Name: zika virus infection of cultured human fetal brain neural stem cells for immunocytochemical analysis
Uploaded: 2018-02-05T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Zika Virus Infection of Cultured Human Fetal Brain Neural Stem Cells for Immunocytochemical Analysis at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av midler fra John S. Dunn Foundation og Institutt for menneskelige infeksjoner og immunitet av University of Texas Medical Branch (pw).

Menneskelige embryonale stamceller var opprinnelig avledet fra forkastet menneskelige føtal cortexes i den første trimester12. Alle protokollen prosedyrer overholder University of Texas Medical Branch etiske retningslinjene for bruk av menneskelige, og cellen linjene ble godkjent av institusjonelle Biosafety utvalget.
1. lager medium forberedelse og stamcelleforskningen utvinning
<ol><li>Forberede kultur medium lager (DFHGPS) ved å kombinere reagenser i trinn 1.1.1...

<ol>
	<li>Centers for Disease Control and Prevention. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> All countries and territories with active Zika virus transmisson. , (2016).</li><li>Brasil, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+Virus+Infection+in+Pregnant+Women+in+Rio+de+Janeiro.">Zika Virus Infection in Pregnant Women in Rio de Janeiro.</a> N Engl J Med. 375 (24), 2321-2334 (2016).</li><li>Hills, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmission+of+Zika+Virus+Through+Sexual+Contact+with+Travelers+to+Areas+of+Ongoing+Transmission+-+Continental+United+States,+2016.">Transmission of Zika Virus Through Sexual Contact with Travelers to Areas of Ongoing Transmission - Continental United States, 2016.</a> MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 65 (8), 215-216 (2016).</li><li>Centers for Disease Control and Prevention. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Facts about microcephaly. , (2016).</li><li>Garcez, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus+impairs+growth+in+human+neurospheres+and+brain+organoids.">Zika virus impairs growth in human neurospheres and brain organoids.</a> Science. 352 (6287), 816-818 (2016).</li><li>Li, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+Virus+Disrupts+Neural+Progenitor+Development+and+Leads+to+Microcephaly+in+Mice.">Zika Virus Disrupts Neural Progenitor Development and Leads to Microcephaly in Mice.</a> Cell Stem Cell. 19 (5), 672 (2016).</li><li>Tang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+Virus+Infects+Human+Cortical+Neural+Progenitors+and+Attenuates+Their+Growth.">Zika Virus Infects Human Cortical Neural Progenitors and Attenuates Their Growth.</a> Cell Stem Cell. 18 (5), 587-590 (2016).</li><li>Wu, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vertical+transmission+of+Zika+virus+targeting+the+radial+glial+cells+affects+cortex+development+of+offspring+mice.">Vertical transmission of Zika virus targeting the radial glial cells affects cortex development of offspring mice.</a> Cell Res. 26 (6), 645-654 (2016).</li><li>Jensen, J. B., Parmar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strengths+and+limitations+of+the+neurosphere+culture+system.">Strengths and limitations of the neurosphere culture system.</a> Mol Neurobiol. 34 (3), 153-161 (2006).</li><li>Wu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Region-specific+generation+of+cholinergic+neurons+from+fetal+human+neural+stem+cells+grafted+in+adult+rat.">Region-specific generation of cholinergic neurons from fetal human neural stem cells grafted in adult rat.</a> Nat Neurosci. 5 (12), 1271-1278 (2002).</li><li>McGrath, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+Responses+of+Human+Fetal+Brain+Neural+Stem+Cells+to+Zika+Virus+Infection.">Differential Responses of Human Fetal Brain Neural Stem Cells to Zika Virus Infection.</a> Stem Cell Reports. 8 (3), 715-727 (2017).</li><li>Svendsen, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+the+rapid+and+long+term+growth+of+human+neural+precursor+cells.">A new method for the rapid and long term growth of human neural precursor cells.</a> J Neurosci Methods. 85 (2), 141-152 (1998).</li><li>Tarasenko, Y. I., Yu, Y., Jordan, P. M., Bottenstein, J., Wu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+growth+factors+on+proliferation+and+phenotypic+differentiation+of+human+fetal+neural+stem+cells.">Effect of growth factors on proliferation and phenotypic differentiation of human fetal neural stem cells.</a> J Neurosci Res. 78 (5), 625-636 (2004).</li><li>Barrows, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Screen+of+FDA-Approved+Drugs+for+Inhibitors+of+Zika+Virus+Infection.">A Screen of FDA-Approved Drugs for Inhibitors of Zika Virus Infection.</a> Cell Host Microbe. 20 (2), 259-270 (2016).</li><li>Jakel, R. J., Schneider, B. L., Svendsen, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+human+neural+stem+cells+to+model+neurological+disease.">Using human neural stem cells to model neurological disease.</a> Nat Rev Genet. 5 (2), 136-144 (2004).</li><li>Lopez-Garcia, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+stretch-induced+neurotrauma+model+for+medium-throughput+screening+in+vitro:+identification+of+rifampicin+as+a+neuroprotectant.">Development of a stretch-induced neurotrauma model for medium-throughput screening in vitro: identification of rifampicin as a neuroprotectant.</a> Br J Pharmacol. , (2016).</li><li>Mich, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+identification+of+functionally+distinct+stem+cells+and+neurosphere-initiating+cells+in+adult+mouse+forebrain.">Prospective identification of functionally distinct stem cells and neurosphere-initiating cells in adult mouse forebrain.</a> Elife. 3, e02669 (2014).</li></ol>

Kultur og manipulere hNSCs gir et kritisk verktøy som kan brukes til en rekke formål fra modellering menneskelig sykdom til høy gjennomstrømning narkotikarelaterte screening10,11,12,14, 15,16,17. Mange spørsmål gjensto å bli behandlet som hvordan menneskelige fosterets hjerne NSCs el...

Zika virus (ZIKV) er en flavivirus overføres seksuelt, eller av mygg vektorer Aedes aegypti og Aedes albopictus myggen. ZIKV nylig ble oppdaget som en alvorlig folkehelsen trussel på grunn av sin brukervennlighet overføring og tilknyttet nevrologiske symptomer1. En av mest om nevrologiske effekter er utviklingen av microcephaly i fostre født infiserte graviditet2,3. Microcephaly er en neurodevelopmental lidelser der hodet er mindre enn vanlig størrelse under fosterutvikling og fødsel omkretsen mindre enn 2 standardavvik under mener4. Den mindre hodeomkrets er vanligvis ledsaget av en rekke samtidige som utviklingsmessige forsinkelser, beslag, visjon og hørselstap og fôring problemer.
Nyere studier har brukt dyremodeller eller indusert pluripotent stamceller å studere effekten av ZIKV på neurodevelopment5,6,7,8. Mens disse studiene har bidratt til vår kunnskap om ZIKV, bruk av ulike arter eller genmodifiserte celler kan være tidkrevende og/eller legge til flere variabler som kan forvirre effekten av ZIKV på celler utvikling av neural5, 6 , 7 , 8. problemer med hNSC kultur, særlig ikke-tilhenger neurosphere kulturen beskrevet i denne protokollen, er imidlertid at kulturen er svært følsomme for metodene som brukes til å gjennomføre kultur9. Endringer i mellomstore komponenter eller selv den fysiske håndteringen av kultur fartøyet, er nok til å lokke fram en reaksjon fra celler9. For å løse disse problemene, utviklet vi en i vitro menneskelige fosterets hjerne-avledet nevrale stamceller (hNSCs) kultur for å avhøre mechanistically effekten av ZIKV på fetal nevrale stamceller. Bruke våre metoden ble hNSCs opprettholdt for over 80 passasjer uten tilsynelatende fenotypiske endringer10. Videre chromosomal endringer som trisomy var enten ingen eller minimal11. HNSC kultur vokser som en ikke-tilhenger neurosphere kultur. En fordel med neurospheres er at kulene opprette en unik miljømessige nisje i kultur som er mer reflektert i vivo nisjer i forhold til todimensjonal kulturer9. En annen fordel med denne protokollen er at flere celletyper kan utledes fra hNSC kultur, slik at en etterforsker å observere virkningen av en gitt variabel hNSC overlevelse og differensiering. Denne protokollen gjelder personer ute for å svare mekanistisk spørsmål angående sentralnervesystemet utvikling eller dysfunksjon. Følgende protokollen beskriver hvordan å utvide en hNSC kultur for å infisere med ZIKV, og deretter skille hNSCs å observere virkningen av infeksjon på differensiering prosessen. Det inkluderer også lagre hNSCs for langsiktig bruk, og å skille hNSCs i ulike typer nerveceller som tillate ytterligere undersøkelse av ZIKV-indusert underskudd bidra til hjernen misdannelse11. Vi tror denne protokollen er også av interesse for etterforskere søker å forstå virkningen av eventuelle miljømessige stimulans som infeksjon eller giftstoffer på nevrale stamceller overlevelse og differensiering.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11765-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose (10%)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1M)</td>
			<td>Corning/cellgro</td>
			<td>25-060-c1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen Strep (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I4011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transferrin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T2036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progesterone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Putrescine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium selenite</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin Sigma</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>basic fibroblast growth factor</td>
			<td>R&#38;D system</td>
			<td>233-FB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>epidermal growth factor</td>
			<td>R&#38;D system</td>
			<td>236-EG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>leukemia inhibitory factor</td>
			<td>R&#38;D system</td>
			<td>7734-LF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>23017-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5% trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15090-046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin inhibitor</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine hydrobromide(PDL)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6407-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 supplement</td>
			<td>Gibco/Invitrogen</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline</td>
			<td>Corning/cellgro</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4378-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Lab</td>
			<td>005-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>FisherBiotech</td>
			<td>BP151-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nestin antibody</td>
			<td>BD Transduction Laboratories</td>
			<td>611659</td>
			<td>1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Class III beta-tubulin antibody (TuJ1)</td>
			<td>Covnce</td>
			<td>MMS-435p</td>
			<td>1:2000 dulution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFAP antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB5804</td>
			<td>1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>D1306</td>
			<td>1:2000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZIKV antibody</td>
			<td>World Reference Collection for Emerging Viruses and Arboviruses at the University of Texas Medical Branch</td>
			<td></td>
			<td>1:2000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount G</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Forma</td>
			<td>Model# 3110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo fisher Scientific</td>
			<td>75004221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological safety cabinet</td>
			<td>Forma scientific Claas II A/B3</td>
			<td>Model# 1284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer (-80 &#176;C)</td>
			<td>Forma scientific,Inc</td>
			<td>model# 8516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope(phase contrast image)</td>
			<td>Hp 2230 workstation</td>
			<td>Product#NOE25us#ABA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope (epifluorescent image)</td>
			<td>Nikon Eclipse 80i</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope</td>
			<td>Nikon TE2000-E microscope with C1si confocal system</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

zika virus infection of cultured human fetal brain neural stem cells for immunocytochemical analysis

Menneskelige fosterets hjerne nevrale stamceller er en unik ikke-genmodifisert modell-system for å studere virkningen av ulike stimuli på menneskelig utviklingsmessige nevrobiologi. Heller enn å bruke en dyremodell eller genmodifiserte indusert pluripotent celler, gir menneskelige embryonale stamceller en effektiv i vitro system for å undersøke effektene av behandlinger, skjermen narkotika, eller undersøke individuelle forskjeller. Her gir vi detaljerte protokollene for metoder brukes til å utvide menneskelige fosterets hjerne nevrale stamceller i kultur med serum-frie medier, å skille seg ut forskjellige nevrale subtyper og astrocyttene via forskjellige grunning prosedyrer, og å fryse og gjenopprette disse cellene. I tillegg beskriver vi en prosedyren for bruk av menneskelige fosterets hjerne nevrale stamceller Zika virusinfeksjon.

Kultivert hNSCs i deres proliferativ fase vil vokse som ikke-tilhenger neurospheres (figur 1). Umiddelbart etter hNSC passering, vil det være mange individuelle celler som vil samle og begynne skjemaet kuler i de neste dagene (figur 1A og 1B). Sunn kuler bør være ca 1-2 mm i diameter 9-10 dager etter et avsnitt (figur 1 c). Kuler som vokse større enn 2 mm vil utvikle en mørk sen...

Watch this Scientific Journal Video about Zika Virus Infection of Cultured Human Fetal Brain Neural Stem Cells for Immunocytochemical Analysis at JoVE.com

Zika Virus Infection of Cultured Human Fetal Brain Neural Stem Cells for Immunocytochemical Analysis

Denne artikkelen omhandler metodene som brukes til å utvide menneskelige fosterets hjerne nevrale stamceller i kultur, samt hvordan å skille dem i ulike neuronal subtyper og astrocyttene, med hovedvekt på bruk av nevrale stamceller å studere Zika virusinfeksjon.

Zika smitte av kultivert menneskelig fosterets hjerne nevrale stamceller for Immunocytochemical analyse

Human fetal brain neural stem cells are a unique non-genetically modified model system to study the impact of various stimuli on human developmental ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

Isolasjon og Kvantitativ immunocytokjemisk Karakterisering av Primære myogenic celler og fibroblaster fra Menneskelig Skeletal Muscle

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

Direct Induction of Human Neural Stem Cells from Peripheral Blood Hematopoietic Progenitor Cells

Direkte Induction of Human Neural stamceller fra perifert blod Hematopoietiske stamceller

Human disease specific neuronal cultures are essential for generating in vitro models for human neurological diseases. However, the lack of access to ...

Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research

Dyrking Menneskelig Pluripotent og Neural stamceller i et lukket cellekultur System for Basic og Preklinisk Forskning

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety ...

Isolation and Characterization of Mesenchymal Stromal Cells from Human Umbilical Cord and Fetal Placenta

Isolering og karakterisering av Mesenchymale stromale celler fra human navlestreng og Fetal Placenta

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Beregningsorientert analyse av Caenorhabditis elegans Germline å studere distribusjon av kjerner, proteiner og Cytoskeleton

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

Effektiv differensiering av Human Pluripotent stamceller i leverceller

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

I Vitro generasjon av Somite derivater fra menneske indusert stamceller Pluripotent

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Controlled Cortical Impact Model of Mouse Brain Injury with Therapeutic Transplantation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neural Cells

Kontrollert kortikale Impact modell av mus hjerneskade med terapeutisk transplantasjon av Human indusert pluripotent Stem Cell-avledet nevrale celler

Traumatic brain injury (TBI) is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Disease pathology due to TBI progresses from the primary mechanical ...

Generation of Induced Neural Stem Cells from Peripheral Mononuclear Cells and Differentiation Toward Dopaminergic Neuron Precursors for Transplantation Studies

Generering av indusert nevrale stamceller fra perifere mononukleære celler og differensiering mot Dopaminerg Nevron forløpere for transplantasjon Studies

Parkinson&#39;s disease (PD) is caused by degeneration of dopaminergic (DA) neurons at the substantia nigra pars compacta (SNpc) in the ventral ...

Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells

Effektiv neural differensiering bruker single-Cell kultur av Human embryonale stamceller

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular ...