Name: high-resolution volume imaging of neurons by the use of fluorescence exclusion method and dedicated microfluidic devices
Uploaded: 2018-03-26T12:30:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-resolution Volume Imaging of Neurons by the Use of Fluorescence eXclusion Method and Dedicated Microfluidic Devices at JoVE.com

Die Autoren ChiLab, Materialien und Microsystems Labor - Politecnico di Torino - DISAT, in der Person von Prof. C F Pirri, Dr. M Cocuzza und Dr. S L Marasso, bestätigen möchten für ihre wertvolle Unterstützung bei der Prozessentwicklung und Gerät Herstellung. Wir danken Victor Racine von Quantacell für Diskussion und Unterstützung in der Bildverarbeitung. Wir sind dankbar, Isabelle Grandjean und Manon Chartier von Animal Facility des Institut Curie für ihre Unterstützung für Mäuse, und Pablo Vargas und Ana-Maria Lennon (Institut Curie) für die Bereitstellung von uns mit der GFP LifeAct Mäusen. Wir sind dankbar, Olivier Thouvenin vom Institut Langevin und Clotilde Cadart, Larisa Venkova und Matthieu Piel vom Institut Curie - UMR 144, für ihre Hilfe für das Verständnis der Fluoreszenz unter Ausschluss Methode. Zu guter Letzt danken wir die technologische Plattform der Institut Pierre-Gilles de Gennes (CNRS UMS 3750) für ihre Unterstützung in Microfabrication. Diese Arbeit wurde teilweise unterstützt von der europäischen Forschung Rat Advanced Grant Nr. 321107 "CellO" PSL Université (SwithNeuroTrails Projekt), ANR Investissement Avenir und IPGG Labex und Equipex.

<ol>
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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+graphene+based+nanocomposite+for+application+in+3D+flexible+micro-supercapacitors.">A novel graphene based nanocomposite for application in 3D flexible micro-supercapacitors.</a> Materials Research Express. 3 (6), 065001 (2016).</li><li>Welch, C. C., Goodyear, A. L., Wahlbrink, T., Lemme, M. C., Mollenhauer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silicon+etch+process+options+for+micro-and+nanotechnology+using+inductively+coupled+plasmas.">Silicon etch process options for micro-and nanotechnology using inductively coupled plasmas.</a> Microelectronic Engineering. 83 (4), 1170-1173 (2006).</li><li>Fath, T., Ke, Y. D., Gunning, P., G&#246;tz, J., Ittner, L. 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Die Autoren erklären keinen Interessenskonflikt.

Volumen-Bildgebung von Neuronen stellt eine Herausforderung für die FXm-Technik durch die langen und dünnen Erweiterungen dieser Zellen. Dieses Protokoll beschreibt Varianten des gleichen Typs von mikrofluidischen Gerät Neuron Bildgebung gewidmet.
Neben den Aspekten von mikrofluidischen Design die Wahl des Ziels ist von grundlegender Bedeutung für die Fluoreszenz Ausgrenzung Bildgebung und impliziert einen Kompromiss zwischen Ortsauflösung und die Bildschärfe. Es hat 13 gezeigt, dass eine hohe NA führt zu einer Tiefenschärfe kleiner als die Höhe der Kammer war nicht nachteilig für die Präzision der Volumenmessung, wenn Bildgebung mit Schwerpunkt durchgeführt wurde und wenn ein ausreichender Spielraum zwischen die Kontur des Objekts der ich gelassen wird Geschäftsgelegenheiten und die Grenzen der Integration Oberfläche. Allerdings beeinträchtigt die Verwendung einer Kammer deutlich höher als die Schärfentiefe der Bildschärfe durch Photon Diffusion, welche glättet die Kanten der Objekte von Interesse. Die Herstellung einer hohen Kammer mit 3 µm reduziert das seitliche Weichzeichnen und lieferte außergewöhnlich gut definierten fluoreszierende Ausgrenzung Bilder auch mit hohen NA (0,8) 40 X Ziele neuronale Verzweigungen mit hoher Ortsauflösung zu visualisieren.
Chip-Montage ist ein entscheidender Schritt, insbesondere bei 3 µm hohen Kammern, aber vorsichtig Manipulation wie unter 4.1.2 vermeidet den Zusammenbruch des Daches. Die hohe Fläche zum Volumenverhältnis, diese dünnen Kammern zugeordnet Frage auch die der Stabilität der Dextran Konzentration im Laufe der Zeit. Wir haben überprüft, ob die Oberflächenabsorption der Dextran nach einer Nacht der Inkubation unbedeutend war: nach Dextran durch PBS ersetzt, der Unterschied der Intensität zwischen der Säule und der Hintergrund war etwa 1 pro 1000 der Anfangsintensität Kontrast zwischen Diese beiden Regionen in Anwesenheit von Dextran. Beachten Sie, dass Neuronen auf der Unterseite Deckglas und auf dem Dach des PDMS halten können. Dieser Effekt verschwindet, wenn mit gemusterten Deckgläsern (d. h. wenn wir nicht anhaftende Moleküle innerhalb der PDMS-Kammer inkubieren), wie die Beschichtung auf der Unterseite der Kammer daher streng lokalisiert.
Abgesehen von ihrer anspruchsvollen Morphologie Neuronen eignen sich eher für FXm aufgrund der Tatsache, dass eine erhebliche Einschränkung der Methode, d. h. Dextran Endozytose, sehr begrenzt ist in diesen Zellen. Wir wählen eine 10 kDa Formulierung langfristig unterdrücken reichen (in Stunden) sichtbaren Endozytose Phänomene.
Zusammenfassend ist die konzeptionelle Einfachheit der FXm durch eine Reihe von experimentellen Probleme ausgeglichen, die durch dieses Protokoll, z. B. nanometrischen PDMS Rauheit und mikrometrische Kammer Höhe oder Untergrundkorrektur für die Unebenheiten korrigieren gelöst wurden die PDMS Decke zwischen Säulen. Die Verwendung einer engen mikrofluidischen Kammer zu beschränken, das fluoreszierende Medium führt jedoch ein paar spezifische Einschränkungen wie die Notwendigkeit der Unterstützung Säulen, die die wirksame Oberfläche für Zelladhäsion oder die Notwendigkeit der zentralen Soma ausschließen senkt Kammer, neuronale Erweiterungen mit der höchsten Klarheit zu beobachten, die Regionen der Zelle für hochauflösende Beobachtung zugänglich einschränkt. Eine mögliche Weiterentwicklung dieser Methode wäre get rid of dieser physischen Entbindung durch eine optische ersetzt werden. Die Neuentwicklung des Lichtblattmikroskopie könnte in Zukunft vorteilhaft mit FXm kombiniert werden.

Die genaue Kenntnis der zellulären Volumen hat erhöhte Aufmerksamkeit in den letzten Jahren angezogen, angetrieben von der Frage der Zelle Größe Homöostase in einzelnen-celled Mikroorganismen 1 und ganz allgemein in der mitotischen Zellen 2. Allerdings ist die Frage des Zellvolumens relevant auch für Post-mitotischen Zellen, für die Neuronen ein Paradebeispiel dar.
Volumen ist in der Tat eine wichtige Unterschrift der physiologischen und pathologischen Veranstaltungen auf verschiedenen Skalen und Zeitpunkten im neuronalen Leben von transienten axonalen Verformung elektrische Aktivität (Millisekunden Skala) 3 , die irreversible zugeordnet neuronale Schwellung auftreten während der asymptomatischen Phase der neurodegenerativen Erkrankungen (über Jahre beim Menschen) 4. Allerdings tritt die größte Volumenänderung in Zwischenzeit Maßstab von Tagen oder Wochen (abhängig von der betrachteten Organismus) während des neuronalen Wachstums. Die ausgedehnte und komplexe Morphologie der Neuronen wirft Fragen auf ein Vielfaches, unter denen die Regulierung der Zellengröße. Axonalen Länge und Durchmesser sind in der Tat streng regulierten in Vivo, mit Werten spezifisch für jedes neuronaler Typ 5,6.
Diese Fragen, komplex, um in Vivo, Adresse können auch in vereinfachter Form angesprochen werden in-vitro-. In diesem Ziel eine Methode gewidmet Volumenmessung schnell genug Wachstumsdynamik (d. h. in einer Zeitskala von Minuten) und kompatibel mit Beobachtung über Stunden oder Tage zu folgen ist erforderlich. Verschiedene Methoden wurden im Laufe der Jahre zu einer direkten oder indirekten Zugriff auf zelluläre Volumen in Vitroentwickelt. Zelle Rekonstruktion von confocal Imaging ist einer von ihnen, aber diese Methode impliziert Etikettierung und wiederholten Expositionen gegenüber Licht und zeigt eine begrenzte axiale Auflösung von ca. 500 nm 7. Beachten Sie, dass diese zwei letzten Nachteile durch eine anspruchsvolle und aktuelle Methode namens Gitter Licht-Blatt Mikroskopie 8teilweise überwunden werden. Atomic Force Microscopy hat gebrauchte 9 aber diese Scan-Methode ist durch Wesen langsam und mühsam. Darüber hinaus kann der Körperkontakt, die, den es mit der Zelle erfordert, die Messung, wenn man bedenkt die extreme Weichheit der Neuronen 10beeinträchtigen. Indirekte Methode mittels Impedanz oder Resonanz haben für verschiedene Zelltypen 11, aber sind nicht ausreichend für erweitert anhaftende Zellen wie Neuronen eingesetzt.
Eine der vielversprechendsten Methoden basiert auf das Maß der ausgeschlossenen Volumen von Zellen in einer engen Kammer gefüllt mit einem Fluoreszenzfarbstoff. Die Fluoreszenz-Ausschluss-Methode (FXm) ist einfach in seinem Prinzip, da es erfordert keine Kennzeichnung und eignet sich für schnelle, langfristige optische Bildgebung der Zell-Populationen mit einer potenziell Sub optische axiale Auflösung. Genauer gesagt, hängt die Auflösung in z die maximale Fluoreszenzintensität in der Kultur-Kammer (d. h. in Region frei von Zellen) geteilt durch den Dynamikbereich der Kamera, obwohl mehrere Schallquellen dieser ultimative Auflösung begrenzen. Diese Methode ist sehr mächtig, das Volumen der Migration von adhärenten Zellen 12 folgen oder Volumenänderung während der Mitose von Säugerzellen, wie gründlich in 13beschrieben zu studieren gewesen. Neuronen bilden jedoch eine methodische Herausforderung für FXm unter Berücksichtigung ihrer umfangreichen Verzweigung in Sub mikrometrische Prozesse.
Wir stellen Ihnen hier eine Methode führt zur Herstellung von glatten FXm Kammern zugänglich mit hoher Präzision die Lautstärke und Höhe des neuronalen Verzweigungen und dynamische Strukturen neuronale Wachstum wie Wachstum Kegel beteiligt.
Kammern müssen ähnliche Höhen als das Objekt zu messen, um axiale Auflösung optimieren. Daher haben wir verschiedene FXm-Geräte zeichnen sich durch zentrale Messung Kammern mit drei verschiedenen Höhen entwickelt. Die dünnste (3 µm in der Höhe) widmet sich der Neurit Messung: dieser niedrigen Höhe schließt Soma, die bleiben in der in der Nähe von 15 µm hohen Zwischenkammer. Dickere zentrale Kammern (10 und 12 µm) sind hoch genug, um die ganze Zelle Wachstum folgen. Das Gerät beinhaltet auch zwei Reservoirs befindet sich auf beiden Seiten der zentralen Kammer. Vier Löcher in Injektion (IH) sind so umgesetzt und werden wie folgt bezeichnet: den Einlass und Auslass einzuführen die zellulären Suspensionen in den Chip dienen, während die beiden anderen Stauseen ernähren.
Wir haben erste fabrizierten Kalibrierung Deckgläsern für Höhenmessungen mit Fotolack Strukturen der bekannter Geometrie. Wir haben dann frei wachsenden Neuronen, sondern auch morphologisch abhängigen Neuronen in Micropatterns der Adhäsion abgebildet.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmalab System 100</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td></td>
			<td>To perform DRIE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MJB4 mask aligner</td>
			<td>SUSS MicroTec</td>
			<td></td>
			<td>SU-8 photolithography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NXQ 4006 Mask aligner</td>
			<td>Neutronix Quintel</td>
			<td></td>
			<td>Photolithography associated to DRIE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>Diener Electronic</td>
			<td>Pico PCCE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture hood</td>
			<td>ADS Laminaire</td>
			<td>Optimale 12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Heraeus Multifuge X1R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator 37 &#176;C 5% CO2</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MCO-170AICUVH-PE IncuSafe CO2 Incubator</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescence microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMi8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS Oven between 65 and 80 &#176;C</td>
			<td>Memmert</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mechanical profilometer</td>
			<td>Veeco</td>
			<td>Dektak 6M Stylus Profiler</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical profilometer</td>
			<td>Veeco</td>
			<td>Wyko NT9100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum desiccator</td>
			<td>Verrerie Villeurbanaise (Kartel Labware)</td>
			<td>230KAR</td>
			<td>Diameter 200 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic bath sonicator</td>
			<td>Labo Moderne</td>
			<td>SHE1000</td>
			<td>Volume of the bath: 0.8 liter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hotplate</td>
			<td>Stuart SD162</td>
			<td>SD162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DRIE</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Supplementary data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Su8 Mask 1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Supplementary data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Su8 Mask 2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Supplementary data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Su8 Mask 3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Supplementary data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S1805 calibration stripes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Supplementary data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small laboratory equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mm hole puncher</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>29002519 (US reference)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel or razor blade</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9&#34; Stainless Steel Flat Spatula with Spoon</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>82027-532</td>
			<td>To demold PDMS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Top Lip Wafer Handling</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>63042-096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved tweezer</td>
			<td>FST</td>
			<td>Dumont #7 Forceps - Standard / Dumoxel</td>
			<td>To manipulate glass coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Substrates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer</td>
			<td>Prolog Semicor Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24x24 mm glass coverslips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoresists and developpers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AZ 1518 positive photoresist</td>
			<td>Microchemicals GmbH</td>
			<td></td>
			<td>Before DRIE process, thicknes 1.8 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AZ 351B developer</td>
			<td>Microchemicals GmbH</td>
			<td></td>
			<td>To develop positive AZ 1518 photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 2007</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 2025</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 2050</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PGMA developer</td>
			<td>Technic</td>
			<td></td>
			<td>To develop SU-8 negative photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microposit S1805 resist</td>
			<td>Chimie Tech Services</td>
			<td></td>
			<td>Positive photoresist used to obtain 0.5&#181;m high structures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MF 26A developer</td>
			<td>Chimie Tech Services</td>
			<td></td>
			<td>To develop positive S1805 photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory consumables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable plastic pipette 3 mL</td>
			<td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P100 Petri dishes</td>
			<td>TPP</td>
			<td>93100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL syringe</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>SS+20ES1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transparent scotch tape</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square wipes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>115-2148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>DUTSCHER</td>
			<td>90260</td>
			<td>Plastic paraffin film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(3-Methacryloxypropyl)trichlorosilane</td>
			<td>abcr</td>
			<td>AB 109004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS and curing agent Sylgard 184</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>761036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isopropanol</td>
			<td></td>
			<td>W292907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly-ornithine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4957 - 50 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>02865</td>
			<td>99.8%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-methacryloxypropyl-trimethoxysilane</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>M6514-25ML</td>
			<td>(C4H5O2)-(CH2)3- Si(OCH3)3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acetic acid</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>71251-5ML-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran 10kW conjugated with Alexa488</td>
			<td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td>
			<td>D22910</td>
			<td>Absoprtion at 488 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran 10kW conjugated with Alexa647</td>
			<td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td>
			<td>D22914</td>
			<td>Absoprtion at 647 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM</td>
			<td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td>
			<td>21090-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td>
			<td>26050088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td>
			<td>12587-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax 200 mM</td>
			<td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate GIBCO 100 mM</td>
			<td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td>
			<td>15710-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS 10x</td>
			<td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td>
			<td>14180-046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes 1M</td>
			<td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td>
			<td>15630-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trypsin-EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>59418C-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal</td>
			<td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal without phenol red</td>
			<td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td>
			<td>12348-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Softwares</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Routine in Matlab for background normalization</td>
			<td>Quantacell</td>
			<td>Contact Victor Racine: victor.racine@quantacell.com</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To select specific ROI for image analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Routine</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td>Supplementary data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Routine</td>
			<td>Matlab</td>
			<td></td>
			<td>Supplementary data</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-resolution volume imaging of neurons by the use of fluorescence exclusion method and dedicated microfluidic devices

Volumen ist ein wichtiger Parameter zur physiologischen und pathologischen Eigenschaften der Neuronen auf unterschiedlichen Zeitskalen. Neuronen sind ziemlich einzigartig Zellen über ihre erweiterte verzweigten Morphologien und erhöhen folglich mehrere methodische Herausforderungen für Volumen-Messung. Im besonderen Fall von in-vitro- neuronale Wachstum sollte die gewählte Methodik Sub mikrometrische axiale Auflösung, kombiniert mit Vollfeld Beobachtung auf Zeitskalen von Minuten, Stunden oder Tage umfassen. Im Gegensatz zu anderen Methoden wie Zelle Form Wiederaufbau mit konfokale Bildgebung, elektrisch-basierten Messungen oder Atomic Force Microscopy hat die neu entwickelte Fluoreszenz-Ausschluss-Methode (FXm) das Potenzial, diese Herausforderungen zu erfüllen. Obwohl es einfach in seinem Prinzip, erfordert jedoch Umsetzung einer hochauflösenden FXm für Neuronen, mehrere Anpassungen und eine spezielle Methodik. Wir stellen Ihnen hier eine Methode basiert auf der Kombination von Fluoreszenz Ausgrenzung, niedrig-Rauhigkeit Multi-Fächer mikrofluidischen Geräten und schließlich Micropatterning, in-vitro- Messung der lokalen neuronalen Volumen zu erreichen. Die hohe Auflösung zur Verfügung gestellt vom Gerät konnten wir messen das lokale Laufwerk von neuronalen Prozessen (Neuriten) und die Lautstärke etwas spezifischer Strukturen neuronale Wachstum, wie Wachstum Kegel (GCs) beteiligt.

Das Ergebnis des Prozesses der Herstellung in den Abschnitten 1 und 2 beschrieben wird anhand der Bilder der Figur 1A-1 b und die Kurve der Abbildung 1. Die Tabelle der Abb. 1 zeigt die Rauheitskennwerte von zwei verschiedenen repräsentativen Bereichen der PDMS-Chip, d. h. in den Mittel-und 20 µm hoch nächste Zwischenkammer. Eine Abnahme der Rauheit um einen Faktor von etwa 7 eingeholt wurde mit geätzten Si-Wafer statt SU-8 Fotolack. FXm wurde dann zuerst auf ein Photoresist Streifen aus bekannter Geometrie (Abbildung 2A) innerhalb einer 10 µm hohe Kammer angewendet. Nach der Bildverarbeitung und Intensität zur Höhe Umkehr (siehe das Diagramm der Abbildung 2 b), FXm Profile durchgeführt auf Querschnitte entlang dieser Streifen (Abbildung 2) bieten die gewünschte Höhenprofile (Abb. 2D). Abb. 2D zeigt den Vergleich zwischen den Profilen mit mechanischen Profilometry und FXm Methoden erzielt. Diese Profile, einschließlich Rand und Plateau, sind sehr ähnlich, Validierung der Methode. Beachten Sie, dass die Streuung der FXm Daten nicht repräsentativ für die ultimative Auflösung der Methode, wie in Abbildung 3 und Abbildung 4, beurteilt, sondern ergibt sich aus der geringen Intensität eingesetzt, um eine mögliche Wirkung von dem sehr schwachen zu vermeiden Auto-Fluoreszenz von Photolack in der GFP-Kanal.
Dann beobachteten wir Neuriten in 3 µm und 10 µm hohen Kammern (Abbildung 3). Die Standardabweichung der Hintergrundgeräusche ist etwa 18 nm nach Intensität, Höhe-Konvertierung und Hintergrund-Korrektur. Dieser Wert ist etwas höher als der physische Rauheit des PDMS Flächen gegossen auf Silizium-Oberflächen (12 nm, siehe Abbildung 1) aber viel niedriger als die Rauheit auf PDMS gemessen von SU-8 Formen erhalten. Diese Ergebnisse zeigen den Mehrwert der Bohren von Brunnen in Silizium-Wafer, anstatt Löcher in SU-8 Photoresist Säulen werfen zu öffnen. Ein niedriger Wert erlaubt ein high-Signal zu Rauschverhältnis und sehr klare Bilder in Volumen wie die in Abbildung 3Aangezeigt. Als ein Beispiel für die Daten, die aus solchen Bildern abgerufen werden können, berechnet das Volumen von 1,6 µm (d.h. 10 Pixel) breite Neuriten (siehe das Diagramm der Abbildung 3 b) in Scheiben schneiden. Verwendung in erster Näherung eine lineare Anpassung dieser Daten bietet einen mittlere Neuriten Höhenwert von etwa 400 nm, verglichen mit z.B. der axonale Durchmesser 500 nm in 10 Tage alten Welpen innerhalb der Corpus Callosum- 5 gefunden. Wir haben auch FXm mit Micropatterns Adhäsion bestehend aus seriell verschweißten 2 µm und 6 µm breite Streifen von 30 µm Länge kombiniert. Unser Ziel war die Untersuchung des Einflusses der Neurit Breite auf die 3D-Form. Abbildung 3 zeigt eine 3D Darstellung in der falschen Farbe eine ganze Neuron Bild in einer großen Kammer 10 µm. Neuriten verbreiten auf 2 µm und 6 µm breite Streifen, während die Soma auf die Extremität der größte Streifen befindet. Höhenprofile wurden in drei verschiedenen Querschnitten gezogen. In Übereinstimmung mit der Grafik in Abbildung 3Aangezeigt die Oberfläche über die Erhöhung der Querschnitte mit der Neurit Breite (Abbildung 3D) integriert.
Wir weiters Wachstum Kegel (GC) 3D-Strukturen. Abbildung 4 A-B zeigt zwei verschiedene GC Profile erhalten in einer 3 µm hohe Kammer, die ihre verzweigten Unterkonstruktion hervorheben. Darüber hinaus führten wir Zeitraffer Experimente durchführen, um die Dynamik des Volumens der GCs in einer 12 µm hohe Kammer zu folgen. Abbildung 4 zeigt einen Zyklus der schrumpfenden und Reaktivierung einer bestimmten GC innerhalb einer Zeitskala von ein paar Dutzend Minuten. Durch den Einsatz von GFP-Lifeact Mäusen waren Wachstum Kegel in der GFP Emissionswellenlänge lokalisiert (510 nm) von ihrer hohen Aktin-Konzentration. Die Oberfläche bei der Wellenlänge identifiziert wurde verwendet, um über die Dextran Emissionswellenlänge bei 647 integrieren nm um GC Volumen zu berechnen. Abbildung 4 zeigt die Verteilung der GC Volumen an Ort zu verschiedenen Zeitpunkten schließlich auf drei verschiedene Neuronen, zentriert auf einen Wert von ca. 6 µm3.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56923/56923fig1v2.jpg"> Abbildung 1: FXm PDMS Kammern. (A) Regelungen der vier verschiedenen wichtigsten Schritte der Mikrofabrikation führt in die endgültige Form. Die Lage der Einlass, Auslass und Stauseen sind angegeben. Skalieren Sie Bars: 1 mm. (B) Bild der PDMS FXm Kammer unter Verwendung einer optische Profilometer. Dieses Bild zeigt die zentrale Kammer mit 3 Reihen von 10 µm hohen Säulen und die Mittelstufen Kammern von 20, 50 und 90 µm in der Höhe. Maßstabsleiste: 500 µm. (C) Querschnittsansicht des Chips an die beiden gestrichelten Linien gezeichnet (B). Gelb/Gold: Querschnitt entlang Säulen, blau: Querschnitt zwischen den Säulen. (D) bedeuten die PDMS Rauheit Messwerte auf 50 × 50 µm-2 -Gebieten auf Silizium und auf 20 µm hohen SU-8 Zwischenkammer geformt (siehe Pfeile für den Standort dieser Bereiche). Mittelwerte wurden aus den Messungen von drei verschiedenen Bereichen erhalten. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/56923fig1v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56923/56923fig2.jpg"> Abbildung 2: Kalibrierung der FXm-Methode mit einem Fotolack Streifen als das Objekt des Interesses. (A) GLP-Fluoreszenz-Aufnahme in einer 10 µm hohe Kammer gefüllt mit 10.000 MW Dextran absorbierende bei 488 nm bei 1 mg/mL. (B: Hintergrund, P: Säule). Beobachtung mit einem trockenen 40 X NA 0,8 Ziel. Maßstabsleiste: 50 µm. (B) lineare Kalibrierung Recht entnommen die mittlere Intensität der beiden farbigen Rechtecke dargestellt in A. (C) Fluoreszenz Intensität Profil bezogen auf der Ebene der blau gestrichelten Linie dargestellt (A), überqueren den Fotolack Streifen (0,45 µm hohen positiven Photoresist). (D) Vergleich der gewonnenen mechanischen Profilometer (schwarze Punkte) und FXm nach Intensität, Höhe Konvertierung der Daten (b) (blaue Punkte) Profile. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/56923fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56923/56923fig3.jpg"> Abbildung 3: Neurit Volume Imaging. (A) Neurit erstreckt sich in die zentrale 3 µm hohe Kammer von Soma befindet sich in den nächsten 15 µm Zwischenkammer. Bildgebung durchgeführt mit 10.000 MW Dextran absorbierende bei 488 nm und 40 X, NA 0,8 trocknen Ziel. Der Inset erhalten nach dem Gebrauch den Hintergrund Reduktion Routine Highlights die beiden Neuriten und gewählt, um das Diagramm auf der rechten Seite zu plotten. Skalieren Sie Bars: 30 µm. (B) Neurit Slice Volumen als Funktion der Neurit breite gewonnenen 22 Profile (Durchschnitt auf 10 Pixel, d. h. auf einem 1,6 µm "Neurit Slice") in (A) gezeigt. Die durchgezogene Linie stellt eine lineare Anpassung der Neigung 0,4 µm durch den Ursprung. (C) Falschfarbenbild eines gemusterten Neurons auf einen selbstklebenden Streifen hergestellt aus aufeinanderfolgenden 2 µm und 6 µm breite Stümpfe (in weiß dargestellt). Messungen wurden in einer 10 µm hohe Kammer gefüllt mit 10.000 MW Dextran absorbierende bei 647 nm und mit einer 40 X NA 0,8 trocknen Ziel. (D) Höhenprofilen entsprechend farbige Striche angezeigt (c), halten die gleiche Farbcode. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/56923fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56923/56923fig4.jpg"> Abbildung 4: statische und dynamische Wachstum Kegel Bildgebung. (A-B) Wachstum Kegel Höhenprofile erhalten in einer großen Kammer 3 µm nach Intensität zur Umkehr Höhe entlang der gelben Linien im zugehörigen Bilder angezeigt. Beobachtung durchgeführt, mit einer Füllung mit 10.000 MW Dextran absorbierende bei 488 nm und 40 X, NA 0,8 trocknen Ziel. (C) ganze Neuron Bildgebung in einer 12 µm hohe Kammer gefüllt mit 10.000 MW Dextran absorbierende bei 647 nm. Beobachtungen wurden in zwei fluoreszierende Kanäle: GFP für Wachstum Kegel Lokalisierung (gelb gestrichelt) und CY5 um GC Volumen von Fluoreszenz Ausgrenzung zu berechnen. Die Oberfläche enthalten gelb gestrichelt wurde zur GC Volumen zu berechnen. Die Grafik zeigt die Variation des GC Volumen über Zeit und damit verbundenen Morphologien in GLP und CY5 Kanäle zu zwei repräsentative unterschiedlichen Zeitpunkten. Alle Daten wurden übernommen, mit einer 40 X NA 0,8 trocknen Ziel alle 3 min. Maßstabsleisten: 10 µm. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/56923fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Schritt</td>
			<td>1:8 µm Schicht Maske</td>
			<td>Maske 02:30 µm Schicht</td>
			<td>Maske 03:40 µm Schicht</td>
		</tr>
<tr>
<td>SU-8 Typ</td>
			<td>2007</td>
			<td>2025</td>
			<td>2050</td>
		</tr>
<tr>
<td>Spincoating</td>
			<td>30 s @ 2000 u/min</td>
			<td>30 s @ 3050 u/min</td>
			<td>30 s bei 3250 u/min</td>
		</tr>
<tr>
<td>Weiche Backen</td>
			<td>3 min @ 95 ° C</td>
			<td>2 min @ 65 ° C + 6 min. @ 95 ° C</td>
			<td>3 min @ 65 ° C + 7 min. @ 95 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Exposition-Energie</td>
			<td>110 mJ/cm2
</td>
			<td>155 mJ/cm2
</td>
			<td>170 mJ/cm2
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nach Exposition Backen</td>
			<td>4 min @ 95 ° C</td>
			<td>1 min @ 65 ° C + 6 min. @ 95 ° C</td>
			<td>2 min @ 65 ° C + 7 min. @ 95 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Entwicklung</td>
			<td>2 min 30 s</td>
			<td>5 min</td>
			<td>6 min</td>
		</tr>
<tr>
<td>Harte Backen (optional)</td>
			<td>3-5 min. @ 200 ° C</td>
			<td>3-5 min. @ 200 ° C</td>
			<td>3-5 min. @ 200 ° C</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1: Photolithographie Schritte durchgeführt, ein Gerät mit einer zentralen Kammer 12 μm Höhe bauen. Höhen der Mittelstufen Kammern: 20, 50 und 90 µm.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Schritt</td>
			<td>Maske 01:10 µm Schicht</td>
			<td>Maske 02:30 µm Schicht</td>
			<td>Maske 03:40 µm Schicht</td>
		</tr>
<tr>
<td>SU-8 Typ</td>
			<td>2007</td>
			<td>2025</td>
			<td>2050</td>
		</tr>
<tr>
<td>Spincoating</td>
			<td>30 s @ 1500 u/min</td>
			<td>30 s @ 3050 u/min</td>
			<td>30 s bei 3250 u/min</td>
		</tr>
<tr>
<td>Weiche Backen</td>
			<td>3 min @ 95 ° C</td>
			<td>2 min @ 65 ° C + 6 min. @ 95 ° C</td>
			<td>3 min @ 65 ° C + 7 min. @ 95 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Exposition-Energie</td>
			<td>125 mJ/cm2
</td>
			<td>155 mJ/cm2
</td>
			<td>170 mJ/cm2
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nach Exposition Backen</td>
			<td>4 min @ 95 ° C</td>
			<td>1 min @ 65 ° C + 6 min. @ 95 ° C</td>
			<td>2 min @ 65 ° C + 7 min. @ 95 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Entwicklung</td>
			<td>2 min 30 s</td>
			<td>5 min</td>
			<td>6 min</td>
		</tr>
<tr>
<td>Harte Backen (optional)</td>
			<td>3-5 min. @ 200 ° C</td>
			<td>3-5 min. @ 200 ° C</td>
			<td>3-5 min. @ 200 ° C</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 2: Photolithographie Schritte durchgeführt, ein Gerät mit einer zentralen Kammer von 10 μm Höhe bauen. Höhen der Mittelstufen Kammern: 20, 50 und 90 µm.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Schritt</td>
			<td>Maske 01:12 µm Schicht</td>
			<td>Maske 02:32 µm Schicht</td>
			<td>Maske 03:40 µm Schicht</td>
		</tr>
<tr>
<td>SU-8 Typ</td>
			<td>2015</td>
			<td>2025</td>
			<td>2050</td>
		</tr>
<tr>
<td>Spincoating</td>
			<td>30 s bei 3250 u/min</td>
			<td>30 s @ 2500 u/min</td>
			<td>30 s bei 3250 u/min</td>
		</tr>
<tr>
<td>Weiche Backen</td>
			<td>3 min @ 95 ° C</td>
			<td>2 min @ 65 ° C + 5 min. @ 95 ° C</td>
			<td>3 min @ 65 ° C + 7 min. @ 95 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Belichtungszeit</td>
			<td>140 mJ/cm2
</td>
			<td>157 mJ/cm2
</td>
			<td>170 mJ/cm2
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nach Exposition Backen</td>
			<td>4 min @ 95 ° C</td>
			<td>1 min @ 65 ° C + 5 min. @ 95 ° C</td>
			<td>2 min @ 65 ° C + 7 min. @ 95 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Entwicklung</td>
			<td>3 min</td>
			<td>5 min</td>
			<td>6 min</td>
		</tr>
<tr>
<td>Harte Backen (optional)</td>
			<td>3-5 min. @ 200 ° C</td>
			<td>3-5 min. @ 200 ° C</td>
			<td>3-5 min. @ 200 ° C</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 3: Photolithographie Schritte durchgeführt, ein Gerät mit einer zentralen Kammer 3 μm Höhe bauen. Höhen der Mittelstufen Kammern: 18, 50 und 90 µm.
Ergänzende Daten 1: masks_neuron_volume_chips.tiff. Schematische Darstellung der Masken verwendet, um das PDMS-Gerät (DRIE Maske und Masken 1-3) zu fabrizieren. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/masks_neuron_volume_chips.tiff">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.</a>
Ergänzende Daten 2: Datei "masks_neuron_volume_chips.dxf". Elektronische Dateien ermöglicht, um die DRIE Maske und Masken 1-3 zu fabrizieren. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/masks_neuron_volume_chips.dxf">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.</a>
Ergänzende Daten 3: "Mask_Photoresist-stripes.dxf". Elektronische Dateien ermöglicht, um die Maske für die Fotolithografie Photoresist Streifen zu fabrizieren. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/Mask_Photoresist-stripes.dxf">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.</a>
Ergänzende Daten 4: conversion_mattotiff.m-Datei <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/conversion_mattotiff.m">Klicken Sie bitte hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Daten 5: importfilevol.m-Datei <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/importfilevol.m">Klicken Sie bitte hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>

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High-resolution Volume Imaging of Neurons by the Use of Fluorescence eXclusion Method and Dedicated Microfluidic Devices

Volumen ist ein wichtiger Parameter zur physiologischen und pathologischen Eigenschaften der Zellen. Wir beschreiben eine fluoreszierende Ausschluss-Methode, flächenhafte Messung von in-vitro- neuronale Volumen mit Sub mikrometrische axiale Auflösung benötigt für die Analyse von Neuriten und dynamische Strukturen in neuronale Wachstum impliziert.

Hochauflösende Volume Imaging von Neuronen durch den Einsatz von Fluoreszenz-Ausschluss Methode und mikrofluidischen Geräten gewidmet

Volume is an important parameter regarding physiological and pathological characteristics of neurons at different time scales. Neurons are quite unique ...

The overall goal of this procedure is to allow full field measurement of in vitro neuronal volume with submicrometric axial resolution required for the analysis of neurites in dynamic structures implied in neuronal growth. This method can help answer key questions in the field of cellular neuroscience regarding the dynamics of volume changes at the subsididal scale during the nongrowth or axon degeneration. The main advantage of this technique is that it provides submicrometric axial resolution combined with full fit observation and time scale to hours or days.To begin the procedure, demold the PDMS block under a chemical hood by pouring isopropanol on it. Next, place it on the stainless steel bench of the hood. Cut around the silicone wafer and demold the PDMS replica.Then, cut around the chip and leave a two millimeter margin using a scalpel or a razor blade. Punch the inlet by pressing the 1.5 millimeter diameter puncher firmly and actuate it in order to cut and carve the hole of the inlet. Do the same at the four dedicated zones of the chip where liquid will be injected.Afterward, clean the chip by sticking and peeling the adhesive tape on the microstructured side. Sprinkle isopropanol on both sides. Then, dry the chip with pressurized nitrogen using an air blow gun.In this procedure, place each coverslip on a spin-coater located in a clean room environment. Apply a drop of the positive photoresist to cover about 75%of the coverslip and spin-coat at 4000 rpm for 30 seconds to reach a final thickness of 0.45 micrometer. Place the coverslips on a hotplate with a surface temperature of 115 degrees Celsius for one minute.Using a mask aligner, expose each coverslip at a wavelength of 435 nanometer through the dedicated mask according to the fabricant parameters. Next, prepare two glass crystallizing dishes, one containing the developer without dilution, the other containing deionized water. Dip the coverslips one by one in the developer for one minute while continuously and gently stirring the crystallizing dish.Then, submerge the wafer in deionized water for about five seconds. Transfer the wafer to an absorbent paper and dry it with pressurized nitrogen using an air blow gun. Place both the PDMS chip and the glass dish on which it will be bonded into the plasma chamber for surface activation.Next, deposit a drop of water on a rectangular thick microscope glass slide and stick the coverslip on the glass slide by capillarity. Under a microscope, mark the location of the photoresist stripes at the rear of the glass slide. Place the patterned glass coverslip on the mask holder of the mask aligner.Rely on the mark made to center the photoresist reference objects. To increase the optic contrast, place a silicon wafer beneath the PDMS chip. The silicon wafer should remain firmly attached on the chuck during the alignment process.Then, place the PDMS chip on the mobile substrate holder of the mask aligner. Subsequently, lift the chuck enough to visualize both the chip and the array of photoresist stripes located on the coverslip while staying behind the mechanical contact. Perform alignment and achieve mechanical contact between the chip and the coverslip by lifting the chuck until the surface of PDMS pillars touches the glass coverslip.After that, lower the chuck. Remove the coverslip bonded to the chip from the mask holder. Then, place the device into a 35 millimeter Petri dish and transfer everything into the oven for five to ten minutes to increase the bonding strength.Thirty minutes after bonding, place a ten microliter pipette tip filled with PLO solution at the inlet. Then, load the liquid until forming a drop on top. Repeat the same operation at the outlet and reservoirs.Subsequently, add PBS in the Petri dish all around the chip. Seal the Petri dish with a paraffin film and incubate at room temperature with a minimum of five hours. Then, press a ten microliter tip cone lightly into each injection hole and suck up the excess liquid.Next, replace PLO as well as the PBS surrounding the chip by the culture medium. Afterward, place the chip in the incubator regulated at 37 degrees Celsius and 5%carbon dioxide until neurons seed with a minimum of five hours incubation time. In this procedure, draw up the culture medium from the chip.Collect two to three microliters of the freshly resuspended cell solution and inject it at the inlet. Immediately repeat the same operation at the outlet. Inject about the same volume of culture medium in each reservoir.Quickly observe the chip under the microscope to check the density of the cells. The order of magnitude of the optimal cell density corresponds to about five to ten cells within the square surface delimited by four pillars. Repeat the procedure of injection of 0.5 to 1 microliter of cell suspension to reach the targeted cell density.For imaging, replace the culture medium with the imaging medium. Then, place the chip under an epifluorescence microscope. Acquire images of cells from single to multiple successive images in case of time-lapse experiments.Shown here are the representative observations of a calibration photoresist stripe and neurons. Higher magnification images and cross-sections of these objects are displayed on the right. The representative neurites and a three micrometer high central chamber are shown here.The volume of neurite slice can be computed as a function of neurite width. And here are the representative growth cones and a three micrometer high central chamber. Their substructures emerge clearly from an optical background noise of about 20 nanometers.Time-lapse observations of life act neurons seeded into a 12 micrometer high chamber to follow the cycle of shrinking and reactivation of the growth cone within a time scale of a few tens of minutes. While attempting this procedure, it's important to have an access to a deep ion etching equipment to fabricate the silicon mud. After watching this video, you should have a good understanding of how to align a structured glass coverslip with a PDMS chip.Once mastered, this technique can be reproducibly applied to the quantification of neurology in 3d. This technique paved the way for researchers in the field of pharmacology to explore the effect of various drugs with actual caliber all in closed cone shape. Don't forget that working with primary neurons require a lot of care to avoid contamination and shatters.Be always gentle and quick when changing media in order to limit the time they spend outside incubator.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

An Organotypic Slice Assay for High-Resolution Time-Lapse Imaging of Neuronal Migration in the Postnatal Brain

Ein organotypischen Assay für High-Resolution Time-Lapse Imaging neuronaler Migration in der postnatalen Gehirn

Neurogenesis in the postnatal brain depends on maintenance of three biological events: proliferation of progenitor cells, migration of neuroblasts, as ...

Forschung

Neurowissenschaften

A Rapid Approach to High-Resolution Fluorescence Imaging in Semi-Thick Brain Slices

Eine schnelle Annäherung an High-Resolution Fluoreszenz-Imaging in Semi-Thick Hirnschnitten

A fundamental goal to both basic and clinical neuroscience is to better understand the identities, molecular makeup, and patterns of connectivity that are ...

High-resolution Functional Magnetic Resonance Imaging Methods for Human Midbrain

Hochauflösende Functional Magnetic Resonance Imaging Methods for Human Mittelhirn

Functional MRI (fMRI) is a widely used tool for non-invasively measuring correlates of human brain activity. However, its use has mostly been focused upon ...

High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

Hochauflösende Live-Bildgebung von Zell-Verhalten in der Entwicklung von Neuroepithel

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central ...

Analysis of Developing Tooth Germ Innervation Using Microfluidic Co-culture Devices

Die Analyse der Entwicklung von Zahnkeim Innervation Mit Microfluidic Co-Kultur-Geräte

Innervation plays a key role in the development, homeostasis and regeneration of organs and tissues. However, the mechanisms underlying these phenomena ...

High-resolution Structural Magnetic Resonance Imaging of the Human Subcortex In Vivo and Postmortem

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Hochauflösende Strukturkernspintomographie des menschlichen Subcortex<I&gt; In-vivo-</I&gt; Und Postmortem

The focus of this study was to test the resolution limits of structural MRI of a postmortem brain compared to living human brains. The resolution of ...

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

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Fluoreszenz- und Biolumineszenz-Bildgebung subzellulärer Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Im Alter von Neuronen im Hippocampus

Susceptibility to neuron cell death associated to neurodegeneration and ischemia are exceedingly increased in the aged brain but mechanisms responsible ...

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Hochauflösende Quantitative Immungold-Analyse von Membranrezeptoren auf der Netzhaut Ribbon Synapsen

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA ...

Imaging Neurons within Thick Brain Sections Using the Golgi-Cox Method

Imaging Neurone innerhalb Dickhirnschnitten Mit der Golgi-Cox-Methode

The Golgi-Cox method of neuron staining has been employed for more than two hundred years to advance our understanding of neuron morphology within ...

High-resolution Confocal Imaging of the Blood-brain Barrier: Imaging, 3D Reconstruction, and Quantification of Transcytosis

Hochauflösende konfokale Bildgebung der Blut - Hirn-Schranke: Bildgebung, 3D-Rekonstruktion und Quantifizierung der Transcytosis

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic multicellular interface that regulates the transport of molecules between the circulation and the brain. ...