم بنجاح إنشاء ناقلات LV مع التتر في النطاق من 1 × 1010 وحدات (تو) ترانسدوسينج/مل. يمكن أن تستخدم ناقلات التي تم إنشاؤها من خلال هذا البروتوكول لكفاءة تصيب العديد من أنواع الخلايا المختلفة، بما في ذلك صعوبة ترانسدوسي الخلايا الجذعية الجنينية، الخلايا المكونة للدم (خلايا تي والضامة)، ومثقف و في فيفو- حقن الخلايا العصبية. وعلاوة على ذلك، أن البروتوكول أيضا مناسبة تماما لإنتاج ناقلات لينتيفيرال إينتيجراسي المختصة بكميات مماثلة.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56915/56915fig1.jpg"> رقم 1: التعبئة والتغليف إيدلف. (أ) التخطيطي من البروتين integrase البرية نوع (ب) بلازميد معدلة مستمد من psPAX2 (راجع أساليب البناء بلازميد للحصول على التفاصيل). الممثل [اغروس] هلام صورة استنساخ فرزهم لاستنساخ integrase المتحولة. تم تحليل عينات الحمض النووي التي أعدت باستخدام مجموعة مصغرة عزل الحمض النووي بلازميد قياسية بالهضم مع اكورف وسفي. كذلك تحققت التسلسل المباشر (سانجر) لاستبدال D64E في INTاستنساخ يهضم بشكل صحيح (رقم 5، مربع أحمر متقطع). كان اسمه كاسيت التغليف تفتقر إلى إينتيجراسي pBK43. (ج) يعمل التخطيطي بروتوكول تعداء عابرة لتوليد نواقل إيدلف-كريسبر/Cas9، تظهر الخلايا 293T transfected مع منظمة-ز، والتغليف، والتحوير أشرطة الكاسيت (بلازميد الكل في واحد حزمة الخدمة Sp1-كريسبر/Cas9). الجسيمات الفيروسية أن برعم خارجاً من غشاء الخلية تحتوي على كامل طول الجيش الملكي النيبالي لمكافحة ناقلات (معبراً عنها من الكاسيت التحوير). استخدمت الجيل الثاني من نظام إيدلف والتغليف، والتي تشمل البروتينات التنظيمية تأت والقس Rev التعبير هو تكميل من كاسيت منفصل (RSV-القس-بلازميد). أبريف: لتر-منذ فترة طويلة--المحطة الطرفية فيروس التهاب الفم الحويصلي تكرار، منظمة-ز، ز-البروتين، المروج الفيروس المضخم للخلايا-بكمف؛ ساركومه راوس المروج فيروس (RSV)؛ رر-(رؤ استجابة عنصر). العناصر التنظيمية الأخرى في كاسيت التعبير تشمل مواقع Sp1-الربط، رد القس العنصر (رر)، وودتشوك التهاب الكبد الوبائي فيروس بوسترانسكريبشونال التنظيمية عنصر (وبري)، مروج 1α عامل استطالة أساسية (EFS-NC)، ناقل التعبئة والتغليف عنصر ψ (psi) والبشرية الفيروس المضخم للخلايا (hCMV) مروج ومروج U6 البشرية. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56915/56915fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima XPN-80 Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A99839</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allegra 25R tabletop centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>369434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xMark Microplate Absorbance plate reader</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1681150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACS</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>338960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted fluorescence microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DM IRB2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45-&#956;m filter unit, 500mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430773</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical bottom ultracentrifugation tubes</td>
			<td>Seton Scientific</td>
			<td>5067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tube adapters</td>
			<td>Seton Scientific</td>
			<td>PN 4230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW32Ti swinging-bucket rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>369650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-binding 96-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3366</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 mm TC-Treated Cell Culture dishes with 20 mm Grid</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100mm TC-Treated Culture Dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;M filter unit, 1L</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit (50)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture pipettes, 5 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture pipettes, 10 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture pipettes, 25 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4489</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer with cover slips</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>UX-79001-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human embryonic kidney 293T (HEK 293T) cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>293FT cells</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R70007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cosmic Calf Serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30087.04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-antimycotic solution, 100X</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A5955-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S8636-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Essential Amino Acid (NEAA)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30087.04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 media</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11875-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA 0.05%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BES (N, N-bis (2-hydroxyethyl)-2-amino-ethanesulfonic acid)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B9879 - BES</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G1800-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p24 ELISA reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal anti-p24 antibody</td>
			<td>NIH AIDS Research and Reference Reagent Program</td>
			<td>3537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIV-1 standards</td>
			<td>NIH AIDS Research and Reference Reagent Program</td>
			<td>SP968F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal rabbit anti-p24 antibody</td>
			<td>NIH AIDS Research and Reference Reagent Program</td>
			<td>SP451T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit horseradish peroxidase IgG</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>12-348</td>
			<td>Working concentration 1:1500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal mouse serum, Sterile, 500mL</td>
			<td>Equitech-Bio</td>
			<td>SM30-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum, Sterile, 10mL</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9023</td>
			<td>Working concentration 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMB peroxidase substrate</td>
			<td>KPL</td>
			<td>5120-0076</td>
			<td>Working concentration 1:10,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>psPAX2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMD2.G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRSV-Rev</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lentiCRISPR v2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>52961</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restriction enzymes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BsrGI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0575S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BsmBI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0580S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRV</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0195S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KpnI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0142S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PacI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0547S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SphI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0182S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a protocol for the production of integrase-deficient lentiviral vectors for crispr/cas9-mediated gene knockout in dividing cells

لينتيفيرال الناقلة اختيار مثالي لتقديم عناصر التحرير الجينات للخلايا بسبب قدرتها على ستابلي ترانسدوسينج مجموعة واسعة نطاق من الخلايا والتوسط لمستويات عالية من التعبير الجيني. ولكن قدرتها على الاندماج في جينوم الخلية المضيفة يعزز خطر موتجنيستي insertional وهكذا يثير شواغل السلامة ويحد من استخدامها في ظروف سريرية. علاوة على ذلك، قدم التعبير المستمر عن مكونات الجينات--تحرير هذه الزيادات متجهات التكامل المختصة لينتيفيرال (إيكلفس) احتمال استهداف الجين منحل. وكبديل لذلك، وضعت جيلا جديداً من ناقلات تفتقر إلى إينتيجراسي لينتيفيرال (إيدلفس) الذي يتناول العديد من هذه الشواغل. هنا البروتوكول الإنتاج من منصة إيدلف جديدة ومحسنة لتحرير كريسبر بوساطة الجينات وقائمة بالخطوات التي تشارك في التنقية ويرد وصف لتركيز هذه العوامل الناقلة للمرض وتوصيل وتحرير الجينات كفاءة استخدام HEK-293T وقد أثبتت الخلايا. هذا البروتوكول هو تحجيم بسهولة، ويمكن استخدامها لتوليد إيدلفس عيار عالية قادرة على ترانسدوسينج الخلايا في المختبر و في فيفو. وعلاوة على ذلك، هذا البروتوكول يمكن تكييفها بسهولة لإنتاج إيكلفس.

التحقق من صحة خروج المغلوب-كفاءة ناقلات إيدلف-كريسبر/Cas9 نحن تستخدم الخلايا بروتينات فلورية خضراء-الإعراب عن 293T كنموذج للتحقق من كفاءة كريسبر/Cas9-بوساطة خروج المغلوب الجينات. بروتينات فلورية خضراء + خلايا تم إنشاؤها بواسطة توصيل الخلايا HEK-293T مع بلينتي-التجارة و...

Watch this Scientific Journal Video about A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells at JoVE.com

A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells

بروتوكول لإنتاج ناقلات لينتيفيرال إينتيجراسي التي تفتقر لخروج المغلوب كريسبر/Cas9-بوساطة الجينات في تقسيم الخلايا

يصف لنا استراتيجية إنتاج ناقلات تفتقر إلى إينتيجراسي لينتيفيرال (إيدلفس) كوسائل إيصال كريسبر/Cas9 للخلايا. مع قدرة على التوسط من أجل تحرير سريعة وقوية من الجينات في الخلايا، إيدلفس أكثر أماناً ومنصة متجه نفس القدر من الفعالية لإيصال الجينات بالمقارنة مع نواقل إينتيجراسي المختصة.

Lentiviral vectors are an ideal choice for delivering gene-editing components to cells due to their capacity for stably transducing a broad range of cells ...

The overall goal of this protocol is to describe the production and potential applications of optimized integrase-deficient lentiviral vectors capable of delivering CRISPR/Cas9 transgenes to cells in vivo and in vitro for rapid and efficient gene editing. CRISPR/Cas was a highly-efficient lab for gene editing manipulation. Here is a protocol outline in the production of a highly-concentrated optimized integrase-deficient lentiviral vectors for efficient delivery of CRISPR/Cas gene editing tools.The technique has proven to be very efficient in the causal cell and post-mitotic neurons. Seed the HEK-293T cells a day before the transfection so that the confluency reaches between 70 to 80%the next day. Before transfection, aspirate the old media from the culture plates and add freshly-prepared media lacking serum.In a 15-milliliter conical tube, add all the four plasmids to prepare a plasmid mix for transfecting a 15-centimeter dish. Then, add 312.5 microliters of one molar calcium chloride to the plasmid mix and adjust the volume to 1.25 milliliters with sterile double-distilled water. Keep adding drops of 2X BES buffered solution gradually while vortexing.And then, incubate the mixture at room temperature for 30 minutes. Add 2.5 milliliters of plasmid mixture in drops to each of the 15-centimeter plates. Then, gently swirl the plates and incubate at 37 degrees Celsius with 5%carbon dioxide for two to three hours.After three hours, add 2.5 milliliters of 10%serum to each plate and continue for overnight incubation. Use a 10-milliliter tissue culture pipette to carefully aspirate the supernatant from the transfected cells seeded on each culture dish. Then, pool the entire supernatant in 50-milliliter centrifuge tubes.Place the tube inside a tabletop centrifuge and start the centrifugation. Then, filter the supernatant through a 0.45-micrometer vacuum filter unit. Load the conical ultracentrifugation tubes with different sucrose concentrations to form layers with sucrose gradient.Carefully add the virus containing supernatant to the sucrose gradient. To process the entire 100-milliliter volume of viral supernatant, use six ultracentrifugation tubes in each spin. Then, balance the ultracentrifuge tubes with 1X PBS buffer and spin the samples at 70, 000 G for two hours at 17 degrees Celsius.In clean tubes, collect the 30%and 60%sucrose fractions and add cold 1X PBS buffer to adjust the volume to 100 milliliters. Mix the samples by pipetting it up and down several times. Then, add 20 to 25 milliliters of the viral solution on top of four milliliters of 20%sucrose in 1X PBS solution to prepare the sucrose cushion.Adjust the volume with sterile 1X PBS buffer if the tubes are less than 3/4 full and balance it. Then, spin the samples for two hours at 17 degrees Celsius. Then, pour the supernatant off and drain the remaining liquid by inverting the tubes on paper towels.After aspirating the last remaining droplets, a pellet containing the virus is barely visible as a translucent spot. Next, resuspend the pellet in 70 microliters of 1X PBS by thoroughly pipetting the suspension. Again, transfer the suspension to another tube and thoroughly mix to completely dissolve the pellet.Then, rinse the tube with an additional 50 microliters of cold 1X PBS buffer and mix. Keep the samples on a tabletop microcentrifuge and centrifuge at 10, 000 G for 30 seconds. After centrifugation, add 10 microliter aliquots of the supernatant to each fresh microfuge tube and store them at negative 80 degrees Celsius.Coat a high-binding 96-well plate with 100 microliters of monoclonal anti-p24 antibody at a dilution of one to 1, 500 according to NIH AIDS vaccine program for HIV-1 p24 antigen capture assay kit. Incubate the plate overnight at four degrees Celsius. The next day, wash the plate with 200 microliters of 0.05%TWEEN-20 in cold PBS three times.To avoid non-specific binding, block the plate with 200 microliters of 1%bovine serum albumin for one hour at room temperature. Then, wash the plate with 200 microliters of 0.05%TWEEN-20 in cold PBS three times. Then, prepare the concentrated and non-concentrated vector samples to a final concentration of 10%by diluting the vector with double-distilled water and Triton X-100.Next, prepare the HIV-1 standards using two-fold serial dilution starting at five nanograms per milliliter. After diluting the concentrated and non-concentrated vector samples, pipette it on the plate in triplicates and incubate at four degrees Celsius overnight. The next day, wash the plate, then add 100 microliters of polyclonal rabbit anti-p24 antibody on each plate and incubate at 37 degrees Celsius for four hours.After six washes, incubate the plate with goat anti-rabbit horseradish peroxidase at 37 degrees Celsius for one hour. After multiple washing, incubate the plate with TMB peroxidase substrate at room temperature for 15 minutes. Add one normal hydrochloric acid to stop the reaction.And read the absorbance at 450 nanometers with an absorbance plate reader. Seed the cells in a six-well plate. Next day, when the cells reach 90%confluency, transduce with purified virus at a predetermined multiplicity of infection ranging from one to 10.Then, incubate the plate at 37 degrees Celsius with 5%carbon dioxide. Monitor the plates to record difference in the GFP signals at regular intervals for one to seven days. Look for GFP positive cells under fluorescent microscope fitted with GFP filter set with excitation and emission wavelengths at 470 and 525 nanometers respectively.To differentiate between the population of GFP positive and negative cells, use untransduced cells. A representative agarose gel showing the positive mutated integrase clone. The double-digested clone with restriction enzymes EcoRV and SPH1 in red-dashed box represents the mutated integrase clone.The clone was further sequenced to check the mutation of aspartic acid at position 64 to glutamic acid. A representative bar graph for p24 ELISA assay has been shown depicting the viral titers for SP1-integrase-deficient lentiviral vector CRISPR/Cas9 plotted in the black bar and SP1-integration-competent lentiviral vectors CRISPR/Cas9 plotted in the white bar. The bar graph shows integrase-deficient and competent viral titers in the range of one times 10 to the 10.The bar plots represent the copy number of viral particles per milliliter. Representative fluorescent images showing the mean fluorescent intensity of GFP positive cells under viral treatment. The cells were transduced with integration-competent lentiviral vectors CRISPR or integrase-deficient lentiviral vector CRISPR viral components.A sharp reduction in GFP signal was observed at multiplicity of infection one and five respectively after transducing the integrase-competent or deficient lentiviral components with respect to the untransduced control cells. The main advantage of this technique stem from the ability of integrase-deficient lentiviral vectors to a deliver genome editing tool transiently which significantly enhance its specificity and the safety. If properly conducted, the protocols should take one week to complete.Conducting this protocol, one should expect to generate highly-concentrated lentiviral vectors in the range of 10 to the nine, 10 to the 10 viral genome parameter.

Research

JoVE Journal

Genetics

Using a Fluorescent PCR-capillary Gel Electrophoresis Technique to Genotype CRISPR/Cas9-mediated Knockout Mutants in a High-throughput Format

باستخدام تقنية PCR-نيون الشعرية جل الكهربائي إلى التركيب الوراثي كريسبر / Cas9 بوساطة خروج المغلوب المسوخ في تنسيق عالية الإنتاجية

The development of programmable genome-editing tools has facilitated the use of reverse genetics to understand the roles specific genomic sequences play ...

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

جيل يعتمد على الاختيار ومستقل من كريسبر / كاس 9 بوساطة جين نوكوتس في خلايا الثدييات

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

A Universal Protocol for Large-scale gRNA Library Production from any DNA Source

بروتوكول عالمي جرنة على نطاق واسع "الإنتاج مكتبة" من أي "مصدر الحمض النووي"

The popularity of the CRISPR/Cas9 system for both genome and epigenome engineering stems from its simplicity and adaptability. An effector (the Cas9 ...

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

كريسبر/Cas9-بوساطة التكامل المستهدفة في فيفو استخدام استراتيجية تستند إلى الانضمام إلى التماثل بوساطة نهاية

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

كفاءة الإنتاج وتحديد كريسبر/Cas9-المنشأة الضربة القاضية الجينات في "النظام النموذجي" دانيو rerio

Characterization of the clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system of Streptococcus pyogenes has enabled the development ...

Production and Purification of Baculovirus for Gene Therapy Application

إنتاج وتنقية باكولوفيروس لتطبيق العلاج الجيني

Baculovirus has traditionally been used for the production of recombinant protein and vaccine. However, more recently, baculovirus is emerging as a ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

تعطيل الجينات ذات كفاءة عالية من الخلايا السلف مورين والبشرية المكونة للدم قبل كريسبر/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

Lentiviral Mediated Production of Transgenic Mice: A Simple and Highly Efficient Method for Direct Study of Founders

لينتيفيرال توسط إنتاج فئران المحورة وراثيا: طريقة بسيطة وذات كفاءة عالية للدراسة مباشرة من مؤسسي

For almost 40 years, pronuclear DNA injection represents the standard method to generate transgenic mice with random integration of transgenes. Such a ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

تحديد تسلسل الجينات التنظيمية استخدام تسلسل الجيل المقبل من تكيف كروموسوم دائرية الفائق التقاط (ج 4-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

In vivo Application of the REMOTE-control System for the Manipulation of Endogenous Gene Expression

في تطبيق نظام التحكم عن بعد "التلاعب بالتعبير الجيني الذاتية" فيفو

Here we describe a protocol for implementing the REMOTE-control system (Reversible Manipulation of Transcription at Endogenous loci), which allows for ...