Name: high-resolution volume imaging of neurons by the use of fluorescence exclusion method and dedicated microfluidic devices
Uploaded: 2018-03-26T12:30:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-resolution Volume Imaging of Neurons by the Use of Fluorescence eXclusion Method and Dedicated Microfluidic Devices at JoVE.com

De auteurs willen erkennen ChiLab, materialen en Microsystems laboratorium - Politecnico di Torino - DISAT, in de persoon van Prof. C F Pirri, Dr. M Cocuzza en Dr. S L Marasso, voor hun waardevolle hulp bij de procesontwikkeling en fabricage van het apparaat. Wij danken Victor Racine van Quantacell voor discussie en ondersteuning in de beeldverwerking. Wij zijn dankbaar aan Isabelle Grandjean en Manon Chartier uit het dier faciliteit van het Institut Curie voor hun steun voor muizen, en Pablo Vargas en Ana-Maria Lennon (Institut Curie) voor het verstrekken van ons met de LifeAct van GFP-muizen. We zijn dankbaar Olivier Thouvenin uit Institut Langevin en Clotilde Cadart, Larisa Venkova en Matthieu Piel van het Institut Curie - UMR 144, voor hun hulp bij het begrijpen van de fluorescentie uitsluiting methode. Tot slot, wij danken het technologische platform van Institut Pierre-Gilles de Gennes (CNRS UMS 3750) voor hun steun in microfabrication. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door het Europese onderzoek Raad Advanced Grant No. 321107 "CellO," PSL Université (SwithNeuroTrails project), ANR Investissement d'Avenir, IPGG Labex en de Equipex.

<ol>
	<li>Jun, S., Taheri-Araghi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-size+maintenance:+universal+strategy+revealed.">Cell-size maintenance: universal strategy revealed.</a> Trends Microbiol. 23 (1), 4-6 (2015).</li><li>Zlotek-Zlotkiewicz, E., Monnier, S., Cappello, G., Le Berre, M., Piel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+volume+and+mass+measurements+show+that+mammalian+cells+swell+during+mitosis.">Optical volume and mass measurements show that mammalian cells swell during mitosis.</a> J. Cell Biol. 211 (4), 765-774 (2015).</li><li>Kim, G. H., Kosterin, P., Obaid, A. L., Salzberg, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mechanical+spike+accompanies+the+action+potential+in+Mammalian+nerve+terminals.">A mechanical spike accompanies the action potential in Mammalian nerve terminals.</a> Biophys J. 92 (9), 3122-3129 (2007).</li><li>Iacono, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+Hypertrophy+in+Asymptomatic+Alzheimer+Disease.">Neuronal Hypertrophy in Asymptomatic Alzheimer Disease.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 67 (6), 578-589 (2008).</li><li>Cheli, V. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+Deletion+of+the+L-Type+Calcium+Channel+Cav1.+2+in+Oligodendrocyte+Progenitor+Cells+Affects+Postnatal+Myelination+in+Mice.">Conditional Deletion of the L-Type Calcium Channel Cav1. 2 in Oligodendrocyte Progenitor Cells Affects Postnatal Myelination in Mice.</a> J Neurosci. 36 (42), 10853-10869 (2016).</li><li>Kneynsberg, A., Collier, T. J., Manfredsson, F. P., Kanaan, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+and+semi-quantitative+measurements+of+axonal+degeneration+in+tissue+and+primary+neuron+cultures.">Quantitative and semi-quantitative measurements of axonal degeneration in tissue and primary neuron cultures.</a> J Neurosci Methods. 266, 32-41 (2016).</li><li>Fouquet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+axial+resolution+in+confocal+microscopy+with+new+high+refractive+index+mounting+media.">Improving axial resolution in confocal microscopy with new high refractive index mounting media.</a> PloS one. 10 (3), (2015).</li><li>Aguet, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+dynamics+of+dividing+cells+imaged+by+lattice+light-sheet+microscopy.">Membrane dynamics of dividing cells imaged by lattice light-sheet microscopy.</a> Mol Biol Cell. 27 (22), 3418-3435 (2016).</li><li>Roland, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannabinoid-induced+actomyosin+contractility+shapes+neuronal+morphology+and+growth.">Cannabinoid-induced actomyosin contractility shapes neuronal morphology and growth.</a> eLife. 3, (2014).</li><li>Lu, Y. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viscoelastic+properties+of+individual+glial+cells+and+neurons+in+the+CNS.">Viscoelastic properties of individual glial cells and neurons in the CNS.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 103 (47), 17759-17764 (2006).</li><li>Chen, J., Xue, C., Zhao, Y., Chen, D., Wu, M. H., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+impedance+flow+cytometry+enabling+high-throughput+single-cell+electrical+property+characterization.">Microfluidic impedance flow cytometry enabling high-throughput single-cell electrical property characterization.</a> Int J Mol Sci. 16 (5), 9804-9830 (2015).</li><li>Bottier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+measurement+of+the+height+and+volume+of+migrating+cells+by+a+novel+fluorescence+microscopy+technique.">Dynamic measurement of the height and volume of migrating cells by a novel fluorescence microscopy technique.</a> Lab Chip. 11, 3855-3863 (2011).</li><li>Cadart, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+eXclusion+Measurement+of+volume+in+live+cells.">Fluorescence eXclusion Measurement of volume in live cells.</a> Methods Cell Biol. 139, 103-120 (2017).</li><li>Marasso, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+graphene+based+nanocomposite+for+application+in+3D+flexible+micro-supercapacitors.">A novel graphene based nanocomposite for application in 3D flexible micro-supercapacitors.</a> Materials Research Express. 3 (6), 065001 (2016).</li><li>Welch, C. C., Goodyear, A. L., Wahlbrink, T., Lemme, M. C., Mollenhauer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silicon+etch+process+options+for+micro-and+nanotechnology+using+inductively+coupled+plasmas.">Silicon etch process options for micro-and nanotechnology using inductively coupled plasmas.</a> Microelectronic Engineering. 83 (4), 1170-1173 (2006).</li><li>Fath, T., Ke, Y. D., Gunning, P., G&#246;tz, J., Ittner, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+support+cultures+of+hippocampal+and+substantia+nigra+neurons.">Primary support cultures of hippocampal and substantia nigra neurons.</a> Nat. Protoc. 4 (1), 78-85 (2008).</li><li>Getting intensity values from single ROI. Image Intensity Processing Available from: <a target="_blank" href="https://imagej.net/Image_Intensity_Processing">https://imagej.net/Image_Intensity_Processing</a> (2017)</li><li>19. Tools. ImageJ User Guide Available from: <a target="_blank" href="https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146-19.html">https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146-19.html</a> (2017)</li></ol>

De auteurs verklaren geen belangenconflict.

Volume beeldvorming van neuronen vormt een uitdaging voor de FXm techniek als gevolg van de lange en dunne extensies van deze cellen. Dit protocol beschrijft varianten van hetzelfde type van microfluidic apparaat gewijd aan neuron imaging.
Naast de aspecten van microfluidic ontwerp, de keuze van de doelstelling is van fundamenteel belang voor fluorescentie uitsluiting beeldvorming en impliceert een trade-off tussen laterale resolutie en de helderheid van de afbeelding. In 13 is gebleken dat een hoge nb leidt tot een diepte van de focus kleiner is dan de hoogte van de kamer niet schadelijk voor de precisie van de volumemeting van het was als imaging werd uitgevoerd bij focus en een voldoende marge tussen de omtrek van het object van i overblijft nterest en de grenzen van het oppervlak van de integratie. Echter, het gebruik van een kamer veel hoger dan de diepte van de focus schaadt de beeldhelderheid als gevolg van foton diffusie, welke worden de randen van de objecten van belang. De fabricage van een hoge kamer van 3 µm verminderd deze laterale vervaging en mits uitzonderlijk goed gedefinieerde fluorescerende uitsluiting beelden zelfs met behulp van hoge nb (0.8) 40 X doelstellingen te visualiseren van neuronale takken met hoge zijdelingse resolutie.
Chip montage is een cruciale stap, met name in het geval van 3 µm hoge kamers, maar voorzichtig manipulatie zoals beschreven in punt 4.1.2 vermijdt het instorten van het dak. De hoge oppervlakte volumeverhouding geassocieerd met deze dunne kamers kwestie ook de van de stabiliteit van Dextran concentratie na verloop van tijd. Wij hebben gecontroleerd dat de oppervlakte absorptie van de Dextran na één nacht van incubatie verwaarloosbaar was: na het vervangen van Dextran door PBS, was het verschil in intensiteit tussen de pijler en de achtergrond ongeveer 1 per 1000 van het contrast van de eerste intensiteit tussen deze twee regio's in het bijzijn van Dextran. Opmerking dat neuronen op de bodem dekglaasje aan zowel op het PDMS dak houden kunnen. Dit effect verdwijnt wanneer met behulp van patroon coverslips (dat wil zeggen wanneer we niet zelfklevende moleculen in de vergaderzaal van het PDMS broeden doen), als de coating is dan ook strikt gelokaliseerd op de bodem van de kamer.
Afgezien van hun uitdagende morfologie, neuronen zijn eerder geschikt voor FXm wijten aan het feit dat een van de belangrijkste beperking van de methode, d.w.z. dextran endocytose, zeer beperkt is in deze cellen. We kiezen een 10 kDa formulering te onderdrukken in de lange bereik (uren) verschijnselen zichtbaar endocytose.
Kortom, is de conceptuele eenvoud van FXm gecompenseerd door een aantal experimentele problemen die zijn opgelost door het huidige protocol, zoals nanometric PDMS ruwheid en Micrometrische kamer hoogte of achtergrondcorrectie om te corrigeren voor de oneffenheden van het PDMS plafond tussen pijlers. Echter, het gebruik van een nauwe microfluidic kamer te beperken van het fluorescerende medium levert een paar specifieke beperkingen zoals de noodzaak van steun de pijlers, die het effectieve oppervlak beschikbaar voor cel adhesie, of de noodzaak verlaagt om het soma uitsluiten van de centrale kamer te observeren van neuronale extensies met de hoogste helderheid, die de regio's van de cel die toegankelijk zijn voor hoge resolutie observatie beperkt. Een mogelijke evolutie van deze methode zou zijn om zich te ontdoen van deze fysieke opsluiting, worden vervangen door een optische. De nieuwe ontwikkeling van lichte blad microscopie kan gecombineerd worden voordelig met FXm in de toekomst.

De precieze kennis van cellulaire volume heeft verhoogde aandacht getrokken in het afgelopen jaar, gedreven door de kwestie van de cel grootte homeostase in eencellige micro-organismen 1 , en meer in het algemeen in mitotische cellen 2. De vraag van cel volume is echter relevant ook voor post mitotische cellen, waarvoor neuronen een paradigmatische voorbeeld vormen.
Volume is inderdaad een belangrijke handtekening van fysiologische en pathologische gebeurtenissen op verschillende schalen en tijdstippen in neuronale leven, van voorbijgaande axonale vervorming geassocieerd met elektrische activiteit (milliseconde schaal) 3 tot en met de onomkeerbare neuronale zwelling die zich voordoen tijdens de asymptomatische fase van neurodegeneratieve ziekten (jaren bij de mens) 4. Echter, de grootste volumeverandering gebeurt in een tussentijdse tijdschaal voor dagen of weken (afhankelijk van het beschouwde organisme) tijdens de neuronale groei. De uitgebreide en complexe morfologie van neuronen aanleiding tot veelvouden kwesties, waaronder de regulering van de celgrootte. Axonale lengte en diameter zijn inderdaad strak gereguleerde in vivo, met waarden die specifiek zijn voor elke neuronale type 5,6.
Deze kwesties, complexe aan te pakken in vivo, kunnen ook worden behandeld in een vereenvoudigde manier in vitro. In dat streven, een methode die is gewijd aan de volumemeting snel genoeg groeidynamiek (d.w.z. binnen een tijdschaal van minuten) en compatibel met observatie over uren of dagen te volgen is vereist. Verschillende methoden zijn ontwikkeld in de jaren voor een directe of indirecte toegang tot cellulaire volume in vitro. Cel wederopbouw van confocal beeldvorming is een van hen, maar deze methode houdt labeling en herhaalde blootstelling aan licht terwijl een beperkte axiale resolutie van ongeveer 500 nm 7wordt weergegeven. Merk op dat deze twee laatste nadelen gedeeltelijk worden overwonnen door een meer verfijnd en recente methode met de naam lattice licht vel microscopie 8. Atomic Force microscopie is gebruikte 9 maar deze scanmethode gebruikt is door essentie traag en saai. Bovendien is het fysiek contact dat het vereist met de cel kan interfereren met de meting gezien de extreme zachtheid van neuronen 10. Indirecte methode met behulp van impedantie of resonantie hebben gewerkt voor andere cel typen 11, maar zijn niet voldoende voor uitgebreid zelfklevende cellen zoals neuronen.
Een van de meest veelbelovende methoden is gebaseerd op de maatregel van het uitgesloten volume van cellen in een nauwe kamer gevuld met een fluorescente kleurstof. De fluorescentie uitsluiting methode (ITA) is eenvoudig in het principe, want het vereist geen etikettering, en is geschikt voor optische beeldvorming van de snelle, op lange termijn van cel populaties met een potentieel sub optische axiale resolutie. Meer precies, hangt de resolutie in z af van de intensiteit van de maximale fluorescentie in de cultuur-zaal (dat wil zeggen regio verstoken van cellen) gedeeld door het dynamisch bereik van de camera, hoewel verschillende bronnen van geluidshinder deze uiteindelijke resolutie beperken. Deze methode is zeer krachtig te volgen van de omvang van de migratie Adherente cellen 12 of studeren volumeverandering tijdens de mitose van zoogdiercellen, zoals grondig beschreven in 13. Neuronen vormen echter een methodologische uitdaging voor FXm overwegen hun uitgebreide restanten in sub Micrometrische processen.
Wij presenteren hier een methode die leidt tot de fabricage van soepele FXm kamers tot met hoge precisie het volume en hoogte van neuronale takken en dynamische structuren die betrokken zijn bij de neuronale groei als de groei kegels.
Kamers moeten soortgelijke hoogten dan het object om te meten om te optimaliseren axiale resolutie. Daarom ontwierpen wij verschillende FXm apparaten gekenmerkt door centrale meting kamers van drie verschillende hoogtes. De dunste (3 µm in hoogte) is gewijd aan neurite meting: deze lage hoogte sluit soma, die in de in de omgeving van 15 µm hoge tussenliggende bedwelmingsruimte blijven. Dikkere midden kamers (10 en 12 µm) zijn voldoende hoog te volgen de hele celgroei. Het apparaat bevat ook twee reservoirs, gelegen aan weerszijden van de centrale kamer. Vier injectie gaten (IH) dus ten uitvoer worden gelegd en worden aangewezen als volgt: de inlaat en uitlaat dienen in te voeren van de cellulaire schorsingen in de chip, overwegende dat de twee anderen feed de reservoirs.
We hebben de eerste verzonnen kalibratie coverslips voor hoogte metingen met behulp van fotoresist structuren van de bekende meetkunde. We hebben vervolgens gratis groeiende neuronen, maar ook morfologisch beperkte neuronen beeld in micropatterns van hechting.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmalab System 100</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td></td>
			<td>To perform DRIE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MJB4 mask aligner</td>
			<td>SUSS MicroTec</td>
			<td></td>
			<td>SU-8 photolithography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NXQ 4006 Mask aligner</td>
			<td>Neutronix Quintel</td>
			<td></td>
			<td>Photolithography associated to DRIE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>Diener Electronic</td>
			<td>Pico PCCE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture hood</td>
			<td>ADS Laminaire</td>
			<td>Optimale 12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Heraeus Multifuge X1R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator 37 &#176;C 5% CO2</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MCO-170AICUVH-PE IncuSafe CO2 Incubator</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescence microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMi8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS Oven between 65 and 80 &#176;C</td>
			<td>Memmert</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mechanical profilometer</td>
			<td>Veeco</td>
			<td>Dektak 6M Stylus Profiler</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical profilometer</td>
			<td>Veeco</td>
			<td>Wyko NT9100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum desiccator</td>
			<td>Verrerie Villeurbanaise (Kartel Labware)</td>
			<td>230KAR</td>
			<td>Diameter 200 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic bath sonicator</td>
			<td>Labo Moderne</td>
			<td>SHE1000</td>
			<td>Volume of the bath: 0.8 liter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hotplate</td>
			<td>Stuart SD162</td>
			<td>SD162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DRIE</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Supplementary data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Su8 Mask 1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Supplementary data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Su8 Mask 2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Supplementary data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Su8 Mask 3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Supplementary data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S1805 calibration stripes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Supplementary data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small laboratory equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mm hole puncher</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>29002519 (US reference)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel or razor blade</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9&#34; Stainless Steel Flat Spatula with Spoon</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>82027-532</td>
			<td>To demold PDMS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Top Lip Wafer Handling</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>63042-096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved tweezer</td>
			<td>FST</td>
			<td>Dumont #7 Forceps - Standard / Dumoxel</td>
			<td>To manipulate glass coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Substrates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer</td>
			<td>Prolog Semicor Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24x24 mm glass coverslips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoresists and developpers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AZ 1518 positive photoresist</td>
			<td>Microchemicals GmbH</td>
			<td></td>
			<td>Before DRIE process, thicknes 1.8 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AZ 351B developer</td>
			<td>Microchemicals GmbH</td>
			<td></td>
			<td>To develop positive AZ 1518 photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 2007</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 2025</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 2050</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PGMA developer</td>
			<td>Technic</td>
			<td></td>
			<td>To develop SU-8 negative photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microposit S1805 resist</td>
			<td>Chimie Tech Services</td>
			<td></td>
			<td>Positive photoresist used to obtain 0.5&#181;m high structures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MF 26A developer</td>
			<td>Chimie Tech Services</td>
			<td></td>
			<td>To develop positive S1805 photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory consumables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable plastic pipette 3 mL</td>
			<td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P100 Petri dishes</td>
			<td>TPP</td>
			<td>93100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL syringe</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>SS+20ES1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transparent scotch tape</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square wipes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>115-2148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>DUTSCHER</td>
			<td>90260</td>
			<td>Plastic paraffin film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(3-Methacryloxypropyl)trichlorosilane</td>
			<td>abcr</td>
			<td>AB 109004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS and curing agent Sylgard 184</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>761036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isopropanol</td>
			<td></td>
			<td>W292907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly-ornithine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4957 - 50 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>02865</td>
			<td>99.8%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-methacryloxypropyl-trimethoxysilane</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>M6514-25ML</td>
			<td>(C4H5O2)-(CH2)3- Si(OCH3)3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acetic acid</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>71251-5ML-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran 10kW conjugated with Alexa488</td>
			<td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td>
			<td>D22910</td>
			<td>Absoprtion at 488 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran 10kW conjugated with Alexa647</td>
			<td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td>
			<td>D22914</td>
			<td>Absoprtion at 647 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM</td>
			<td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td>
			<td>21090-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td>
			<td>26050088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td>
			<td>12587-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax 200 mM</td>
			<td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate GIBCO 100 mM</td>
			<td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td>
			<td>15710-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS 10x</td>
			<td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td>
			<td>14180-046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes 1M</td>
			<td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td>
			<td>15630-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trypsin-EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>59418C-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal</td>
			<td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal without phenol red</td>
			<td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td>
			<td>12348-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Softwares</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Routine in Matlab for background normalization</td>
			<td>Quantacell</td>
			<td>Contact Victor Racine: victor.racine@quantacell.com</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To select specific ROI for image analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Routine</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td>Supplementary data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Routine</td>
			<td>Matlab</td>
			<td></td>
			<td>Supplementary data</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-resolution volume imaging of neurons by the use of fluorescence exclusion method and dedicated microfluidic devices

Volume is een belangrijke parameter over fysiologische en pathologische eigenschappen van neuronen op verschillende tijdschema's. Neuronen zijn vrij uniek cellen met betrekking tot hun uitgebreide vertakte morphologies en dus verschillende methodologische uitdagingen voor volumemeting te verhogen. In het bijzondere geval van de in vitro neuronale groei dient de gekozen methodologie sub Micrometrische axiale resolutie gecombineerd met full-veld Opmerking over tijdschema's van minuten tot uren of dagen. In tegenstelling tot andere methoden zoals cel vorm wederopbouw met behulp van de confocal imaging, elektrisch gebaseerde metingen of Atomic Force microscopie, heeft de onlangs ontwikkelde fluorescentie uitsluiting methode (ITA) het potentieel om te voldoen aan deze uitdagingen. Echter, hoewel ze eenvoudig zijn principieel, uitvoering van een hoge resolutie FXm voor neuronen vereist meerdere aanpassingen en een speciale methodologie. Hier presenteren we een methode gebaseerd op de combinatie van fluorescentie uitsluiting, lage-ruwheid meerdere compartimenten microfluidic apparaten, en tot slot micropatterning om in vitro metingen van lokale neuronale volume. De hoge resolutie geboden door het apparaat konden we voor het meten van het lokale volume van neuronale processen (neurites) en het volume van sommige specifieke structuren die betrokken zijn bij de neuronale groei, zoals groei kegels (GCs).

Het resultaat van het proces van fabricage beschreven in de punten 1 en 2 wordt geïllustreerd door de beelden van figuur 1A-1B en de curve van Figuur 1 c. De tabel van Figuur 1 d bevat de ruwheid waarden van twee verschillende representatieve gebieden van de PDMS-chip, dat wil zeggen in het midden en de 20 µm hoge volgende tussenliggende kamer. Een afname van de ruwheid met een factor van ongeveer 7 is verkregen met behulp van geëtste Si wafer in plaats van SU-8 fotoresist. Vervolgens, FXm werd eerst toegepast op een fotoresist streep van bekende meetkunde (figuur 2A) binnen een hoge kamer van 10 µm. Na de beeldverwerking en intensiteit naar hoogte conversie (Zie de grafiek van figuur 2B), FXm profielen uitgevoerd op dwarsdoorsneden langs deze streep (figuur 2C) bieden de gewenste hoogte profielen (figuur 2D). Figuur 2D geeft een vergelijking tussen profielen met behulp van mechanische profilometry en FXm methoden verkregen. Deze profielen, met inbegrip van rand en plateau waarde, zijn zeer vergelijkbaar, het valideren van de methode. De verstrooiing van FXm gegevens is niet representatief zijn voor de uiteindelijke resolutie van de methode, zoals nader beoordeeld in Figuur 3 en 4 van de figuur, maar resultaten uit de lage intensiteit gebruikt om te voorkomen dat een mogelijk effect van de zeer zwak auto-fluorescentie van de fotoresist in het GFP-kanaal.
Vervolgens zien we neurites in 3 µm en hoge kamers van 10 µm (Figuur 3). De standaarddeviatie van de achtergrondgeluiden is ongeveer 18 nm na intensiteit hoogte conversie en achtergrond correctie. Deze waarde is iets hoger dan de fysieke ruwheid van PDMS oppervlakken gegoten op silicium oppervlakken (12 nm, zie de tabel met Figuur 1 d) maar veel lager dan de ruwheid gemeten op PDMS van SU-8 mallen verkregen. Deze resultaten wijzen op de toegevoegde waarde van boren van waterputten in silicium wafers in plaats van het openen van gaten in de SU-8 fotoresist te werpen pijlers. Dergelijke lage waarde kan een hoog signaal / ruisverhouding en zeer heldere beelden in volume zoals weergegeven in figuur 3A. Als een voorbeeld van de gegevens die uit dergelijke beelden kunnen worden opgehaald, berekend we de hoeveelheid 1.6 µm (d.w.z. 10 pixels) breed neurite slice (Zie de grafiek van figuur 3B). In een eerste benadering met behulp van een lineaire vlaag van deze gegevens geeft een hoogtewaarde gemiddelde neurite van ongeveer 400 nm, moet worden vergeleken met bijvoorbeeld de 500 nm axonale diameter in 10 dagen oude pups binnen het corpus callosum 5 gevonden. Wij ook FXm gecombineerd met micropatterns wrijvingscoëfficiënt bestaande uit serieel abutted 2 µm en 6 µm brede strepen van 30 µm in lengte. Ons doel was het bestuderen van de invloed van de breedte van de neurite op de 3D-vorm. Figuur 3 c toont een 3D-weergave in valse kleuren van een afbeelding van de hele neuron verkregen in een hoge kamer van 10 µm. Neurites zaaien 2 µm en 6 µm brede strepen, overwegende dat het soma zich op het uiteinde van de grootste streep bevindt. Hoogte profielen opgesteld in drie verschillende doorsneden. In samenhang met de grafiek weergegeven in figuur 3A, het oppervlak geïntegreerd over de verhoging van de dwarsdoorsneden met de breedte van de neurite (figuur 3D).
We ook gericht op groei kegel (GC) 3D-structuren. Figuur 4 A-B toont twee verschillende GC profielen verkregen in een 3 µm hoge kamer, die wijzen op hun vertakte sub structuur. Daarnaast hebben we uitgevoerd time-lapse experimenten te volgen de dynamiek van het volume van GCs in een 12 µm hoge kamer. Figuur 4C geeft een cyclus van krimpen en reactivering van een bepaalde GC binnen een tijdsbestek van enkele tientallen minuten. Dankzij het gebruik van GFP-lifeact muizen, groei kegels waren gelokaliseerd in de golflengte van de emissie GFP (510 nm) van hun hoge actine-concentratie. Het oppervlak bij de golflengte geïdentificeerd werd gebruikt om te integreren over de dextran emissie golflengte op 647 nm voor het berekenen van de omvang van de GC. Figuur 4 d bevat ten slotte de verdeling van de omvang van de GC op verschillende tijdstippen en de locatie op drie verschillende neuronen, gecentreerd op een waarde van ongeveer 6 µm3.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56923/56923fig1v2.jpg"> Figuur 1: FXm PDMS chambers. (A) de regelingen voor de vier verschillende hoofdstappen van microfabrication leiden tot de definitieve mal. De locatie van de inlaat, de uitlaat en de stuwmeren worden aangegeven. Schaal bars: 1 mm. (B) beeld van de kamer van de PDMS FXm verkregen met behulp van een optische profilometer. Dit beeld toont de centrale kamer met 3 rijen van 10 µm hoge pilaren en de tussenliggende kamers van 20, 50 en 90 µm in hoogte. Schaal bar: 500 µm. (C) transversale weergave van de chip langs de twee stippellijnen getekend in (B). Geel/goud: dwarsdoorsnede langs pijlers, blauw: doorsnede tussen pijlers. (D) betekenen de waarden van de ruwheid van het PDMS gemeten op 50 × 50 µm2 gebieden gegoten op silicium en op de 20 µm hoge SU-8 tussenliggende kamer (Zie pijlen voor de locatie van deze gebieden). Gemiddelde waarden werden verkregen van de metingen van drie verschillende gebieden. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/56923fig1v2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56923/56923fig2.jpg"> Figuur 2: kalibratie van FXm methode met behulp van een fotoresist streep als het object belangenverstrengeling. (A) GFP-fluorescentie foto genomen in een hoge kamer van 10 µm gevuld met 10.000 MW dextran absorberende op 488 nm bij 1 mg/mL. (B: achtergrond, P: pijler). Observatie met een droge 40 X NA 0.8 doelstelling. Schaal bar: 50 µm. (B) lineaire kalibratie recht verkregen van de gemiddelde intensiteit van de twee gekleurde rechthoeken weergegeven in A. (C) fluorescentie intensiteit profiel verkregen op het niveau van de blauwe, onderbroken lijn weergegeven in (A), overschrijding van de fotoresist streep (0,45 µm hoge positieve fotoresist). (D) de vergelijking van de profielen verkregen mechanische profilometer (zwarte stippen) en FXm na intensiteit naar hoogte conversie van de gegevens van (B) (blauwe stippen). <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/56923fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56923/56923fig3.jpg"> Figuur 3: Neurite volume imaging. (A) Neurite zich uitstrekt in de centrale 3 µm hoge kamer van soma bevindt zich in de volgende 15 µm tussenliggende zaal. Imaging uitgevoerd met behulp van 10.000 MW dextran absorberende op 488 nm en een 40 X, NA 0,8 droog doelstelling. Verzonken vlak van de verkregen na het gebruik van de achtergrond reductie routine hoogtepunten, de twee neurites en gekozen uitzetten in de grafiek aan de rechterkant. Schaal bars: 30 µm. (B) Neurite segment volume als een functie van de breedte van de neurite verkregen uit de 22 profielen (gemiddeld op 10 pixels, dat wil zeggen op een 1.6 µm "neurite slice") weergegeven in (A). De ononderbroken lijn vertegenwoordigt een lineaire vlaag van helling 0.4 µm passeren door de oorsprong. (C) valse kleurenafbeelding van een patroon neuron op een zelfklevende stripe gemaakt van opeenvolgende 2 µm en 6 µm breed stompen (vertegenwoordigd in wit). Metingen zijn verricht in een 10 µm hoge kamer gevuld met 10.000 MW dextran absorberende op 647 nm en het gebruik van een 40 x NA 0.8 droog doelstelling. (D) hoogte profielen overeenkomt met de gekleurde streepjeslijnen weergegeven in (C), houden het zelfde kleur code. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/56923fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56923/56923fig4.jpg"> Figuur 4: statische en dynamische groei kegel imaging. (A-B) Groei Kegel hoogte profielen verkregen in een 3 µm hoge kamer na intensiteit naar hoogte conversie langs de gele lijnen in gekoppelde afbeeldingen weergegeven. Observatie uitgevoerd met behulp van een opvulling met 10.000 MW dextran absorberende op 488 nm en een 40 X, NA 0,8 droog doelstelling. (C) hele neuron imaging in een 12 µm hoge kamer gevuld met 10.000 MW dextran absorberende op 647 nm. Waarnemingen zijn gedaan in twee fluorescerende kanalen: GFP voor groei kegel lokalisatie (gele stippellijnen) en CY5 voor het berekenen van de omvang van de GC van fluorescentie uitsluiting. Het oppervlak opgenomen door gele stippellijnen werd gebruikt voor het berekenen van de omvang van de GC. De grafiek toont de variatie van GC volume over tijd, en de bijbehorende morphologies in zowel GFP en CY5 kanalen op twee verschillende tijdstippen vertegenwoordiger. Alle gegevens zijn verkregen met behulp van een 40 x NA 0.8 droog doelstelling iedere 3 min. schaal bars: 10 µm. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/56923fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Stap</td>
			<td>1:8 µm laag maskeren</td>
			<td>Masker 2:30 µm laag</td>
			<td>Masker 3:40 µm laag</td>
		</tr>
<tr>
<td>SU-8 type</td>
			<td>2007</td>
			<td>2025</td>
			<td>2050</td>
		</tr>
<tr>
<td>Spincoating</td>
			<td>30 s @ 2000 toeren per minuut</td>
			<td>30 s @ 3050 rpm</td>
			<td>30 s @ 3250 rpm</td>
		</tr>
<tr>
<td>Zachte bak</td>
			<td>3 min @ 95 ° C</td>
			<td>2 min @ 65 ° C + 6 min. @ 95 ° C</td>
			<td>3 min @ 65 ° C + 7 min. @ 95 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Blootstelling energie</td>
			<td>110 mJ/cm2
</td>
			<td>155 mJ/cm2
</td>
			<td>170 mJ/cm2
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Post-exposure bak</td>
			<td>4 min @ 95 ° C</td>
			<td>1 min @ 65 ° C + 6 min. @ 95 ° C</td>
			<td>2 min @ 65 ° C + 7 min. @ 95 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ontwikkeling</td>
			<td>2 min 30 s</td>
			<td>5 min</td>
			<td>6 min</td>
		</tr>
<tr>
<td>Harde bak (optioneel)</td>
			<td>3-5 min @ 200 ° C</td>
			<td>3-5 min @ 200 ° C</td>
			<td>3-5 min @ 200 ° C</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: fotolithografie stappen uitgevoerd om te bouwen van een apparaat met een centrale kamer van 12 μm in hoogte. Hoogten van de tussenliggende kamers: 20, 50 en 90 µm.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Stap</td>
			<td>Maskeren van 1:10 µm laag</td>
			<td>Masker 2:30 µm laag</td>
			<td>Masker 3:40 µm laag</td>
		</tr>
<tr>
<td>SU-8 type</td>
			<td>2007</td>
			<td>2025</td>
			<td>2050</td>
		</tr>
<tr>
<td>Spincoating</td>
			<td>30 s @ 1500 rpm</td>
			<td>30 s @ 3050 rpm</td>
			<td>30 s @ 3250 rpm</td>
		</tr>
<tr>
<td>Zachte bak</td>
			<td>3 min @ 95 ° C</td>
			<td>2 min @ 65 ° C + 6 min. @ 95 ° C</td>
			<td>3 min @ 65 ° C + 7 min. @ 95 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Blootstelling energie</td>
			<td>125 mJ/cm2
</td>
			<td>155 mJ/cm2
</td>
			<td>170 mJ/cm2
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Post-exposure bak</td>
			<td>4 min @ 95 ° C</td>
			<td>1 min @ 65 ° C + 6 min. @ 95 ° C</td>
			<td>2 min @ 65 ° C + 7 min. @ 95 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ontwikkeling</td>
			<td>2 min 30 s</td>
			<td>5 min</td>
			<td>6 min</td>
		</tr>
<tr>
<td>Harde bak (optioneel)</td>
			<td>3-5 min @ 200 ° C</td>
			<td>3-5 min @ 200 ° C</td>
			<td>3-5 min @ 200 ° C</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 2: fotolithografie stappen uitgevoerd om te bouwen van een apparaat met een centrale kamer van 10 μm in hoogte. Hoogten van de tussenliggende kamers: 20, 50 en 90 µm.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Stap</td>
			<td>Maskeren van 1:12 µm laag</td>
			<td>Masker 2:32 µm laag</td>
			<td>Masker 3:40 µm laag</td>
		</tr>
<tr>
<td>SU-8 type</td>
			<td>2015</td>
			<td>2025</td>
			<td>2050</td>
		</tr>
<tr>
<td>Spincoating</td>
			<td>30 s @ 3250 rpm</td>
			<td>30 s @ 2500 rpm</td>
			<td>30 s @ 3250 rpm</td>
		</tr>
<tr>
<td>Zachte bak</td>
			<td>3 min @ 95 ° C</td>
			<td>2 min @ 65 ° C + 5 min @ 95 ° C</td>
			<td>3 min @ 65 ° C + 7 min. @ 95 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Belichtingstijd</td>
			<td>140 mJ/cm2
</td>
			<td>157 mJ/cm2
</td>
			<td>170 mJ/cm2
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Post-exposure bak</td>
			<td>4 min @ 95 ° C</td>
			<td>1 min @ 65 ° C + 5 min @ 95 ° C</td>
			<td>2 min @ 65 ° C + 7 min. @ 95 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ontwikkeling</td>
			<td>3 min</td>
			<td>5 min</td>
			<td>6 min</td>
		</tr>
<tr>
<td>Harde bak (optioneel)</td>
			<td>3-5 min @ 200 ° C</td>
			<td>3-5 min @ 200 ° C</td>
			<td>3-5 min @ 200 ° C</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 3: fotolithografie stappen uitgevoerd om te bouwen van een apparaat met een centrale kamer van 3 μm in hoogte. Hoogten van de tussenliggende kamers: 18, 50 en 90 µm.
Aanvullende gegevens 1: masks_neuron_volume_chips.tiff. Schematische weergave van de maskers gebruikt voor het fabriceren van het PDMS apparaat (DRIE masker en maskers 1-3). <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/masks_neuron_volume_chips.tiff">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullende gegevens 2: bestand "masks_neuron_volume_chips.dxf". Elektronische bestanden, waardoor de DRIE masker en maskers 1-3 te fabriceren. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/masks_neuron_volume_chips.dxf">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullende gegevens 3: "Mask_Photoresist-stripes.dxf". Elektronische bestanden, waardoor het masker gebruikt voor de fotolithografie van fotoresist strepen fabriceren. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/Mask_Photoresist-stripes.dxf">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullende gegevens 4: bestand conversion_mattotiff.m <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/conversion_mattotiff.m">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullende gegevens 5: bestand importfilevol.m <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/importfilevol.m">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>

Watch this Scientific Journal Video about High-resolution Volume Imaging of Neurons by the Use of Fluorescence eXclusion Method and Dedicated Microfluidic Devices at JoVE.com

High-resolution Volume Imaging of Neurons by the Use of Fluorescence eXclusion Method and Dedicated Microfluidic Devices

Volume is een belangrijke parameter over fysiologische en pathologische eigenschappen van cellen. Beschrijven we een fluorescerende uitsluiting methode waardoor volledige-veld meting van in vitro neuronale volume met sub Micrometrische axiale resolutie die nodig zijn voor de analyse van neurites en dynamische structuren geïmpliceerd in neuronale groei.

Hoge resolutie Volume Imaging van neuronen met de uitsluiting van het gebruik van fluorescentie methode en gewijd Microfluidic apparaten

Volume is an important parameter regarding physiological and pathological characteristics of neurons at different time scales. Neurons are quite unique ...

The overall goal of this procedure is to allow full field measurement of in vitro neuronal volume with submicrometric axial resolution required for the analysis of neurites in dynamic structures implied in neuronal growth. This method can help answer key questions in the field of cellular neuroscience regarding the dynamics of volume changes at the subsididal scale during the nongrowth or axon degeneration. The main advantage of this technique is that it provides submicrometric axial resolution combined with full fit observation and time scale to hours or days.To begin the procedure, demold the PDMS block under a chemical hood by pouring isopropanol on it. Next, place it on the stainless steel bench of the hood. Cut around the silicone wafer and demold the PDMS replica.Then, cut around the chip and leave a two millimeter margin using a scalpel or a razor blade. Punch the inlet by pressing the 1.5 millimeter diameter puncher firmly and actuate it in order to cut and carve the hole of the inlet. Do the same at the four dedicated zones of the chip where liquid will be injected.Afterward, clean the chip by sticking and peeling the adhesive tape on the microstructured side. Sprinkle isopropanol on both sides. Then, dry the chip with pressurized nitrogen using an air blow gun.In this procedure, place each coverslip on a spin-coater located in a clean room environment. Apply a drop of the positive photoresist to cover about 75%of the coverslip and spin-coat at 4000 rpm for 30 seconds to reach a final thickness of 0.45 micrometer. Place the coverslips on a hotplate with a surface temperature of 115 degrees Celsius for one minute.Using a mask aligner, expose each coverslip at a wavelength of 435 nanometer through the dedicated mask according to the fabricant parameters. Next, prepare two glass crystallizing dishes, one containing the developer without dilution, the other containing deionized water. Dip the coverslips one by one in the developer for one minute while continuously and gently stirring the crystallizing dish.Then, submerge the wafer in deionized water for about five seconds. Transfer the wafer to an absorbent paper and dry it with pressurized nitrogen using an air blow gun. Place both the PDMS chip and the glass dish on which it will be bonded into the plasma chamber for surface activation.Next, deposit a drop of water on a rectangular thick microscope glass slide and stick the coverslip on the glass slide by capillarity. Under a microscope, mark the location of the photoresist stripes at the rear of the glass slide. Place the patterned glass coverslip on the mask holder of the mask aligner.Rely on the mark made to center the photoresist reference objects. To increase the optic contrast, place a silicon wafer beneath the PDMS chip. The silicon wafer should remain firmly attached on the chuck during the alignment process.Then, place the PDMS chip on the mobile substrate holder of the mask aligner. Subsequently, lift the chuck enough to visualize both the chip and the array of photoresist stripes located on the coverslip while staying behind the mechanical contact. Perform alignment and achieve mechanical contact between the chip and the coverslip by lifting the chuck until the surface of PDMS pillars touches the glass coverslip.After that, lower the chuck. Remove the coverslip bonded to the chip from the mask holder. Then, place the device into a 35 millimeter Petri dish and transfer everything into the oven for five to ten minutes to increase the bonding strength.Thirty minutes after bonding, place a ten microliter pipette tip filled with PLO solution at the inlet. Then, load the liquid until forming a drop on top. Repeat the same operation at the outlet and reservoirs.Subsequently, add PBS in the Petri dish all around the chip. Seal the Petri dish with a paraffin film and incubate at room temperature with a minimum of five hours. Then, press a ten microliter tip cone lightly into each injection hole and suck up the excess liquid.Next, replace PLO as well as the PBS surrounding the chip by the culture medium. Afterward, place the chip in the incubator regulated at 37 degrees Celsius and 5%carbon dioxide until neurons seed with a minimum of five hours incubation time. In this procedure, draw up the culture medium from the chip.Collect two to three microliters of the freshly resuspended cell solution and inject it at the inlet. Immediately repeat the same operation at the outlet. Inject about the same volume of culture medium in each reservoir.Quickly observe the chip under the microscope to check the density of the cells. The order of magnitude of the optimal cell density corresponds to about five to ten cells within the square surface delimited by four pillars. Repeat the procedure of injection of 0.5 to 1 microliter of cell suspension to reach the targeted cell density.For imaging, replace the culture medium with the imaging medium. Then, place the chip under an epifluorescence microscope. Acquire images of cells from single to multiple successive images in case of time-lapse experiments.Shown here are the representative observations of a calibration photoresist stripe and neurons. Higher magnification images and cross-sections of these objects are displayed on the right. The representative neurites and a three micrometer high central chamber are shown here.The volume of neurite slice can be computed as a function of neurite width. And here are the representative growth cones and a three micrometer high central chamber. Their substructures emerge clearly from an optical background noise of about 20 nanometers.Time-lapse observations of life act neurons seeded into a 12 micrometer high chamber to follow the cycle of shrinking and reactivation of the growth cone within a time scale of a few tens of minutes. While attempting this procedure, it's important to have an access to a deep ion etching equipment to fabricate the silicon mud. After watching this video, you should have a good understanding of how to align a structured glass coverslip with a PDMS chip.Once mastered, this technique can be reproducibly applied to the quantification of neurology in 3d. This technique paved the way for researchers in the field of pharmacology to explore the effect of various drugs with actual caliber all in closed cone shape. Don't forget that working with primary neurons require a lot of care to avoid contamination and shatters.Be always gentle and quick when changing media in order to limit the time they spend outside incubator.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

An Organotypic Slice Assay for High-Resolution Time-Lapse Imaging of Neuronal Migration in the Postnatal Brain

Een organotypische Slice Assay voor High-Resolution Time-Lapse Imaging van neuronale migratie in de postnatale Brain

Neurogenesis in the postnatal brain depends on maintenance of three biological events: proliferation of progenitor cells, migration of neuroblasts, as ...

A Rapid Approach to High-Resolution Fluorescence Imaging in Semi-Thick Brain Slices

Een snelle aanpak van High-Resolution Imaging fluorescentie in Semi-Dik Brain Slices

A fundamental goal to both basic and clinical neuroscience is to better understand the identities, molecular makeup, and patterns of connectivity that are ...

High-resolution Functional Magnetic Resonance Imaging Methods for Human Midbrain

Hoge resolutie functionele magnetische resonantie imaging methoden voor Human middenhersenen

Functional MRI (fMRI) is a widely used tool for non-invasively measuring correlates of human brain activity. However, its use has mostly been focused upon ...

High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

Met een hoge resolutie Live-Imaging van cel gedrag in de ontwikkelingslanden Neuroepithelium

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central ...

Analysis of Developing Tooth Germ Innervation Using Microfluidic Co-culture Devices

Analyse van de ontwikkelingslanden Tooth Germ Innervatie behulp van microfluïdische co-cultuur apparaten

Innervation plays a key role in the development, homeostasis and regeneration of organs and tissues. However, the mechanisms underlying these phenomena ...

High-resolution Structural Magnetic Resonance Imaging of the Human Subcortex In Vivo and Postmortem

High-resolution Structural Magnetic Resonance Imaging of the Human Subcortex In Vivo and Postmortem

Hoge-resolutie structurele Magnetic Resonance Imaging van de Human subcortex<I&gt; In Vivo</I&gt; En Postmortem

The focus of this study was to test the resolution limits of structural MRI of a postmortem brain compared to living human brains. The resolution of ...

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Fluorescentie en Bioluminescentie beeldvorming van Subcellulaire Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; In Aged hippocampus Neuronen

Susceptibility to neuron cell death associated to neurodegeneration and ischemia are exceedingly increased in the aged brain but mechanisms responsible ...

High-Resolution Quantitative Immunogold Analysis of Membrane Receptors at Retinal Ribbon Synapses

High-Resolution Kwantitatieve immunogoud Analyse van membraanreceptoren op het netvlies Ribbon Synapses

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA ...

Imaging Neurons within Thick Brain Sections Using the Golgi-Cox Method

Imaging Neuronen binnen Dik Brain af met de Golgi-Cox Method

The Golgi-Cox method of neuron staining has been employed for more than two hundred years to advance our understanding of neuron morphology within ...

High-resolution Confocal Imaging of the Blood-brain Barrier: Imaging, 3D Reconstruction, and Quantification of Transcytosis

Hoge resolutie Confocal beeldvorming van de bloed - hersen barrière: Imaging, 3D reconstructie en kwantificering van Transcytosis

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic multicellular interface that regulates the transport of molecules between the circulation and the brain. ...