Name: a protocol for the production of integrase-deficient lentiviral vectors for crispr/cas9-mediated gene knockout in dividing cells
Uploaded: 2017-12-12T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells at JoVE.com

Nos gustaría agradecer al Departamento de Neurobiología, Duke University School of Medicine y del Decanato de ciencias básicas, Universidad de Duke. También agradecemos a los miembros de la base de Vector Viral de duque para comentarios sobre el manuscrito. Plásmido pLenti CRISPRv2 fue regalo Feng Zhang (Broad Institute). El sistema LV-packaging incluyendo el psPAX2 de plásmidos, VSV-G, pMD2.G y pRSV-Rev fue un amable regalo de Didier Trono (EPFL, Suiza). Apoyo financiero para este trabajo fue proporcionado por la Universidad de Carolina del sur Facultad de medicina, conceder RDF18080-E202 (B.K).

1. cultivo de células HEK-293T y siembra para transfección
Nota: Riñón embrionario humano 293T (HEK-293T) las células son cultivadas en DMEM, medios de comunicación de alta glucosa suplementado con suero de ternera 10% suplementado con promotores de crecimiento y hierro y solución de antibiótico-antimicótico 1 x (100 x solución contiene penicilina unidades 10.000 estreptomicina 10 mg y 25 μg de anfotericina B por mL). Los medios de comunicación también se complementa con piruvato de...

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IDLVs han comenzado a emerger como el vehículo de elección en vivo gene-la edición, especialmente en el contexto de enfermedades genéticas, debido en gran parte al bajo riesgo de mutagénesis asociado con estos vectores respecto a la integración de las plataformas de entrega22 , 28. en el manuscrito actual, intentamos detallar el protocolo asociado con la producción del todo-en-uno IDLV-CRISPR/Cas9 sistema mejorado que se desarrolló recientemente ...

Edición precisa gen constituye la piedra angular de los avances biomédicos importantes que implican el desarrollo de nuevas estrategias para hacer frente a enfermedades genéticas. En la vanguardia de las tecnologías de edición de gene es el método apoyándose en el uso de la clustered regularly -nterspaced short palindromic repeats (CRISPR) / sistema de Cas9 que inicialmente fue identificado como un componente de inmunidad bacteriana contra la invasión de material genético viral (revisado en las referencias1,2). Una ventaja importante del sistema CRISPR/Cas9 sobre otras herramientas de edición de gen, como nucleasas de dedos de zinc (ZFNs) y nucleasas de efectores como activador de transcripción (TALENs) (revisadas en la referencia3), es la relativa simplicidad del diseño de plásmido y construcción de componentes CRISPR — una característica que ha impulsado la expansión de la edición de genes de unos laboratorios especializados a una comunidad de investigación mucho más amplia. Además, la sencillez de programación CRISPR/Cas9 y su capacidad de reconocimiento de destino multiplexado más han alimentado su popularidad como una tecnología rentable y fácil de usar. Entre los diversos métodos disponibles para los investigadores entregar dichos componentes de edición de gen a las células, vectores virales siguen siendo por lejos el sistema más popular y eficiente.
Vectores lentivirales (LVs) han surgido como el vehículo de elección para entregar los componentes de CRISPR/Cas9 sistema en vivo para diversas aplicaciones4,5,6,7. Varias características claves hacen LVs una opción popular para este proceso, incluyendo su capacidad para infectar células divisorias y no dividir, inmunogenicidad baja y mínima toxicidad celular (revisado en la referencia8). Como resultado, la terapia génica mediada por LV se ha empleado en tratamientos de enfermedades infecciosas, como VIH-1 y HBV HSV-1, así como en la corrección de los defectos subyacentes humanas enfermedades hereditarias, como fibrosis quística y degeneración macular neo-vascular 4 , 5 , 7 , 9 , 10 , 11. Además, LVs han sido efectivamente modificados para realizar edición de multiplex gen en distintos lugares geométricos genomic usando un vector único sistema12.
Sin embargo, la propiedad inherente de LVs para integrar en el genoma del anfitrión puede ser mutagénica y desventajas a menudo su utilidad como transgen vehículos de entrega, especialmente en contextos clínicos. Por otra parte, puesto que LVs estable integrado expresan sus transgenes sosteniblemente altos niveles, este sistema es inadecuados para la entrega de los componentes gene-edición como CRISPR/Cas9; sobreexpresión de Cas9-guía RNA (gRNA) y proteínas similares como ZFNs, están asociados con niveles elevados de efectos off-target, que incluyen mutaciones indeseables13,14,15,16 , 17 y potencialmente puede aumentar la citotoxicidad18. Por lo tanto, para lograr precisa edición de genes con efectos mínimos de fuera de objetivo, es imperativo el diseño de sistemas que permiten la expresión transitoria del gen editar componentes.
En los últimos años, han desarrollado una variedad de plataformas para expresar transitoriamente CRISPR/Cas9 de las células16,19,20,21 (revisado en la referencia22). Estos incluyen métodos que dependen directamente introducir Cas9 purificada junto con las guía apropiada RNAs en las células, que mostró ser más eficaz en el objetivo gene-edición en comparación con la transfección mediada por plásmido16. Los estudios han demostrado eso ribonucleoproteína (RNP) guían de complejos de RNA/Cas9 partículas rápidamente turned over después de mediar el clivaje de ADN en sus objetivos, lo que sugiere que la expresión a corto plazo de estos componentes es suficiente para lograr gene robusto edición16. Concebible, no integrando plataformas de vector viral como vectores virales adeno-asociado (AAVs) pueden proporcionar una alternativa viable para ofrecer maquinaria edición de genes a las células. Desafortunadamente, cápsida AAV posee menor capacidad de envasado de LVs (< 5kb), que dificulta seriamente su capacidad para empaquetar el toolkit CRISPR varios componente dentro de un único vector (revisado en la referencia8). Cabe destacar que además de compuestos que inhiben la histona desacetilasas (p. ej., sodio butirato23) o impedir el ciclo de la célula (por ejemplo, cafeína24) han demostrado aumentar títulos lentivirales. A pesar del progreso reciente, los sistemas de expresión transitoria desarrollados hasta ahora son aún obstaculizados por varias deficiencias, como la baja eficiencia de la producción, que conducen a títulos virales reducción y eficiencia de transducción de la baja de los virus generados a través de tales enfoques25.
Integrasa-deficientes vectores lentivirales (IDLVs) representan un gran avance en el desarrollo de vectores de genes, ya que la capacidad de envasado de LVs con la ventaja añadida de AAV-como mantenimiento episomal en las células. Estas características ayudan a IDLVs en gran medida evadir los problemas principales asociados con integración de vectores, sobreexpresión continua vis-á-vis de potencialmente genotóxicos elementos y mutagenicidad mediada por la integración. Se demostró previamente que IDLVs pueden ser modificadas con éxito para mejorar la expresión de gene episomal26,27. Con respecto a la entrega mediada por IDLV CRISPR/Cas9, títulos de baja producción y menor expresión de los genomas episome transmitidas en relación con sistemas lentivirales integrasa dominio limita su utilidad como herramientas de bona fide para la entrega de la edición del genoma construcciones transgénicas. Recientemente hemos demostrado que la expresión del transgen y títulos virales asociados con la producción de IDLV son mejorados significativamente por la inclusión de sitios para el factor de transcripción Sp1 dentro de la expresión viral cassette28de Unión. Las IDLVs modificadas sólidamente apoyado CRISPR-mediated gene edición en vitro (en células HEK-293T) tanto en vivo (en las neuronas del cerebro del poste-mitotic), mientras que la inducción de mutaciones de objetivo mínimo en comparación con la correspondiente ICLV-mediada sistemas28. En general, hemos desarrollado una novela, toolkit CRISPR compacto, todo-en-uno había llevado en una plataforma IDLV y había descrito las ventajas de la utilización de un vehículo de entrega para la edición de genética mejorada.
Aquí, el protocolo de producción del sistema IDLV-CRISPR/Cas9 se describe, incluyendo los distintos pasos involucrados en la Asamblea, purificación, concentración y valoración de IDLVs, así como estrategias para validar la eficacia de edición génica de estos vectores. Este protocolo es fácilmente escalable para satisfacer las necesidades de los diferentes investigadores y está diseñado para generar con éxito vectores del LV con los títulos en el rango de 1 x 1010 transducing unidades (TU) / mL. Los vectores generados a través de este protocolo pueden ser utilizados para infectar eficientemente varios diferentes tipos de células, incluso difícil de transducir las células madre embrionarias, las células hematopoyéticas (las células T y macrófagos) y cultivadas y en vivo- neuronas inyectadas. Además, el protocolo es igualmente adecuado para la producción de vectores lentivirales integrasa competente en cantidades similares.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56915/56915fig1.jpg"> Figura 1: embalaje de IDLV. (a) diagrama esquemático del tipo salvaje integrasa proteína (b) el plásmido modificado fue derivado de psPAX2 (vea métodos, construcción de plásmidos para más detalles). Imagen de gel agarosa representante de clones para clones mutados integrasa. Se analizaron muestras de ADN preparadas con el equipo Mini de aislamiento estándar plásmido ADN por digestión con EcoRV y SphI. El clon correctamente digeridos (número 5, caja roja discontinua) más se verificó por la secuencia directa (Sanger) para la sustitución de D64E en INT. El casete de la integrasa-deficiente embalaje fue nombrado pBK43. (c) esquema del Protocolo de la transfección transitoria empleada para generar vectores IDLV-CRISPR/Cas9, mostrando las células 293T transfectadas con VSV-G, embalaje y cintas de transgenes (Sp1-CRISPR/Cas9 plásmido de all-in-one). Partículas virales que bud hacia fuera de la membrana de la célula contienen el RNA integral del vector (expresado del cassette de transgen). Se utilizó la segunda generación del sistema IDLV-embalaje, que incluye las proteínas reguladoras Tat y expresión de Reverendo Rev además se complementa de un cassette independiente (RSV-REV-plásmido). Abreviatura: virus de estomatitis vesicular de repetición, VSV-G, LTR-largo-terminal G proteína, promotor de citomegalovirus pCMV; Promotor de Rous sarcoma virus (RSV); RRE-(elemento de respuesta Rev). Otros elementos regulatorios en los cassettes de expresión incluyen sitios de unión de Sp1, elemento de la Rev Response (RRE), marmota Hepatitis Virus postranscripcional regulador elemento (WPRE), núcleo-alargamiento factor 1α promotora (EFS-NC), el paquete del vector elemento ψ (psi), promotor de citomegalovirus (hCMV) humano y humano promotor U6. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56915/56915fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima XPN-80 Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A99839</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allegra 25R tabletop centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>369434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xMark Microplate Absorbance plate reader</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1681150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACS</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>338960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted fluorescence microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DM IRB2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45-&#956;m filter unit, 500mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430773</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical bottom ultracentrifugation tubes</td>
			<td>Seton Scientific</td>
			<td>5067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tube adapters</td>
			<td>Seton Scientific</td>
			<td>PN 4230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW32Ti swinging-bucket rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>369650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-binding 96-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3366</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 mm TC-Treated Cell Culture dishes with 20 mm Grid</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100mm TC-Treated Culture Dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;M filter unit, 1L</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit (50)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture pipettes, 5 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture pipettes, 10 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture pipettes, 25 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4489</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer with cover slips</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>UX-79001-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human embryonic kidney 293T (HEK 293T) cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>293FT cells</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R70007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cosmic Calf Serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30087.04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-antimycotic solution, 100X</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A5955-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S8636-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Essential Amino Acid (NEAA)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30087.04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 media</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11875-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA 0.05%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BES (N, N-bis (2-hydroxyethyl)-2-amino-ethanesulfonic acid)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B9879 - BES</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G1800-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p24 ELISA reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal anti-p24 antibody</td>
			<td>NIH AIDS Research and Reference Reagent Program</td>
			<td>3537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIV-1 standards</td>
			<td>NIH AIDS Research and Reference Reagent Program</td>
			<td>SP968F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal rabbit anti-p24 antibody</td>
			<td>NIH AIDS Research and Reference Reagent Program</td>
			<td>SP451T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit horseradish peroxidase IgG</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>12-348</td>
			<td>Working concentration 1:1500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal mouse serum, Sterile, 500mL</td>
			<td>Equitech-Bio</td>
			<td>SM30-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum, Sterile, 10mL</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9023</td>
			<td>Working concentration 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMB peroxidase substrate</td>
			<td>KPL</td>
			<td>5120-0076</td>
			<td>Working concentration 1:10,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>psPAX2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMD2.G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRSV-Rev</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lentiCRISPR v2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>52961</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restriction enzymes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BsrGI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0575S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BsmBI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0580S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRV</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0195S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KpnI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0142S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PacI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0547S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SphI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0182S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a protocol for the production of integrase-deficient lentiviral vectors for crispr/cas9-mediated gene knockout in dividing cells

Vectores lentivirales son una opción ideal para la entrega de componentes de edición de genes a las células debido a su capacidad para estable transducción de una amplia gama de células y mediadores altos niveles de expresión génica. Sin embargo, su capacidad para integrarse en el genoma de la célula huésped aumenta el riesgo de mutagénesis de insertional plantea preocupaciones de seguridad y limita su uso en contextos clínicos. Además, la expresión persistente de los componentes gene-edición había entregada por estos aumentos de vectores lentivirales integración competente (ICLVs) la probabilidad de promiscuo gene targeting. Como alternativa, se ha desarrollado una nueva generación de vectores lentivirales integrasa deficientes (IDLVs) que se ocupa de muchas de estas preocupaciones. Aquí el protocolo de producción de una plataforma IDLV nueva y mejorada para la edición de genes mediada por CRISPR y lista los pasos involucrados en la purificación y concentración de tales vectores se describe su transducción y eficacia gene-edición usando HEK-293T células fue demostrada. Este protocolo es fácilmente escalable y puede usarse para generar IDLVs de alto título que son capaces de transducción de las células in vitro y en vivo. Además, este protocolo puede ser fácilmente adaptado para la producción de ICLVs.

Validación de la eficacia de nocaut de vectores IDLV-CRISPR/Cas9 Utilizamos células 293T GFP-expresando como un modelo para validar la eficacia de knockout de genes CRISPR/Cas9-mediada. Las células GFP + fueron generadas por transducción de células HEK-293T con pLenti-GFP (vBK201a) en una MOI de 0.5 (figura 3b, el panel "no virus"). El cassette sgRNA-GFP/Cas9 todo-en-uno vector fue empaquetado en partículas IDLV o ICLV y p24</su...

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A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells

Un protocolo para la producción de vectores lentivirales integrasa deficientes para CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout en dividir las células

Describimos la estrategia de producción de vectores lentivirales integrasa deficientes (IDLVs) como vehículos para la entrega de CRISPR/Cas9 a las células. Con una capacidad para mediar la edición rápido y robusto gene en células, IDLVs actualmente un seguro y plataforma igualmente eficaz vector de genes en comparación con vectores competentes integrasa.

Lentiviral vectors are an ideal choice for delivering gene-editing components to cells due to their capacity for stably transducing a broad range of cells ...

The overall goal of this protocol is to describe the production and potential applications of optimized integrase-deficient lentiviral vectors capable of delivering CRISPR/Cas9 transgenes to cells in vivo and in vitro for rapid and efficient gene editing. CRISPR/Cas was a highly-efficient lab for gene editing manipulation. Here is a protocol outline in the production of a highly-concentrated optimized integrase-deficient lentiviral vectors for efficient delivery of CRISPR/Cas gene editing tools.The technique has proven to be very efficient in the causal cell and post-mitotic neurons. Seed the HEK-293T cells a day before the transfection so that the confluency reaches between 70 to 80%the next day. Before transfection, aspirate the old media from the culture plates and add freshly-prepared media lacking serum.In a 15-milliliter conical tube, add all the four plasmids to prepare a plasmid mix for transfecting a 15-centimeter dish. Then, add 312.5 microliters of one molar calcium chloride to the plasmid mix and adjust the volume to 1.25 milliliters with sterile double-distilled water. Keep adding drops of 2X BES buffered solution gradually while vortexing.And then, incubate the mixture at room temperature for 30 minutes. Add 2.5 milliliters of plasmid mixture in drops to each of the 15-centimeter plates. Then, gently swirl the plates and incubate at 37 degrees Celsius with 5%carbon dioxide for two to three hours.After three hours, add 2.5 milliliters of 10%serum to each plate and continue for overnight incubation. Use a 10-milliliter tissue culture pipette to carefully aspirate the supernatant from the transfected cells seeded on each culture dish. Then, pool the entire supernatant in 50-milliliter centrifuge tubes.Place the tube inside a tabletop centrifuge and start the centrifugation. Then, filter the supernatant through a 0.45-micrometer vacuum filter unit. Load the conical ultracentrifugation tubes with different sucrose concentrations to form layers with sucrose gradient.Carefully add the virus containing supernatant to the sucrose gradient. To process the entire 100-milliliter volume of viral supernatant, use six ultracentrifugation tubes in each spin. Then, balance the ultracentrifuge tubes with 1X PBS buffer and spin the samples at 70, 000 G for two hours at 17 degrees Celsius.In clean tubes, collect the 30%and 60%sucrose fractions and add cold 1X PBS buffer to adjust the volume to 100 milliliters. Mix the samples by pipetting it up and down several times. Then, add 20 to 25 milliliters of the viral solution on top of four milliliters of 20%sucrose in 1X PBS solution to prepare the sucrose cushion.Adjust the volume with sterile 1X PBS buffer if the tubes are less than 3/4 full and balance it. Then, spin the samples for two hours at 17 degrees Celsius. Then, pour the supernatant off and drain the remaining liquid by inverting the tubes on paper towels.After aspirating the last remaining droplets, a pellet containing the virus is barely visible as a translucent spot. Next, resuspend the pellet in 70 microliters of 1X PBS by thoroughly pipetting the suspension. Again, transfer the suspension to another tube and thoroughly mix to completely dissolve the pellet.Then, rinse the tube with an additional 50 microliters of cold 1X PBS buffer and mix. Keep the samples on a tabletop microcentrifuge and centrifuge at 10, 000 G for 30 seconds. After centrifugation, add 10 microliter aliquots of the supernatant to each fresh microfuge tube and store them at negative 80 degrees Celsius.Coat a high-binding 96-well plate with 100 microliters of monoclonal anti-p24 antibody at a dilution of one to 1, 500 according to NIH AIDS vaccine program for HIV-1 p24 antigen capture assay kit. Incubate the plate overnight at four degrees Celsius. The next day, wash the plate with 200 microliters of 0.05%TWEEN-20 in cold PBS three times.To avoid non-specific binding, block the plate with 200 microliters of 1%bovine serum albumin for one hour at room temperature. Then, wash the plate with 200 microliters of 0.05%TWEEN-20 in cold PBS three times. Then, prepare the concentrated and non-concentrated vector samples to a final concentration of 10%by diluting the vector with double-distilled water and Triton X-100.Next, prepare the HIV-1 standards using two-fold serial dilution starting at five nanograms per milliliter. After diluting the concentrated and non-concentrated vector samples, pipette it on the plate in triplicates and incubate at four degrees Celsius overnight. The next day, wash the plate, then add 100 microliters of polyclonal rabbit anti-p24 antibody on each plate and incubate at 37 degrees Celsius for four hours.After six washes, incubate the plate with goat anti-rabbit horseradish peroxidase at 37 degrees Celsius for one hour. After multiple washing, incubate the plate with TMB peroxidase substrate at room temperature for 15 minutes. Add one normal hydrochloric acid to stop the reaction.And read the absorbance at 450 nanometers with an absorbance plate reader. Seed the cells in a six-well plate. Next day, when the cells reach 90%confluency, transduce with purified virus at a predetermined multiplicity of infection ranging from one to 10.Then, incubate the plate at 37 degrees Celsius with 5%carbon dioxide. Monitor the plates to record difference in the GFP signals at regular intervals for one to seven days. Look for GFP positive cells under fluorescent microscope fitted with GFP filter set with excitation and emission wavelengths at 470 and 525 nanometers respectively.To differentiate between the population of GFP positive and negative cells, use untransduced cells. A representative agarose gel showing the positive mutated integrase clone. The double-digested clone with restriction enzymes EcoRV and SPH1 in red-dashed box represents the mutated integrase clone.The clone was further sequenced to check the mutation of aspartic acid at position 64 to glutamic acid. A representative bar graph for p24 ELISA assay has been shown depicting the viral titers for SP1-integrase-deficient lentiviral vector CRISPR/Cas9 plotted in the black bar and SP1-integration-competent lentiviral vectors CRISPR/Cas9 plotted in the white bar. The bar graph shows integrase-deficient and competent viral titers in the range of one times 10 to the 10.The bar plots represent the copy number of viral particles per milliliter. Representative fluorescent images showing the mean fluorescent intensity of GFP positive cells under viral treatment. The cells were transduced with integration-competent lentiviral vectors CRISPR or integrase-deficient lentiviral vector CRISPR viral components.A sharp reduction in GFP signal was observed at multiplicity of infection one and five respectively after transducing the integrase-competent or deficient lentiviral components with respect to the untransduced control cells. The main advantage of this technique stem from the ability of integrase-deficient lentiviral vectors to a deliver genome editing tool transiently which significantly enhance its specificity and the safety. If properly conducted, the protocols should take one week to complete.Conducting this protocol, one should expect to generate highly-concentrated lentiviral vectors in the range of 10 to the nine, 10 to the 10 viral genome parameter.

Research

JoVE Journal

Genetics

Using a Fluorescent PCR-capillary Gel Electrophoresis Technique to Genotype CRISPR/Cas9-mediated Knockout Mutants in a High-throughput Format

Usando una técnica fluorescente PCR-capilar Electroforesis en gel con el genotipo CRISPR / Cas9 mediada Knockout mutantes en un formato de alto rendimiento

The development of programmable genome-editing tools has facilitated the use of reverse genetics to understand the roles specific genomic sequences play ...

Investigación

Genética

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

Generación dependiente de la selección y independiente de CRISPR / Cas9-mediada Gene Knockouts en células de mamíferos

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

A Universal Protocol for Large-scale gRNA Library Production from any DNA Source

Un protocolo Universal para la gRNA a gran escala de producción de la biblioteca de cualquier fuente de ADN

The popularity of the CRISPR/Cas9 system for both genome and epigenome engineering stems from its simplicity and adaptability. An effector (the Cas9 ...

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

Integración dirigida CRISPR/Cas9-mediada In Vivo mediante una estrategia basada en unirse a final mediada por homología

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Producción eficiente y genera identificación de CRISPR/Cas9 Gene Knockouts en el sistema modelo Danio rerio

Characterization of the clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system of Streptococcus pyogenes has enabled the development ...

Production and Purification of Baculovirus for Gene Therapy Application

Producción y purificación de Baculovirus para la aplicación de la terapia génica

Baculovirus has traditionally been used for the production of recombinant protein and vaccine. However, more recently, baculovirus is emerging as a ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Interrupción génica altamente eficiente de las células progenitoras hematopoyéticas murinas y humanas por CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

Lentiviral Mediated Production of Transgenic Mice: A Simple and Highly Efficient Method for Direct Study of Founders

Lentivirales mediación producción de ratones transgénicos: un método Simple y altamente eficiente para el estudio directo de los fundadores

For almost 40 years, pronuclear DNA injection represents the standard method to generate transgenic mice with random integration of transgenes. Such a ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

Captura de alto rendimiento identificación de secuencias reguladoras de genes utilizando secuenciación de próxima generación de conformación Circular cromosoma (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

In vivo Application of the REMOTE-control System for the Manipulation of Endogenous Gene Expression

Aplicación in vivo del sistema de control remoto para la manipulación de genes endógenos

Here we describe a protocol for implementing the REMOTE-control system (Reversible Manipulation of Transcription at Endogenous loci), which allows for ...