Name: a protocol for the production of integrase-deficient lentiviral vectors for crispr/cas9-mediated gene knockout in dividing cells
Uploaded: 2017-12-12T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells at JoVE.com

Wir möchten die Abteilung für Neurobiologie, Duke University School of Medicine und Dekanat für Grundlagenforschung, Duke University bedanken. Wir danken auch Mitglieder des Duke viraler Vektor Kerns für Kommentare auf das Manuskript. Plasmid pLenti CRISPRv2 war Geschenk von Feng Zhang (Broad Institute). Die LV-Verpackungssystem einschließlich der Plasmide psPAX2, war VSV-G, pMD2.G und pRSV-Rev eine Art Geschenk von Didier Trono (EPFL, Schweiz). Gewähren Sie finanzieller Unterstützung für diese Arbeit von der University Of South Carolina School Of Medicine, zur Verfügung gestellt wurde, RDF18080-E202 (B.K).

(1) Kultivierung HEK-293T Zellen und Aussaat zur Transfektion
Hinweis: Menschliche embryonale Nieren 293T (HEK-293T) Zellen wachsen in DMEM, hohe Glukose Medien mit 10 % bovine Kälberserum ergänzt mit Eisen und Wachstum Promotoren und 1 x Antibiotikum antimykotische Lösung ergänzt (100 X Lösung enthält 10.000 Einheiten Penicillin 10 mg Streptomycin und 25 µg Amphotericin B pro mL). Die Medien ist auch mit 1 X Natrium Pyruvat, 1 X nicht-essentielle Aminosäure-Mix und 2 mM L-Glutamin ergä...

<ol>
	<li>Horvath, P., Barrangou, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas,+the+immune+system+of+bacteria+and+archaea.">CRISPR/Cas, the immune system of bacteria and archaea.</a> Science. 327 (5962), 167-170 (2010).</li><li>Marraffini, L. A., Sontheimer, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+interference:+RNA-directed+adaptive+immunity+in+bacteria+and+archaea.">CRISPR interference: RNA-directed adaptive immunity in bacteria and archaea.</a> Nat Rev Genet. 11 (3), 181-190 (2010).</li><li>Kim, H., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+genome+engineering+with+programmable+nucleases.">A guide to genome engineering with programmable nucleases.</a> Nat Rev Genet. 15 (5), 321-334 (2014).</li><li>Bellec, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CFTR+inactivation+by+lentiviral+vector-mediated+RNA+interference+and+CRISPR-Cas9+genome+editing+in+human+airway+epithelial+cells.">CFTR inactivation by lentiviral vector-mediated RNA interference and CRISPR-Cas9 genome editing in human airway epithelial cells.</a> Curr Gene Ther. 15 (5), 447-459 (2015).</li><li>Kennedy, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+hepatitis+B+virus+DNA+accumulation+in+chronically+infected+cells+using+a+bacterial+CRISPR/Cas+RNA-guided+DNA+endonuclease.">Suppression of hepatitis B virus DNA accumulation in chronically infected cells using a bacterial CRISPR/Cas RNA-guided DNA endonuclease.</a> Virology. 476, 196-205 (2015).</li><li>Roehm, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+HSV-1+Replication+by+Gene+Editing+Strategy.">Inhibition of HSV-1 Replication by Gene Editing Strategy.</a> Sci Rep. 6, 23146 (2016).</li><li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCR5+gene+disruption+via+lentiviral+vectors+expressing+Cas9+and+single+guided+RNA+renders+cells+resistant+to+HIV-1+infection.">CCR5 gene disruption via lentiviral vectors expressing Cas9 and single guided RNA renders cells resistant to HIV-1 infection.</a> PLoS One. 9 (12), e115987 (2014).</li><li>Kantor, B., Bailey, R. M., Wimberly, K., Kalburgi, S. N., Gray, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+gene+transfer+to+the+central+nervous+system.">Methods for gene transfer to the central nervous system.</a> Adv Genet. 87, 125-197 (2014).</li><li>Lebbink, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+combinational+CRISPR/Cas9+gene-editing+approach+can+halt+HIV+replication+and+prevent+viral+escape.">A combinational CRISPR/Cas9 gene-editing approach can halt HIV replication and prevent viral escape.</a> Sci Rep. 7, 41968 (2017).</li><li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9-Mediated+CCR5+Ablation+in+Human+Hematopoietic+Stem/Progenitor+Cells+Confers+HIV-1+Resistance+In+Vivo.">CRISPR/Cas9-Mediated CCR5 Ablation in Human Hematopoietic Stem/Progenitor Cells Confers HIV-1 Resistance In Vivo.</a> Mol Ther. , (2017).</li><li>Yiu, G., Tieu, E., Nguyen, A. T., Wong, B., Smit-McBride, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+Disruption+of+VEGF-A+Expression+in+Human+Retinal+Pigment+Epithelial+Cells+Using+CRISPR-Cas9+Endonuclease.">Genomic Disruption of VEGF-A Expression in Human Retinal Pigment Epithelial Cells Using CRISPR-Cas9 Endonuclease.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 57 (13), 5490-5497 (2016).</li><li>Kabadi, A. M., Ousterout, D. G., Hilton, I. B., Gersbach, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+CRISPR/Cas9-based+genome+engineering+from+a+single+lentiviral+vector.">Multiplex CRISPR/Cas9-based genome engineering from a single lentiviral vector.</a> Nucleic Acids Res. 42 (19), e147 (2014).</li><li>Fu, Y., Sander, J. D., Reyon, D., Cascio, V. M., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+CRISPR-Cas+nuclease+specificity+using+truncated+guide+RNAs.">Improving CRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs.</a> Nat Biotechnol. 32 (3), 279-284 (2014).</li><li>Hsu, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+targeting+specificity+of+RNA-guided+Cas9+nucleases.">DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases.</a> Nat Biotechnol. 31 (9), 827-832 (2013).</li><li>Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+RNA-guided+genome+editing+in+human+cells+via+delivery+of+purified+Cas9+ribonucleoproteins.">Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins.</a> Genome Res. 24 (6), 1012-1019 (2014).</li><li>Pattanayak, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+profiling+of+off-target+DNA+cleavage+reveals+RNA-programmed+Cas9+nuclease+specificity.">High-throughput profiling of off-target DNA cleavage reveals RNA-programmed Cas9 nuclease specificity.</a> Nat Biotechnol. 31 (9), 839-843 (2013).</li><li>Shalem, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+CRISPR-Cas9+knockout+screening+in+human+cells.">Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells.</a> Science. 343 (6166), 84-87 (2014).</li><li>Schaefer, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unexpected+mutations+after+CRISPR-Cas9+editing+in+vivo.">Unexpected mutations after CRISPR-Cas9 editing in vivo.</a> Nat Methods. 14 (6), 547-548 (2017).</li><li>Choi, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentivirus+pre-packed+with+Cas9+protein+for+safer+gene+editing.">Lentivirus pre-packed with Cas9 protein for safer gene editing.</a> Gene Ther. 23 (7), 627-633 (2016).</li><li>Platt, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas9+knockin+mice+for+genome+editing+and+cancer+modeling.">CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling.</a> Cell. 159 (2), 440-455 (2014).</li><li>Truong, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+intein-mediated+split-Cas9+system+for+gene+therapy.">Development of an intein-mediated split-Cas9 system for gene therapy.</a> Nucleic Acids Res. 43 (13), 6450-6458 (2015).</li><li>Nelson, C. E., Gersbach, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+Delivery+Vehicles+for+Genome+Editing.">Engineering Delivery Vehicles for Genome Editing.</a> Annu Rev Chem Biomol Eng. 7, 637-662 (2016).</li><li>Jaalouk, D. E., Crosato, M., Brodt, P., Galipeau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+histone+deacetylation+in+293GPG+packaging+cell+line+improves+the+production+of+self-inactivating+MLV-derived+retroviral+vectors.">Inhibition of histone deacetylation in 293GPG packaging cell line improves the production of self-inactivating MLV-derived retroviral vectors.</a> Virol J. 3, 27 (2006).</li><li>Ellis, B. L., Potts, P. R., Porteus, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creating+higher+titer+lentivirus+with+caffeine.">Creating higher titer lentivirus with caffeine.</a> Hum Gene Ther. 22 (1), 93-100 (2011).</li><li>Hoban, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+Genome+Editing+Reagents+to+Hematopoietic+Stem/Progenitor+Cells.">Delivery of Genome Editing Reagents to Hematopoietic Stem/Progenitor Cells.</a> Curr Protoc Stem Cell Biol. 36, 1-10 (2016).</li><li>Bayer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large+U3+deletion+causes+increased+in+vivo+expression+from+a+nonintegrating+lentiviral+vector.">A large U3 deletion causes increased in vivo expression from a nonintegrating lentiviral vector.</a> Mol Ther. 16 (12), 1968-1976 (2008).</li><li>Kantor, B., Ma, H., Webster-Cyriaque, J., Monahan, P. E., Kafri, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+activation+of+unintegrated+HIV-1+genomes+by+gut-associated+short+chain+fatty+acids+and+its+implications+for+HIV+infection.">Epigenetic activation of unintegrated HIV-1 genomes by gut-associated short chain fatty acids and its implications for HIV infection.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (44), 18786-18791 (2009).</li><li>Ortinski, P. I., O'Donovan, B., Dong, X., Kantor, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrase-Deficient+Lentiviral+Vector+as+an+All-in-One+Platform+for+Highly+Efficient+CRISPR/Cas9-Mediated+Gene+Editing.">Integrase-Deficient Lentiviral Vector as an All-in-One Platform for Highly Efficient CRISPR/Cas9-Mediated Gene Editing.</a> Mol Ther Methods Clin Dev. 5, 153-164 (2017).</li><li>Kantor, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notable+reduction+in+illegitimate+integration+mediated+by+a+PPT-deleted,+nonintegrating+lentiviral+vector.">Notable reduction in illegitimate integration mediated by a PPT-deleted, nonintegrating lentiviral vector.</a> Mol Ther. 19 (3), 547-556 (2011).</li><li>Berkhout, B., Verhoef, K., van Wamel, J. L., Back, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+instability+of+live,+attenuated+human+immunodeficiency+virus+type+1+vaccine+strains.">Genetic instability of live, attenuated human immunodeficiency virus type 1 vaccine strains.</a> J Virol. 73 (2), 1138-1145 (1999).</li><li>Gomez-Gonzalo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hepatitis+B+virus+X+protein+induces+HIV-1+replication+and+transcription+in+synergy+with+T-cell+activation+signals:+functional+roles+of+NF-kappaB/NF-AT+and+SP1-binding+sites+in+the+HIV-1+long+terminal+repeat+promoter.">The hepatitis B virus X protein induces HIV-1 replication and transcription in synergy with T-cell activation signals: functional roles of NF-kappaB/NF-AT and SP1-binding sites in the HIV-1 long terminal repeat promoter.</a> J Biol Chem. 276 (38), 35435-35443 (2001).</li><li>Kim, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+zinc+finger+fusions+targeting+Sp1-binding+sites+and+the+trans-activator-responsive+element+potently+repress+transcription+and+replication+of+HIV-1.">Artificial zinc finger fusions targeting Sp1-binding sites and the trans-activator-responsive element potently repress transcription and replication of HIV-1.</a> J Biol Chem. 280 (22), 21545-21552 (2005).</li><li>Ortinski, P. I., Lu, C., Takagaki, K., Fu, Z., Vicini, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+distinct+alpha+subunits+of+GABAA+receptor+regulates+inhibitory+synaptic+strength.">Expression of distinct alpha subunits of GABAA receptor regulates inhibitory synaptic strength.</a> J Neurophysiol. 92 (3), 1718-1727 (2004).</li><li>Van Lint, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factor+binding+sites+downstream+of+the+human+immunodeficiency+virus+type+1+transcription+start+site+are+important+for+virus+infectivity.">Transcription factor binding sites downstream of the human immunodeficiency virus type 1 transcription start site are important for virus infectivity.</a> J Virol. 71 (8), 6113-6127 (1997).</li><li>Van Lint, C., Ghysdael, J., Paras, P., Burny, A., Verdin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transcriptional+regulatory+element+is+associated+with+a+nuclease-hypersensitive+site+in+the+pol+gene+of+human+immunodeficiency+virus+type+1.">A transcriptional regulatory element is associated with a nuclease-hypersensitive site in the pol gene of human immunodeficiency virus type 1.</a> J Virol. 68 (4), 2632-2648 (1994).</li><li>Xu, W., Russ, J. L., Eiden, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+residual+promoter+activity+in+gamma-retroviral+self-inactivating+(SIN)+vectors.">Evaluation of residual promoter activity in gamma-retroviral self-inactivating (SIN) vectors.</a> Mol Ther. 20 (1), 84-90 (2012).</li><li>. Testing for Replication Competent Retrovirus (RCR)/Lentivirus (RCL) in Retroviral and Lentiviral Vector Based Gene Therapy Products - Revisiting Current FDA Recommendations Available from: <a target="_blank" href="https://sites.duke.edu/dvvc/files/2016/05/FDA-recommendation-for-RCR-testing.pdf">https://sites.duke.edu/dvvc/files/2016/05/FDA-recommendation-for-RCR-testing.pdf</a> (2017)</li><li>. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories Available from: <a target="_blank" href="https://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/bmbl.pdf">https://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/bmbl.pdf</a> (2017)</li><li>Dull, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+third-generation+lentivirus+vector+with+a+conditional+packaging+system.">A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system.</a> J Virol. 72 (11), 8463-8471 (1998).</li><li>Liu, X. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Editing+DNA+Methylation+in+the+Mammalian+Genome.">Editing DNA Methylation in the Mammalian Genome.</a> Cell. 167 (1), 233-247 (2016).</li><li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+genome+editing+using+Staphylococcus+aureus+Cas9.">In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9.</a> Nature. 520 (7546), 186-191 (2015).</li><li>Zetsche, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cpf1+is+a+single+RNA-guided+endonuclease+of+a+class+2+CRISPR-Cas+system.">Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system.</a> Cell. 163 (3), 759-771 (2015).</li></ol>

IDLVs haben damit begonnen, als das Fahrzeug der Wahl für die in-Vivo -gen-Bearbeitung, vor allem im Zusammenhang mit genetischen Erkrankungen, weitgehend aufgrund des geringen Risikos Mutagenese diese Vektoren im Vergleich zu integrieren Lieferung Plattformen22 zugeordnet entstehen , 28. im aktuellen Manuskript, wollten wir ausführlich das Protokoll verbunden mit der Produktion von der verbesserten all-in-One IDLV-CRISPR/Cas9 System, das vor kurzem in...

Gen präzise Bearbeitung bildet den Grundstein biomedizinische Fortschritte, die die Entwicklung neuer Strategien zur Bekämpfung genetischer Krankheiten betreffen. An die Spitze der gen-Bearbeitungs-Technologien ist die Methode unter Berufung auf die Nutzung der clustered rregelmässig -IchNterspaced sHort pAlindromic REpeats (CRISPR) / Cas9-System, das zunächst identifiziert wurde als Bestandteil des bakteriellen Immunität gegen die Invasion der viralen Erbsubstanz (rezensiert in Referenzen1,2). Ein wesentlicher Vorteil des CRISPR/Cas9-Systems gegenüber anderen gen-editing-Tools, wie z. B. Zinkfinger-Nukleasen (ZFN) und Transkription Aktivator-ähnliche Effektor Nukleasen (TALENs) (rezensiert in Referenz3), ist die relative Einfachheit der Plasmid-Design und Bau von CRISPR-Komponenten – ein Feature, das den Ausbau der gen-Bearbeitung von wenigen Speziallabors für eine viel breitere Forschungsgemeinschaft angetrieben hat. Darüber hinaus haben die Einfachheit der CRISPR/Cas9 Programmierung und seine Kapazität für Multiplex Zielerfassung seine Popularität als eine kostengünstige und einfach zu bedienende Technologie weiter angeheizt. Unter den verschiedenen Methoden zur Verfügung, um Forscher solche gen-Bearbeiten von Komponenten an Zellen zu liefern bleiben virale Vektoren bei weitem die beliebteste und effizientes System.
Lentivirale Vektoren (LVs) entstanden als das Fahrzeug der Wahl für die Komponenten des CRISPR/Cas9 System in Vivo für unterschiedlichste Anwendungen4,5,6,7liefert. Mehrere wichtige Funktionen machen LVs eine beliebte Wahl für diesen Prozess, einschließlich ihrer Fähigkeit, sowohl trennende und nicht teilenden Zellen, niedrige Immunogenität und minimale zelluläre Toxizität (rezensiert in Referenz8) zu infizieren. Infolgedessen wurde LV-vermittelte Gentherapie in der Behandlung von Infektionskrankheiten wie HIV-1, HBV und HSV-1, sowie bei der Korrektur von Mängeln, die zugrunde liegenden menschlichen Erbkrankheiten, wie Mukoviszidose und Neo-Kreislauf Makuladegeneration eingesetzt 4 , 5 , 7 , 9 , 10 , 11. Außerdem, LVs wurden effektiv geändert um Multiplex-gen an unterschiedliche genomic Loci mit einem einzigen Vektor System12Bearbeitung ausführen.
Jedoch kann die inhärente Eigenschaft des LVs in das Wirtsgenom integrieren mutagen und oft behindert ihre Nützlichkeit als Transgen Lieferfahrzeuge, vor allem im klinischen Umfeld. Da zudem stabil integriert LVs ihre transgene auf einem nachhaltig hohen Niveau zum Ausdruck bringen, ist dieses System ungeeignet für die Lieferung von gen-Bearbeiten von Komponenten wie CRISPR/Cas9; Überexpression des Cas9-Guide RNA (gRNA) und ähnliche Proteine wie ZFN, sind verbunden mit erhöhten Konzentrationen von Ziel-Effekte, darunter unerwünschte Mutationen13,14,15,16 , 17 und können potenziell Zytotoxizität18verbessern. Daher unbedingt um präzise zu erreichen gen-Bearbeitung mit minimal Ziel Effekte, Design-Systemen, die für die transiente Expression des Gens, die Bearbeitung von Komponenten ermöglichen.
In den letzten Jahren wurden eine Vielzahl von Plattformen entwickelt, um vorübergehend CRISPR/Cas9 in Zellen16,19,20,21 (rezensiert in Referenz22) zum Ausdruck bringen. Dazu gehören Methoden, die direkt Einführung von gereinigten Cas9 zusammen mit der passenden Guide-RNAs in Zellen, die gezeigt wurde, effektiver auf gezielte gen-Bearbeitung im Vergleich zu Plasmid-vermittelte Transfektion16abhängig. Studien haben gezeigt, dass Ribonucleoprotein (RNP) komplexe, bestehend aus Leitfaden RNA/Cas9 Partikel werden schnell umgedreht nach Vermittlung Spaltung der DNA auf ihre Ziele, was darauf hindeutet, dass kurzfristige Ausdruck dieser Komponenten zu erzielen ist robuste gen16bearbeiten. Denkbar, nicht-Integration von viralen Vektoren Plattformen wie Adeno-assoziierten viralen Vektoren (Flugabwehrpanzer) bieten eine echte Alternative um gen-Bearbeitung Maschinen an Zellen zu liefern. Leider AAV Capsids besitzen deutlich geringere Verpackung Fähigkeit als LVs (< 5kb), die schwer behindert ihre Fähigkeit, das Mehrkomponenten CRISPR-Toolkit innerhalb einer einzigen Vektor (rezensiert in Referenz8) zu verpacken. Es ist erwähnenswert, dass die Zugabe von Verbindungen, die Histon Deacetylases (z.B. Natrium Butyrat23) hemmen oder verhindern den Zellzyklus (z.B. Koffein24) gezeigt worden, um Lentivirale Titer zu erhöhen. Trotz der jüngsten Fortschritte sind die transiente Expression-Systeme so weit entwickelt noch mehrere Mängel auf, z. B. geringere Produktionseffizienz, behindert durch führen zu reduzierten virale Titer und niedrigen Transduktion Effizienz erzeugt durch Viren solche Ansätze25.
Integrase-defizienten Lentivirale Vektoren (IDLVs) stellen einen großen Fortschritt in der Entwicklung von gen-Lieferfahrzeuge, wie sie die Verpackung-Fähigkeit des LVs mit dem zusätzlichen Vorteil der AAV-artigen episomal Wartung in Zellen verbinden. Diese Funktionen helfen IDLVs, die die wichtigsten Probleme im Zusammenhang mit Integration von Vektoren, Vis À Vis kontinuierliche Überexpression von potenziell genotoxische Elementen und Integration-vermittelten Mutagenität weitgehend zu umgehen. Es wurde bereits gezeigt, dass IDLVs erfolgreich zur Verbesserung der episomal gen Ausdruck26,27geändert werden kann. In Bezug auf IDLV-vermittelten CRISPR/Cas9 Lieferung beschränkt niedrige Titer und niedriger Ausdruck von Episome getragen Genomen relativ Integrase-kompetente Lentivirale Systeme ihre Nützlichkeit als Bona Fide -Tools für die Bereitstellung von Genom-Bearbeitung transgene Konstrukte. Wir zeigten kürzlich, dass Transgene Ausdruck und virale Titer IDLV Produktion durch die Einbeziehung von Bindungsstellen für den Transkriptionsfaktor Sp1 in der viralen Ausdruck Kassette28erheblich verbessert werden. Die modifizierte IDLVs unterstützt robust CRISPR-vermittelten gen Bearbeitung sowohl in Vitro (in HEK-293T Zellen) und in Vivo (im Post-mitotische Gehirnneuronen), während minimalste Ziel Mutationen im Vergleich zu den entsprechenden ICLV-vermittelte Induktion Systeme-28. Insgesamt entwickelten wir eine neuartige, kompakte, all-in-One CRISPR-Toolkit auf einer IDLV Plattform durchgeführt und erläutert die verschiedenen Vorteile der Verwendung solch ein Transportvehikel für verbesserte gen zu bearbeiten.
Hier ist das Produktionsprotokoll des IDLV-CRISPR/Cas9-Systems beschrieben, darunter die verschiedenen Schritte in der Montage, Reinigung, Konzentration und Titration von IDLVs sowie Strategien, die gen-Bearbeitung Wirksamkeit dieser Vektoren zu validieren. Dieses Protokoll ist leicht skalierbar, um die Bedürfnisse der verschiedenen Forschern und wurde entwickelt, um erfolgreich LV Vektoren mit Titer im Bereich von 1 x 1010 transducing Einheiten (TU) erzeugen / mL. Die Vektoren generiert durch dieses Protokoll können genutzt werden, um effizient mehrere verschiedene Zelltypen, einschließlich schwer transduzieren embryonale Stammzellen, blutbildenden Zellen (T-Zellen und Makrophagen) und kultiviert und in Vivozu infizieren- eingespritzte Neuronen. Darüber hinaus ist das Protokoll für die Produktion der Integrase-kompetente Lentivirale Vektoren in ähnlichen Mengen gleich gut geeignet.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56915/56915fig1.jpg"> Abbildung 1: IDLV Verpackung. (a) schematische Darstellung der Wildtyp Integrase Protein (b) das modifizierte Plasmid wurde von psPAX2 abgeleitet (siehe Methoden, Plasmid-Konstruktion für Details). Vertreter Agarose Gelbild geschirmt für mutierte Integrase Klone Klone. DNA-Proben mit den standard Plasmid DNA-Isolierung Mini-Kit zubereitet wurden durch Vergärung mit EcoRV und SphI analysiert. Der richtig verdaut Klon (Nummer 5, gestrichelten roten Feld) wurde weiter durch Sequenzierung der direkten (Sanger) für die D64E Substitution in INTüberprüft. Die Integrase-defizienten Verpackung Kassette wurde pBK43 genannt. (c) schematische Darstellung der transiente Transfektion Protokoll eingesetzt, um generieren IDLV-CRISPR/Cas9 Vektoren zeigen, dass 293T Zellen mit VSV-G, Verpackungen und Transgen Kassetten (Sp1-CRISPR/Cas9 all-in-One Plasmid) transfiziert. Viruspartikel, die heraus von der Zellmembran Knospe enthalten die Full-length RNA des Vektors (ausgedrückt aus der Transgen-Kassette). Die zweite Generation der IDLV-Verpackungssystem diente, worunter die regulatorische Proteine Tat und Rev Rev Ausdruck wird von einer separaten Kassette (RSV-REV-Plasmid) ergänzt. Abbrev: LTR Long Terminal repeat, VSV-G, Stomatitis vesicularis Virus G-Protein, pCMV-Zytomegalievirus Veranstalter; Rous Sarkom-Virus (RSV) Veranstalter; RRE-(Rev-Response-Element). Weitere regulatorische Elemente auf der Expressionskassette gehören Sp1-Bindungsstellen, Rev Response-Element (RRE), Murmeltier Hepatitis Virus posttranskritionelle regulatorische Element (WPRE), Kern-Dehnung Faktor 1α Förderer (EFS-NC), der Vektor-Verpackung Element-ψ (Psi), menschliches Cytomegalovirus (hCMV) Veranstalter und menschlichen U6 Förderer. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56915/56915fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima XPN-80 Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A99839</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allegra 25R tabletop centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>369434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xMark Microplate Absorbance plate reader</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1681150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACS</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>338960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted fluorescence microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DM IRB2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45-&#956;m filter unit, 500mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430773</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical bottom ultracentrifugation tubes</td>
			<td>Seton Scientific</td>
			<td>5067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tube adapters</td>
			<td>Seton Scientific</td>
			<td>PN 4230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW32Ti swinging-bucket rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>369650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-binding 96-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3366</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 mm TC-Treated Cell Culture dishes with 20 mm Grid</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100mm TC-Treated Culture Dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;M filter unit, 1L</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit (50)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture pipettes, 5 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture pipettes, 10 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture pipettes, 25 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4489</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer with cover slips</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>UX-79001-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human embryonic kidney 293T (HEK 293T) cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>293FT cells</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R70007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cosmic Calf Serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30087.04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-antimycotic solution, 100X</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A5955-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S8636-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Essential Amino Acid (NEAA)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30087.04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 media</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11875-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA 0.05%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BES (N, N-bis (2-hydroxyethyl)-2-amino-ethanesulfonic acid)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B9879 - BES</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G1800-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p24 ELISA reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal anti-p24 antibody</td>
			<td>NIH AIDS Research and Reference Reagent Program</td>
			<td>3537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIV-1 standards</td>
			<td>NIH AIDS Research and Reference Reagent Program</td>
			<td>SP968F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal rabbit anti-p24 antibody</td>
			<td>NIH AIDS Research and Reference Reagent Program</td>
			<td>SP451T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit horseradish peroxidase IgG</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>12-348</td>
			<td>Working concentration 1:1500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal mouse serum, Sterile, 500mL</td>
			<td>Equitech-Bio</td>
			<td>SM30-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum, Sterile, 10mL</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9023</td>
			<td>Working concentration 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMB peroxidase substrate</td>
			<td>KPL</td>
			<td>5120-0076</td>
			<td>Working concentration 1:10,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>psPAX2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMD2.G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRSV-Rev</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lentiCRISPR v2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>52961</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restriction enzymes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BsrGI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0575S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BsmBI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0580S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRV</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0195S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KpnI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0142S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PacI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0547S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SphI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0182S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a protocol for the production of integrase-deficient lentiviral vectors for crispr/cas9-mediated gene knockout in dividing cells

Lentivirale Vektoren sind eine ideale Wahl für die Bereitstellung von gen-Bearbeiten von Komponenten auf Zellen aufgrund ihrer Fähigkeit zur stabil transducing einen breiten Bereich von Zellen und hohe Stufen der Genexpression zu vermitteln. Jedoch ihre Fähigkeit zur Integration in das Wirtsgenom Zelle erhöht das Risiko der insertional Mutagenität und damit Sicherheit Bedenken und schränkt ihre Verwendung in klinischen Umgebungen. Weiter, geliefert der anhaltenden Ausdruck der gen-Bearbeiten von Komponenten durch diese Integration zuständigen Lentivirale Vektoren (ICLVs) erhöht die Wahrscheinlichkeit von promiscuous Gene targeting. Als Alternative hat eine neue Generation von Integrase-defizienten Lentivirale Vektoren (IDLVs) entwickelt, die viele dieser Bedenken befasst. Hier Produktionsprotokoll einer neuen und verbesserten IDLV-Plattform für CRISPR-vermittelten gen bearbeiten und Liste der Schritte bei der Reinigung und Konzentration von solchen Vektoren beschrieben und deren Transduktion und gen-Bearbeitung Effizienz mit HEK-293T Zellen zeigte. Dieses Protokoll ist leicht skalierbar und kann verwendet werden, um hohe Titer IDLVs generieren, die in der Lage, transducing Zellen in Vitro und in Vivo. Darüber hinaus kann dieses Protokoll für die Herstellung von ICLVs leicht angepasst werden.

Validierung der Ko-Effizienz der IDLV-CRISPR/Cas9 Vektoren Die Effizienz von CRISPR/Cas9-vermittelte gen Knockout Validierung verwendet wir GFP exprimierenden 293T Zellen als Modell. GLP +-Zellen wurden durch Transduktion von HEK-293T Zellen mit pLenti-GLP (vBK201a) bei einer MOI von 0,5 (Abb. 3 b, "keine-Virus" Panel) erzeugt. Die SgRNA-GLP/Cas9 all-in-One-Vektor-Kassette wurde in IDLV oder ICLV Partikel verpackt und die Effizienz der Pro...

Watch this Scientific Journal Video about A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells at JoVE.com

A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells

Ein Protokoll für die Produktion der Integrase-defizienten Lentivirale Vektoren für CRISPR/Cas9-vermittelte Gen Knockout in teilenden Zellen

Wir beschreiben die Produktionsstrategie der Integrase-defizienten Lentivirale Vektoren (IDLVs) als Vehikel für Zellen CRISPR/Cas9 bereitzustellen. Mit der Fähigkeit, schnell und robust Gene in Zellen bearbeiten zu vermitteln IDLVs präsentieren ein sicherer und ebenso wirksame Vektor Plattform für gen-Lieferung im Vergleich zu Integrase-kompetente Vektoren.

Lentiviral vectors are an ideal choice for delivering gene-editing components to cells due to their capacity for stably transducing a broad range of cells ...

The overall goal of this protocol is to describe the production and potential applications of optimized integrase-deficient lentiviral vectors capable of delivering CRISPR/Cas9 transgenes to cells in vivo and in vitro for rapid and efficient gene editing. CRISPR/Cas was a highly-efficient lab for gene editing manipulation. Here is a protocol outline in the production of a highly-concentrated optimized integrase-deficient lentiviral vectors for efficient delivery of CRISPR/Cas gene editing tools.The technique has proven to be very efficient in the causal cell and post-mitotic neurons. Seed the HEK-293T cells a day before the transfection so that the confluency reaches between 70 to 80%the next day. Before transfection, aspirate the old media from the culture plates and add freshly-prepared media lacking serum.In a 15-milliliter conical tube, add all the four plasmids to prepare a plasmid mix for transfecting a 15-centimeter dish. Then, add 312.5 microliters of one molar calcium chloride to the plasmid mix and adjust the volume to 1.25 milliliters with sterile double-distilled water. Keep adding drops of 2X BES buffered solution gradually while vortexing.And then, incubate the mixture at room temperature for 30 minutes. Add 2.5 milliliters of plasmid mixture in drops to each of the 15-centimeter plates. Then, gently swirl the plates and incubate at 37 degrees Celsius with 5%carbon dioxide for two to three hours.After three hours, add 2.5 milliliters of 10%serum to each plate and continue for overnight incubation. Use a 10-milliliter tissue culture pipette to carefully aspirate the supernatant from the transfected cells seeded on each culture dish. Then, pool the entire supernatant in 50-milliliter centrifuge tubes.Place the tube inside a tabletop centrifuge and start the centrifugation. Then, filter the supernatant through a 0.45-micrometer vacuum filter unit. Load the conical ultracentrifugation tubes with different sucrose concentrations to form layers with sucrose gradient.Carefully add the virus containing supernatant to the sucrose gradient. To process the entire 100-milliliter volume of viral supernatant, use six ultracentrifugation tubes in each spin. Then, balance the ultracentrifuge tubes with 1X PBS buffer and spin the samples at 70, 000 G for two hours at 17 degrees Celsius.In clean tubes, collect the 30%and 60%sucrose fractions and add cold 1X PBS buffer to adjust the volume to 100 milliliters. Mix the samples by pipetting it up and down several times. Then, add 20 to 25 milliliters of the viral solution on top of four milliliters of 20%sucrose in 1X PBS solution to prepare the sucrose cushion.Adjust the volume with sterile 1X PBS buffer if the tubes are less than 3/4 full and balance it. Then, spin the samples for two hours at 17 degrees Celsius. Then, pour the supernatant off and drain the remaining liquid by inverting the tubes on paper towels.After aspirating the last remaining droplets, a pellet containing the virus is barely visible as a translucent spot. Next, resuspend the pellet in 70 microliters of 1X PBS by thoroughly pipetting the suspension. Again, transfer the suspension to another tube and thoroughly mix to completely dissolve the pellet.Then, rinse the tube with an additional 50 microliters of cold 1X PBS buffer and mix. Keep the samples on a tabletop microcentrifuge and centrifuge at 10, 000 G for 30 seconds. After centrifugation, add 10 microliter aliquots of the supernatant to each fresh microfuge tube and store them at negative 80 degrees Celsius.Coat a high-binding 96-well plate with 100 microliters of monoclonal anti-p24 antibody at a dilution of one to 1, 500 according to NIH AIDS vaccine program for HIV-1 p24 antigen capture assay kit. Incubate the plate overnight at four degrees Celsius. The next day, wash the plate with 200 microliters of 0.05%TWEEN-20 in cold PBS three times.To avoid non-specific binding, block the plate with 200 microliters of 1%bovine serum albumin for one hour at room temperature. Then, wash the plate with 200 microliters of 0.05%TWEEN-20 in cold PBS three times. Then, prepare the concentrated and non-concentrated vector samples to a final concentration of 10%by diluting the vector with double-distilled water and Triton X-100.Next, prepare the HIV-1 standards using two-fold serial dilution starting at five nanograms per milliliter. After diluting the concentrated and non-concentrated vector samples, pipette it on the plate in triplicates and incubate at four degrees Celsius overnight. The next day, wash the plate, then add 100 microliters of polyclonal rabbit anti-p24 antibody on each plate and incubate at 37 degrees Celsius for four hours.After six washes, incubate the plate with goat anti-rabbit horseradish peroxidase at 37 degrees Celsius for one hour. After multiple washing, incubate the plate with TMB peroxidase substrate at room temperature for 15 minutes. Add one normal hydrochloric acid to stop the reaction.And read the absorbance at 450 nanometers with an absorbance plate reader. Seed the cells in a six-well plate. Next day, when the cells reach 90%confluency, transduce with purified virus at a predetermined multiplicity of infection ranging from one to 10.Then, incubate the plate at 37 degrees Celsius with 5%carbon dioxide. Monitor the plates to record difference in the GFP signals at regular intervals for one to seven days. Look for GFP positive cells under fluorescent microscope fitted with GFP filter set with excitation and emission wavelengths at 470 and 525 nanometers respectively.To differentiate between the population of GFP positive and negative cells, use untransduced cells. A representative agarose gel showing the positive mutated integrase clone. The double-digested clone with restriction enzymes EcoRV and SPH1 in red-dashed box represents the mutated integrase clone.The clone was further sequenced to check the mutation of aspartic acid at position 64 to glutamic acid. A representative bar graph for p24 ELISA assay has been shown depicting the viral titers for SP1-integrase-deficient lentiviral vector CRISPR/Cas9 plotted in the black bar and SP1-integration-competent lentiviral vectors CRISPR/Cas9 plotted in the white bar. The bar graph shows integrase-deficient and competent viral titers in the range of one times 10 to the 10.The bar plots represent the copy number of viral particles per milliliter. Representative fluorescent images showing the mean fluorescent intensity of GFP positive cells under viral treatment. The cells were transduced with integration-competent lentiviral vectors CRISPR or integrase-deficient lentiviral vector CRISPR viral components.A sharp reduction in GFP signal was observed at multiplicity of infection one and five respectively after transducing the integrase-competent or deficient lentiviral components with respect to the untransduced control cells. The main advantage of this technique stem from the ability of integrase-deficient lentiviral vectors to a deliver genome editing tool transiently which significantly enhance its specificity and the safety. If properly conducted, the protocols should take one week to complete.Conducting this protocol, one should expect to generate highly-concentrated lentiviral vectors in the range of 10 to the nine, 10 to the 10 viral genome parameter.

Research

JoVE Journal

Genetics

Using a Fluorescent PCR-capillary Gel Electrophoresis Technique to Genotype CRISPR/Cas9-mediated Knockout Mutants in a High-throughput Format

Mit Hilfe eines Fluoreszenz-PCR-Kapillar-Gel-Elektrophorese-Technik CRISPR zum Genotyp / Cas9 vermittelte Knock-out Mutanten in einem Hochdurchsatz-Format

The development of programmable genome-editing tools has facilitated the use of reverse genetics to understand the roles specific genomic sequences play ...

Forschung

Genetik

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

Selektionsabhängige und unabhängige Erzeugung von CRISPR / Cas9-vermittelten Gen-Knockouts in Säugetierzellen

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

A Universal Protocol for Large-scale gRNA Library Production from any DNA Source

Ein universelles Protokoll für groß angelegte gRNA Bibliothek Produktion aus jeder DNA-Quelle

The popularity of the CRISPR/Cas9 system for both genome and epigenome engineering stems from its simplicity and adaptability. An effector (the Cas9 ...

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-vermittelten gezielte Integration In Vivo mit einer Homologie-vermittelte Ende verbinden-basierte Strategie

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Effiziente Produktion und Kennzeichnung der CRISPR/Cas9 generiert gen Knockouts im Modellsystem Danio rerio

Characterization of the clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system of Streptococcus pyogenes has enabled the development ...

Production and Purification of Baculovirus for Gene Therapy Application

Herstellung und Reinigung des Baculovirus für Gentherapie Anwendung

Baculovirus has traditionally been used for the production of recombinant protein and vaccine. However, more recently, baculovirus is emerging as a ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Hocheffiziente gen Störung der murinen und menschlichen hämatopoetischen Vorläuferzellen von CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

Lentiviral Mediated Production of Transgenic Mice: A Simple and Highly Efficient Method for Direct Study of Founders

Lentivirale vermittelte Produktion von transgenen Mäusen: eine einfache und hocheffiziente Methode für die direkte Untersuchung der Gründer

For almost 40 years, pronuclear DNA injection represents the standard method to generate transgenic mice with random integration of transgenes. Such a ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

Hochdurchsatz-Identifizierung des Gens regulatorischen Sequenzen mit Next-Generation Sequenzierung der kreisförmigen Chromosom Konformation erfassen (4C-Seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

In vivo Application of the REMOTE-control System for the Manipulation of Endogenous Gene Expression

In-vivo Anwendung der REMOTE-Steuerung für die Manipulation von endogenen Genexpression

Here we describe a protocol for implementing the REMOTE-control system (Reversible Manipulation of Transcription at Endogenous loci), which allows for ...