Name: high-resolution volume imaging of neurons by the use of fluorescence exclusion method and dedicated microfluidic devices
Uploaded: 2018-03-26T12:30:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-resolution Volume Imaging of Neurons by the Use of Fluorescence eXclusion Method and Dedicated Microfluidic Devices at JoVE.com

Forfatterne ønsker å erkjenne ChiLab, materialer og Microsystems laboratorium - Politecnico di Torino - DISAT, i person av Prof C F Pirri, Dr. M Cocuzza og Dr. S L Marasso, for deres dyrebare støtte i Prosessutvikling og enhet fabrikasjon. Vi takker Victor Racine fra Quantacell diskusjonsforum og kundestøtte i bildebehandling. Vi er takknemlige for Isabelle Grandjean og Manon Chartier fra dyr anlegget Institut Curie for deres støtte for mus, og Pablo Vargas og Ana-Maria Lennon (Institut Curie) for å gi oss GFP LifeAct mus. Vi er takknemlige for Olivier Thouvenin fra Institut Langevin og Clotilde Cadart, Larisa Venkova og Matthieu Piel fra Institut Curie - UMR 144, for deres hjelp i forståelsen av fluorescens utelukkelse metoden. Til slutt, vi takker teknologisk plattform Institut Pierre-Gilles de Gennes (CNRS UMS 3750) for deres støtte i microfabrication. Dette arbeidet var støttes delvis av den europeiske Research Council avansert Grant nr. 321107 "CellO," PSL Université (SwithNeuroTrails prosjekt), ANR Investissement d'Avenir, og IPGG Labex og Equipex.

<ol>
	<li>Jun, S., Taheri-Araghi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-size+maintenance:+universal+strategy+revealed.">Cell-size maintenance: universal strategy revealed.</a> Trends Microbiol. 23 (1), 4-6 (2015).</li><li>Zlotek-Zlotkiewicz, E., Monnier, S., Cappello, G., Le Berre, M., Piel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+volume+and+mass+measurements+show+that+mammalian+cells+swell+during+mitosis.">Optical volume and mass measurements show that mammalian cells swell during mitosis.</a> J. Cell Biol. 211 (4), 765-774 (2015).</li><li>Kim, G. H., Kosterin, P., Obaid, A. L., Salzberg, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mechanical+spike+accompanies+the+action+potential+in+Mammalian+nerve+terminals.">A mechanical spike accompanies the action potential in Mammalian nerve terminals.</a> Biophys J. 92 (9), 3122-3129 (2007).</li><li>Iacono, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+Hypertrophy+in+Asymptomatic+Alzheimer+Disease.">Neuronal Hypertrophy in Asymptomatic Alzheimer Disease.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 67 (6), 578-589 (2008).</li><li>Cheli, V. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+Deletion+of+the+L-Type+Calcium+Channel+Cav1.+2+in+Oligodendrocyte+Progenitor+Cells+Affects+Postnatal+Myelination+in+Mice.">Conditional Deletion of the L-Type Calcium Channel Cav1. 2 in Oligodendrocyte Progenitor Cells Affects Postnatal Myelination in Mice.</a> J Neurosci. 36 (42), 10853-10869 (2016).</li><li>Kneynsberg, A., Collier, T. J., Manfredsson, F. P., Kanaan, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+and+semi-quantitative+measurements+of+axonal+degeneration+in+tissue+and+primary+neuron+cultures.">Quantitative and semi-quantitative measurements of axonal degeneration in tissue and primary neuron cultures.</a> J Neurosci Methods. 266, 32-41 (2016).</li><li>Fouquet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+axial+resolution+in+confocal+microscopy+with+new+high+refractive+index+mounting+media.">Improving axial resolution in confocal microscopy with new high refractive index mounting media.</a> PloS one. 10 (3), (2015).</li><li>Aguet, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+dynamics+of+dividing+cells+imaged+by+lattice+light-sheet+microscopy.">Membrane dynamics of dividing cells imaged by lattice light-sheet microscopy.</a> Mol Biol Cell. 27 (22), 3418-3435 (2016).</li><li>Roland, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannabinoid-induced+actomyosin+contractility+shapes+neuronal+morphology+and+growth.">Cannabinoid-induced actomyosin contractility shapes neuronal morphology and growth.</a> eLife. 3, (2014).</li><li>Lu, Y. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viscoelastic+properties+of+individual+glial+cells+and+neurons+in+the+CNS.">Viscoelastic properties of individual glial cells and neurons in the CNS.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 103 (47), 17759-17764 (2006).</li><li>Chen, J., Xue, C., Zhao, Y., Chen, D., Wu, M. H., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+impedance+flow+cytometry+enabling+high-throughput+single-cell+electrical+property+characterization.">Microfluidic impedance flow cytometry enabling high-throughput single-cell electrical property characterization.</a> Int J Mol Sci. 16 (5), 9804-9830 (2015).</li><li>Bottier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+measurement+of+the+height+and+volume+of+migrating+cells+by+a+novel+fluorescence+microscopy+technique.">Dynamic measurement of the height and volume of migrating cells by a novel fluorescence microscopy technique.</a> Lab Chip. 11, 3855-3863 (2011).</li><li>Cadart, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+eXclusion+Measurement+of+volume+in+live+cells.">Fluorescence eXclusion Measurement of volume in live cells.</a> Methods Cell Biol. 139, 103-120 (2017).</li><li>Marasso, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+graphene+based+nanocomposite+for+application+in+3D+flexible+micro-supercapacitors.">A novel graphene based nanocomposite for application in 3D flexible micro-supercapacitors.</a> Materials Research Express. 3 (6), 065001 (2016).</li><li>Welch, C. C., Goodyear, A. L., Wahlbrink, T., Lemme, M. C., Mollenhauer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silicon+etch+process+options+for+micro-and+nanotechnology+using+inductively+coupled+plasmas.">Silicon etch process options for micro-and nanotechnology using inductively coupled plasmas.</a> Microelectronic Engineering. 83 (4), 1170-1173 (2006).</li><li>Fath, T., Ke, Y. D., Gunning, P., G&#246;tz, J., Ittner, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+support+cultures+of+hippocampal+and+substantia+nigra+neurons.">Primary support cultures of hippocampal and substantia nigra neurons.</a> Nat. Protoc. 4 (1), 78-85 (2008).</li><li>Getting intensity values from single ROI. Image Intensity Processing Available from: <a target="_blank" href="https://imagej.net/Image_Intensity_Processing">https://imagej.net/Image_Intensity_Processing</a> (2017)</li><li>19. Tools. ImageJ User Guide Available from: <a target="_blank" href="https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146-19.html">https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146-19.html</a> (2017)</li></ol>

Forfatterne erklære noen interessekonflikt.

Volum bildebehandling av neurons utgjør en utfordring for FXm teknikken på grunn av lang og tynn utvidelser av disse cellene. Denne protokollen beskriver varianter av den samme typen microfluidic enhet dedikert Nevron bildebehandling.
Foruten aspektene ved microfluidic design, valg av målet er grunnleggende for fluorescens utelukkelse bildebehandling og innebærer en avveining mellom lateral oppløsning og bilde klarhet. Det har vært vist i 13 at en høy NA fører til en dybde av fokus mindre enn kammer høyden ikke var skadelig for presisjonen av volummåling hvis imaging ble utført på fokus og en tilstrekkelig margin står mellom konturen for objektet av jeg nterest og grensene for integrering overflaten. Men svekker bruk av et kammer mye høyere enn dybden av fokus bildeskarphet på grunn av Foton diffusjon, som utjevner kantene på objekter av interesse. Fabrikasjon av en 3 µm høy kammer redusert dette lateral sløret og gitt svært godt definerte fluorescerende utelukkelse bilder selv med høy NA (0,8) 40 X mål å visualisere neuronal grener med lateral høyoppløselig.
Chip montering er et kritisk punkt, spesielt i 3 µm høy kamre, men forsiktig manipulasjon som beskrevet i 4.1.2 unngår sammenbruddet av taket. Høy overflaten volumkontrollen tilknyttet disse tynne kamre reiste også spørsmålet om stabilitet dekstran konsentrasjon over tid. Vi har sjekket at overflaten absorpsjon av dekstran etter en natt med inkubering var ubetydelig: etter erstatter dekstran av PBS, forskjellen av intensitet pilaren og bakgrunnen var ca 1 per 1000 av første intensitet kontrasten mellom disse to regionene i nærvær av dekstran. Merk at neurons kan overholde både bunn-dekkglassvæske og PDMS taket. Denne effekten forsvinner når bruke mønstret coverslips (dvs. når vi ikke ruge selvklebende molekyler innenfor PDMS kammeret) som belegget er derfor strengt lokalisert på bunnen av kammeret.
Bortsett fra deres utfordrende morfologi, neurons er ganske egnet til FXm skyldes det faktum at en av stor begrensning av metoden, i.e. dekstran endocytose, er svært begrenset i disse cellene. Vi velger en 10 kDa formulering å undertrykke på lang rekkevidde (timer) noen synlig endocytose fenomener.
Avslutningsvis er FXm konseptuelle enkelhet balansert av et sett med eksperimentelle problemer som er løst av nåværende protokollen, for eksempel nanometric PDMS råhet og micrometric kammeret høyde eller bakgrunn korreksjon korrigere ujevnheter i PDMS loftet mellom søyler. Men gir bruk av en tett microfluidic kammer begrense fluorescerende mediet noen spesifikke begrensninger som behovet for støtte pilarer, som senker effektivt overflaten tilgjengelig for celleadhesjon eller nødvendigheten av å ekskludere soma fra sentralt kammer å observere neuronal utvidelser med den høyeste klarheten, som begrenser regionene i cellen tilgjengelig for høy oppløsning observasjon. En mulig utviklingen av denne metoden ville være å bli kvitt denne fysiske confinement, erstattes av en optisk. Den nye utviklingen av lys ark mikroskopi kan kombineres advantageously med FXm i fremtiden.

Nøyaktig kunnskap om mobilnettet volum har fått økt oppmerksomhet de siste årene, drevet av spørsmålet om cellen størrelse homeostase encellede mikroorganismer 1 og mer generelt mitotisk celler 2. Men er spørsmålet om celle volum relevant for post mitotisk celler, som neurons utgjør en paradigmatiske eksempel.
Volumet er faktisk en viktig signatur fysiologiske og patologiske hendelsesforløpet i ulike skalaer og tid i neuronal liv, fra forbigående axonal deformasjon knyttet til elektrisk aktivitet (millisekund skala) 3 til den irreversibel neuronal hevelse forekommende i asymptomatisk fasen av nevrodegenerative sykdommer (over år hos mennesker) 4. Største volum endringen skjer imidlertid i en mellomliggende tidsskalaen for dager eller uker (avhengig av vurdert organismen) under dannes hemmer nevronal vekst. Utvidet og kompleks morfologi av neurons reiser flere spørsmål, som regulering av Cellestørrelse. Axonal lengde og diameter er faktisk strengt regulert i vivo, med verdier spesielt for hver neuronal type 5,6.
Disse problemene, komplekse å ta i vivo, kan også rettes i en forenklet måte i vitro. I dette målet, en metode dedikert til volummåling rask nok å følge vekst dynamics (dvs. i en tidsskala minutter) og kompatibel med observasjon over timer eller dager er nødvendig. Flere metoder har blitt utviklet gjennom årene for å gi en direkte eller indirekte tilgang til mobilnettet volum i vitro. Cellen rekonstruksjon fra AC confocal imaging er en av dem, men denne metoden innebærer merking og gjentatt eksponering for lys mens viser en begrenset aksial oppløsning på over 500 nm 7. Merk at disse to siste ulempene er delvis overvunnet av en mer sofistikert og siste metode kalt gitter lys arks mikroskopi 8. Atomic Force mikroskopi er brukt 9 men dette skanningsmetoden er av kjernen langsom og kjedelig. Videre kan den fysisk kontakten krever med cellen forstyrre målingen vurderer ekstreme mykheten av neurons 10. Indirekte metode impedans eller resonans har vært ansatt for ulike celle typer 11, men er utilstrekkelig for utvidet selvklebende celler som neurons.
En av de mest lovende metodene er basert på mål på ekskluderte volumet av celler i et tett kammer fylt med et fluorescerende fargestoff. Metoden for fluorescens eksklusjon (FXm) er enkel i prinsippet som det krever ingen merking, og er egnet for rask, langsiktig optisk avbilding av celle populasjoner med potensielt sub optisk aksial oppløsning. Mer presist, avhenger oppløsningen i z maksimal fluorescens intensiteten i kultur chamber (dvs. i regionen uten celler) delt dynamikkområdet på kameraet, men flere kilder til støy begrense denne ultimate oppløsningen. Denne metoden har vært svært kraftig til å følge volumet av overfører tilhenger celler 12 eller studere endringsvarsel under mitose av pattedyrceller, som grundig beskrevet i 13. Imidlertid utgjøre neurons en metodisk utfordring for FXm vurderer deres omfattende konsekvenser i sub micrometric prosesser.
Vi presenterer her en metode fører til fabrikasjon av glatt FXm kammer til med høy presisjon volumet og neuronal grener og dynamiske strukturer involvert i dannes hemmer nevronal vekst som veksten kjeglene.
Chambers bør ha lignende høyder enn objektet å mål for å optimalisere aksial oppløsning. Derfor designet vi forskjellige FXm enheter preget av sentrale måling kamre av 3 forskjellige høyder. Den tynneste (3 µm i høyden) er dedikert til neurite måling: denne lav høyde utelukker soma, som forblir i nær 15 µm høy mellomliggende kammeret. Tykkere sentrale kammer (10 og 12 µm) er tilstrekkelig høy følge hele cellevekst. Enheten inneholder også to reservoarer plassert på hver side av det sentrale kammeret. Fire injeksjon hull (IH) implementeres dermed og er angitt som følger: innløp og utløp tjene til å innføre av mobilnettet suspensjon i chip, mens de to andre feed reservoarene.
Vi har første fabrikkerte kalibrering coverslips for høyde målinger ved hjelp av photoresist strukturer av kjente geometri. Vi har deretter fotografert gratis voksende nerveceller, men også morphologically begrenset nerveceller i micropatterns av vedheft.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmalab System 100</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td></td>
			<td>To perform DRIE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MJB4 mask aligner</td>
			<td>SUSS MicroTec</td>
			<td></td>
			<td>SU-8 photolithography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NXQ 4006 Mask aligner</td>
			<td>Neutronix Quintel</td>
			<td></td>
			<td>Photolithography associated to DRIE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>Diener Electronic</td>
			<td>Pico PCCE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture hood</td>
			<td>ADS Laminaire</td>
			<td>Optimale 12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Heraeus Multifuge X1R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator 37 &#176;C 5% CO2</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MCO-170AICUVH-PE IncuSafe CO2 Incubator</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescence microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMi8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS Oven between 65 and 80 &#176;C</td>
			<td>Memmert</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mechanical profilometer</td>
			<td>Veeco</td>
			<td>Dektak 6M Stylus Profiler</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical profilometer</td>
			<td>Veeco</td>
			<td>Wyko NT9100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum desiccator</td>
			<td>Verrerie Villeurbanaise (Kartel Labware)</td>
			<td>230KAR</td>
			<td>Diameter 200 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic bath sonicator</td>
			<td>Labo Moderne</td>
			<td>SHE1000</td>
			<td>Volume of the bath: 0.8 liter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hotplate</td>
			<td>Stuart SD162</td>
			<td>SD162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DRIE</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Supplementary data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Su8 Mask 1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Supplementary data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Su8 Mask 2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Supplementary data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Su8 Mask 3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Supplementary data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S1805 calibration stripes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Supplementary data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small laboratory equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mm hole puncher</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>29002519 (US reference)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel or razor blade</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9&#34; Stainless Steel Flat Spatula with Spoon</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>82027-532</td>
			<td>To demold PDMS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Top Lip Wafer Handling</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>63042-096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved tweezer</td>
			<td>FST</td>
			<td>Dumont #7 Forceps - Standard / Dumoxel</td>
			<td>To manipulate glass coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Substrates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer</td>
			<td>Prolog Semicor Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24x24 mm glass coverslips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoresists and developpers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AZ 1518 positive photoresist</td>
			<td>Microchemicals GmbH</td>
			<td></td>
			<td>Before DRIE process, thicknes 1.8 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AZ 351B developer</td>
			<td>Microchemicals GmbH</td>
			<td></td>
			<td>To develop positive AZ 1518 photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 2007</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 2025</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 2050</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PGMA developer</td>
			<td>Technic</td>
			<td></td>
			<td>To develop SU-8 negative photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microposit S1805 resist</td>
			<td>Chimie Tech Services</td>
			<td></td>
			<td>Positive photoresist used to obtain 0.5&#181;m high structures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MF 26A developer</td>
			<td>Chimie Tech Services</td>
			<td></td>
			<td>To develop positive S1805 photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory consumables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable plastic pipette 3 mL</td>
			<td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P100 Petri dishes</td>
			<td>TPP</td>
			<td>93100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL syringe</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>SS+20ES1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transparent scotch tape</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square wipes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>115-2148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>DUTSCHER</td>
			<td>90260</td>
			<td>Plastic paraffin film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(3-Methacryloxypropyl)trichlorosilane</td>
			<td>abcr</td>
			<td>AB 109004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS and curing agent Sylgard 184</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>761036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isopropanol</td>
			<td></td>
			<td>W292907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly-ornithine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4957 - 50 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>02865</td>
			<td>99.8%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-methacryloxypropyl-trimethoxysilane</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>M6514-25ML</td>
			<td>(C4H5O2)-(CH2)3- Si(OCH3)3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acetic acid</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>71251-5ML-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran 10kW conjugated with Alexa488</td>
			<td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td>
			<td>D22910</td>
			<td>Absoprtion at 488 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran 10kW conjugated with Alexa647</td>
			<td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td>
			<td>D22914</td>
			<td>Absoprtion at 647 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM</td>
			<td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td>
			<td>21090-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td>
			<td>26050088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td>
			<td>12587-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax 200 mM</td>
			<td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate GIBCO 100 mM</td>
			<td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td>
			<td>15710-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS 10x</td>
			<td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td>
			<td>14180-046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes 1M</td>
			<td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td>
			<td>15630-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trypsin-EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>59418C-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal</td>
			<td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal without phenol red</td>
			<td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td>
			<td>12348-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Softwares</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Routine in Matlab for background normalization</td>
			<td>Quantacell</td>
			<td>Contact Victor Racine: victor.racine@quantacell.com</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To select specific ROI for image analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Routine</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td>Supplementary data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Routine</td>
			<td>Matlab</td>
			<td></td>
			<td>Supplementary data</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-resolution volume imaging of neurons by the use of fluorescence exclusion method and dedicated microfluidic devices

Volumet er en viktig parameter om fysiologiske og patologiske kjennetegner neurons på forskjellige tidsskalaer. Neurons er ganske unikt celler om deres utvidet ramified morphologies og dermed øke flere metodiske utfordringer for volummåling. I tilfellet av i vitro dannes hemmer nevronal vekst, bør valgte metodikken inkludere sub micrometric aksial oppløsning kombinert med full-feltet observasjon på tidsskalaer fra minutter til timer eller dager. I motsetning til andre metoder som cellen figur rekonstruksjon AC confocal imaging, elektrisk-baserte målinger eller Atomic Force mikroskopi, har nylig utviklet fluorescens utelukkelse metoden (FXm) potensial til å oppfylle disse utfordringene. Men selv om å være enkel i prinsippet, krever implementering av en høyoppløselig FXm for neurons flere justeringer og en dedikert metodikk. Vi presenterer her en metode basert på kombinasjonen av fluorescens eksklusjon, lav-grovheten flere avdelinger microfluidic enheter og til slutt micropatterning å oppnå i vitro målinger av lokale neuronal volum. Den høye oppløsningen gitt av enheten tillot oss å måle lokale volumet av neuronal prosesser (neurites) og volumet av noen spesifikke strukturer involvert i dannes hemmer nevronal vekst, som veksten kjeglene (GCs).

Resultatet av prosessen med fabrikasjon beskrevet i delene 1 og 2 er illustrert av bilder av figur 1A-1B og kurven med figur 1 c. Tabellen i figur 1 d viser grovheten verdiene av to forskjellige representative områdene PDMS chip, dvs i central og 20 µm høy neste mellomliggende kammeret. En nedgang i grovhet med en faktor på ca 7 er innhentet ved hjelp av etset Si wafer i stedet for SU-8 photoresist. Deretter ble FXm først brukt på en photoresist stripe av kjente geometri (figur 2A) innen en 10 µm høy kammer. Etter bildebehandling og intensitet til høyde konvertering (se grafen til figur 2B), FXm profiler på tverrsnitt langs denne stripe (figur 2C) gi ønsket høyde profilene (figur 2D). Figur 2D viser sammenligningen mellom profiler får mekanisk profilometry og FXm metoder. Disse profilene, inkludert kanten og platå verdi, er svært like, validere metoden. Spredning av FXm data er ikke representative for full oppløsning metoden som ytterligere vurdert i Figur 3 og Figur 4, men resultatene fra den lave intensiteten ansatt for å unngå en mulig effekt av den meget svakt Auto-fluorescens av photoresist i GFP kanalen.
Så observerte vi neurites i 3 µm og 10 µm høy chambers (Figur 3). Standardavviket for bakgrunnsstøy er 18 nm etter intensitet høyde konvertering og bakgrunn rettingen. Denne verdien er litt høyere enn fysisk grovheten på PDMS overflater støpt på silisium overflater (12 nm, se tabellen i figur 1 d) men mye lavere enn grovheten målt på PDMS innhentet fra SU-8 former. Disse resultatene markere merverdien av boring i silisiumskiver i stedet for å åpne hull i SU-8 photoresist å kaste søyler. Så lav verdi gir en høy signal til støyforhold og svært klare bilder i volum som det som vises i figur 3A. Som et eksempel på dataene som kan hentes fra slike bilder, vi beregnet volumet av 1.6 µm (dvs. 10 piksler) bredt neurite skjær (se grafen til figur 3B). Bruke i en første tilnærming en lineær tilpasning av disse dataene gir mening neurite høydeverdien om 400 nm, sammenlignes med f.eks 500-nm axonal diameter funnet i 10 dager gamle pups i corpus callosum 5. Vi også kombinert FXm med micropatterns av vedheft serielt abutted 2 µm og 6 µm Sjøstriper på 30 µm i lengde. Vårt mål var å studere påvirkning av neurite bredden på formen 3D. Figur 3 c viser en 3D representasjon i falske farger av en hel Nevron bilde innhentet i en 10 µm høy kammer. Neurites sprer seg på 2 µm og 6 µm Sjøstriper, mens soma ligger på enden av den største stripen. Høyde profiler ble trukket i tre forskjellige tverrsnitt. I sammenheng med diagrammet vises i figur 3A, integrert overflaten over tverrsnitt øke med neurite bredden (figur 3D).
Vi har også fokusert på vekst membran (GC) 3D strukturer. Figur 4 A-B viser to forskjellige GC profiler innhentet i en 3 µm høy kammer, som markere forgrenet sub strukturen. I tillegg utført vi time-lapse eksperimenter for å følge dynamikken i volumet av GCs i en 12 µm høy kammer. Figur 4C viser en syklus av krymping og reaktivering av et gitt GC innenfor en tidsskala på noen titalls minutter. Gjennom bruk av GFP-lifeact mus, veksten kjeglene ble lokalisert i GFP utslipp bølgelengde (510 nm) fra deres høy begrepsordbok konsentrasjon. Overflaten identifisert på bølgelengde ble brukt til å integrere over dekstran utslipp bølgelengde på 647 nm å beregne GC volum. Figur 4 d viser endelig fordeling av GC volumet på forskjellige tidspunkt og sted på tre ulike neurons, sentrert på en verdi av ca 6 µm3.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56923/56923fig1v2.jpg"> Figur 1: FXm PDMS kamre. (A) ordninger for de fire ulike viktigste trinnene i microfabrication fører til siste mold. Plasseringen av innløp og utløp reservoarene er angitt. Skalere barer: 1 mm. (B) bilde av PDMS FXm kammeret får en optisk profilometer. Dette bildet viser sentrale kammeret som inneholder 3 rader 10 µm høye søyler og mellomliggende chambers på 20, 50 og 90 µm i høyden. Skala bar: 500 µm. (C) tverrsnittvisningen av chip langs to stiplede linjer trukket i (B). Gul/gull: tverrsnitt langs pilarer, blå: tverrsnitt mellom søyler. (D) at verdiene for PDMS grovheten målt på 50 × 50 µm2 områder støpt på silisium og på 20 µm høy SU-8 mellomliggende kammeret (se pilene for plasseringen av disse områdene). Mean verdier Hentet fra målinger av tre forskjellige områder. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/56923fig1v2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56923/56923fig2.jpg"> Figur 2: kalibrering av FXm metoden bruker en photoresist stripe som gjenstand for interesse. (A) GFP-fluorescens bilde tatt i en 10 µm høy kammer fylt med 10 000 MW dekstran absorberende på 488 nm på 1 mg/mL. (B: bakgrunn, P: søyle). Observasjon med en tørr 40 X NA 0,8 mål. Skala bar: 50 µm. (B) lineær kalibrering lov innhentet fra mener intensiteten av de to fargede rektanglene i A. (C) fluorescens intensitet profil på nivået på den blå stiplet linjen vises i (A), krysset photoresist stripe (0,45 µm høy positiv photoresist). (D) sammenligning av profiler Hentet fra mekaniske profilometer (svarte prikker) og FXm etter intensitet til høyde konvertering av data i (B) (blå prikker). <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/56923fig2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56923/56923fig3.jpg"> Figur 3: Neurite volum bildebehandling. (A) Neurite strekker seg inn i sentrale 3 µm høy kammeret fra soma ligger i neste 15 µm mellomliggende kammeret. Bildebehandling utført med 10 000 MW dekstran absorberende på 488 nm og en 40 X, NA 0,8 tørr mål. Rammemargen innhentet etter bruk av bakgrunnen reduksjon rutinemessig høydepunktene de to neurites og valgte å plotte grafen til høyre. Skalere barer: 30 µm. (B) Neurite skive volum som en funksjon av neurite bredde innhentet fra 22 profiler (gjennomsnitt på 10 bildepunkter, dvs på en 1.6 µm "neurite del") vises i (A). Den heltrukne linjen representerer en lineær tilpasning av skråningen 0,4 µm passerer gjennom origo. (C) falske fargebilde av en mønstret Nevron på en selvklebende stripe laget av påfølgende 2 µm og 6 µm bredt stubber (representert i hvitt). Målinger ble gjort i en 10 µm høy kammer fylt med 10 000 MW dekstran absorberende på 647 nm og bruker en 40 x NA 0,8 tørr mål. (D) høyde profiler for de fargede stiplede linjene vises i (C), holde samme fargekode. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/56923fig3large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56923/56923fig4.jpg"> Figur 4: statisk og dynamisk vekst kjegle bildebehandling. (AB) Vekst kjegle høyde profiler oppnådd i en 3 µm høy kammer etter intensitet til høyde konvertering retning gul vises i tilknyttede bildene. Observasjon utført med fyll med 10 000 MW dekstran absorberende på 488 nm og en 40 X, NA 0,8 tørr mål. (C) hele Nevron imaging i en 12 µm høy kammer fylt med 10 000 MW dekstran absorberende på 647 nm. Observasjoner er gjort i to fluorescerende kanaler: GFP for vekst kjegle lokalisering (stiplet gul linje) og CY5 til å beregne GC volum fra fluorescens eksklusjon. Overflaten inkludert av stiplede gule linjer ble brukt til å beregne GC volum. Diagrammet viser variasjonen av GC volum over tid, og tilknyttede morphologies i både GFP og CY5 kanaler på to representant ulike tidspunkt. Alle data ble kjøpt med en 40 x NA 0,8 tørr mål hver 3 min. skala barer: 10 µm. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/56923fig4large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Trinn</td>
			<td>Maskere 1:8 µm laget</td>
			<td>Maske 2:30 µm lag</td>
			<td>Maske 3:40 µm lag</td>
		</tr>
<tr>
<td>SU-8 type</td>
			<td>2007</td>
			<td>2025</td>
			<td>2050</td>
		</tr>
<tr>
<td>Spincoating</td>
			<td>30 s @ 2000 rpm</td>
			<td>30 s @ 3050 rpm</td>
			<td>30 s @ 3250 rpm</td>
		</tr>
<tr>
<td>Myk bake</td>
			<td>3 min @ 95 ° C</td>
			<td>2 min @ 65 ° C + 6 min @ 95 ° C</td>
			<td>3 min @ 65 ° C + 7 min @ 95 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Eksponering energi</td>
			<td>110 mJ/cm2
</td>
			<td>155 mJ/cm2
</td>
			<td>170 mJ/cm2
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Etter eksponering bake</td>
			<td>4 min @ 95 ° C</td>
			<td>1 min @ 65 ° C + 6 min @ 95 ° C</td>
			<td>2 min @ 65 ° C + 7 min @ 95 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Utvikling</td>
			<td>2 min 30 s</td>
			<td>5 min</td>
			<td>6 min</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hard bake (valgfritt)</td>
			<td>3-5 minutter @ 200 ° C</td>
			<td>3-5 minutter @ 200 ° C</td>
			<td>3-5 minutter @ 200 ° C</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1: klima og jordsmonn fremgangsmåten utført for å bygge et apparat som inneholder en sentral kammer av 12 μm høyde. Høyder av mellomliggende kamre: 20, 50 og 90 µm.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Trinn</td>
			<td>Maske 1:10 µm lag</td>
			<td>Maske 2:30 µm lag</td>
			<td>Maske 3:40 µm lag</td>
		</tr>
<tr>
<td>SU-8 type</td>
			<td>2007</td>
			<td>2025</td>
			<td>2050</td>
		</tr>
<tr>
<td>Spincoating</td>
			<td>30 s @ 1500 rpm</td>
			<td>30 s @ 3050 rpm</td>
			<td>30 s @ 3250 rpm</td>
		</tr>
<tr>
<td>Myk bake</td>
			<td>3 min @ 95 ° C</td>
			<td>2 min @ 65 ° C + 6 min @ 95 ° C</td>
			<td>3 min @ 65 ° C + 7 min @ 95 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Eksponering energi</td>
			<td>125 mJ/cm2
</td>
			<td>155 mJ/cm2
</td>
			<td>170 mJ/cm2
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Etter eksponering bake</td>
			<td>4 min @ 95 ° C</td>
			<td>1 min @ 65 ° C + 6 min @ 95 ° C</td>
			<td>2 min @ 65 ° C + 7 min @ 95 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Utvikling</td>
			<td>2 min 30 s</td>
			<td>5 min</td>
			<td>6 min</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hard bake (valgfritt)</td>
			<td>3-5 minutter @ 200 ° C</td>
			<td>3-5 minutter @ 200 ° C</td>
			<td>3-5 minutter @ 200 ° C</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 2: klima og jordsmonn fremgangsmåten utført for å bygge et apparat som inneholder en sentral kammer av 10 μm høyde. Høyder av mellomliggende kamre: 20, 50 og 90 µm.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Trinn</td>
			<td>Maske 1:12 µm lag</td>
			<td>Maske 2:32 µm lag</td>
			<td>Maske 3:40 µm lag</td>
		</tr>
<tr>
<td>SU-8 type</td>
			<td>2015</td>
			<td>2025</td>
			<td>2050</td>
		</tr>
<tr>
<td>Spincoating</td>
			<td>30 s @ 3250 rpm</td>
			<td>30 s @ 2500 rpm</td>
			<td>30 s @ 3250 rpm</td>
		</tr>
<tr>
<td>Myk bake</td>
			<td>3 min @ 95 ° C</td>
			<td>2 min @ 65 ° C + 5 min @ 95 ° C</td>
			<td>3 min @ 65 ° C + 7 min @ 95 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Eksponeringstid</td>
			<td>140 mJ/cm2
</td>
			<td>157 mJ/cm2
</td>
			<td>170 mJ/cm2
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Etter eksponering bake</td>
			<td>4 min @ 95 ° C</td>
			<td>1 min @ 65 ° C + 5 min @ 95 ° C</td>
			<td>2 min @ 65 ° C + 7 min @ 95 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Utvikling</td>
			<td>3 min</td>
			<td>5 min</td>
			<td>6 min</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hard bake (valgfritt)</td>
			<td>3-5 minutter @ 200 ° C</td>
			<td>3-5 minutter @ 200 ° C</td>
			<td>3-5 minutter @ 200 ° C</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 3: klima og jordsmonn fremgangsmåten utført for å bygge et apparat som inneholder en sentral Mysteriekammeret 3 μm høyde. Høyder av mellomliggende kamre: 18, 50 og 90 µm.
Utfyllende data 1: masks_neuron_volume_chips.tiff. Skjematisk visning av masker brukt å dikte PDMS enheten (DRIE maske og masker 1-3). <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/masks_neuron_volume_chips.tiff">Klikk her for å laste ned denne filen.</a>
Utfyllende data 2: filen "masks_neuron_volume_chips.dxf". Elektroniske filer tillater for å dikte DRIE masken og masker 1-3. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/masks_neuron_volume_chips.dxf">Klikk her for å laste ned denne filen.</a>
Utfyllende data 3: "Mask_Photoresist-stripes.dxf". Elektroniske filer tillater for å dikte masken brukes til klima og jordsmonn av photoresist striper. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/Mask_Photoresist-stripes.dxf">Klikk her for å laste ned denne filen.</a>
Utfyllende data 4: fil conversion_mattotiff.m <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/conversion_mattotiff.m">Klikk her for å laste ned denne filen.</a>
Utfyllende data 5: fil importfilevol.m <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/importfilevol.m">Klikk her for å laste ned denne filen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about High-resolution Volume Imaging of Neurons by the Use of Fluorescence eXclusion Method and Dedicated Microfluidic Devices at JoVE.com

High-resolution Volume Imaging of Neurons by the Use of Fluorescence eXclusion Method and Dedicated Microfluidic Devices

Volumet er en viktig parameter om fysiologiske og patologiske kjennetegner celler. Vi beskriver en fluorescerende utelukkelse metode tillater full-feltet mål i vitro neuronal volum med sub micrometric aksial oppløsning kreves for analyse av neurites og dynamiske strukturer underforstått i dannes hemmer nevronal vekst.

Høyoppløselig volum Imaging av Neurons ved bruk av fluorescens uttrekk metoden og dedikert Microfluidic enheter

Volume is an important parameter regarding physiological and pathological characteristics of neurons at different time scales. Neurons are quite unique ...

The overall goal of this procedure is to allow full field measurement of in vitro neuronal volume with submicrometric axial resolution required for the analysis of neurites in dynamic structures implied in neuronal growth. This method can help answer key questions in the field of cellular neuroscience regarding the dynamics of volume changes at the subsididal scale during the nongrowth or axon degeneration. The main advantage of this technique is that it provides submicrometric axial resolution combined with full fit observation and time scale to hours or days.To begin the procedure, demold the PDMS block under a chemical hood by pouring isopropanol on it. Next, place it on the stainless steel bench of the hood. Cut around the silicone wafer and demold the PDMS replica.Then, cut around the chip and leave a two millimeter margin using a scalpel or a razor blade. Punch the inlet by pressing the 1.5 millimeter diameter puncher firmly and actuate it in order to cut and carve the hole of the inlet. Do the same at the four dedicated zones of the chip where liquid will be injected.Afterward, clean the chip by sticking and peeling the adhesive tape on the microstructured side. Sprinkle isopropanol on both sides. Then, dry the chip with pressurized nitrogen using an air blow gun.In this procedure, place each coverslip on a spin-coater located in a clean room environment. Apply a drop of the positive photoresist to cover about 75%of the coverslip and spin-coat at 4000 rpm for 30 seconds to reach a final thickness of 0.45 micrometer. Place the coverslips on a hotplate with a surface temperature of 115 degrees Celsius for one minute.Using a mask aligner, expose each coverslip at a wavelength of 435 nanometer through the dedicated mask according to the fabricant parameters. Next, prepare two glass crystallizing dishes, one containing the developer without dilution, the other containing deionized water. Dip the coverslips one by one in the developer for one minute while continuously and gently stirring the crystallizing dish.Then, submerge the wafer in deionized water for about five seconds. Transfer the wafer to an absorbent paper and dry it with pressurized nitrogen using an air blow gun. Place both the PDMS chip and the glass dish on which it will be bonded into the plasma chamber for surface activation.Next, deposit a drop of water on a rectangular thick microscope glass slide and stick the coverslip on the glass slide by capillarity. Under a microscope, mark the location of the photoresist stripes at the rear of the glass slide. Place the patterned glass coverslip on the mask holder of the mask aligner.Rely on the mark made to center the photoresist reference objects. To increase the optic contrast, place a silicon wafer beneath the PDMS chip. The silicon wafer should remain firmly attached on the chuck during the alignment process.Then, place the PDMS chip on the mobile substrate holder of the mask aligner. Subsequently, lift the chuck enough to visualize both the chip and the array of photoresist stripes located on the coverslip while staying behind the mechanical contact. Perform alignment and achieve mechanical contact between the chip and the coverslip by lifting the chuck until the surface of PDMS pillars touches the glass coverslip.After that, lower the chuck. Remove the coverslip bonded to the chip from the mask holder. Then, place the device into a 35 millimeter Petri dish and transfer everything into the oven for five to ten minutes to increase the bonding strength.Thirty minutes after bonding, place a ten microliter pipette tip filled with PLO solution at the inlet. Then, load the liquid until forming a drop on top. Repeat the same operation at the outlet and reservoirs.Subsequently, add PBS in the Petri dish all around the chip. Seal the Petri dish with a paraffin film and incubate at room temperature with a minimum of five hours. Then, press a ten microliter tip cone lightly into each injection hole and suck up the excess liquid.Next, replace PLO as well as the PBS surrounding the chip by the culture medium. Afterward, place the chip in the incubator regulated at 37 degrees Celsius and 5%carbon dioxide until neurons seed with a minimum of five hours incubation time. In this procedure, draw up the culture medium from the chip.Collect two to three microliters of the freshly resuspended cell solution and inject it at the inlet. Immediately repeat the same operation at the outlet. Inject about the same volume of culture medium in each reservoir.Quickly observe the chip under the microscope to check the density of the cells. The order of magnitude of the optimal cell density corresponds to about five to ten cells within the square surface delimited by four pillars. Repeat the procedure of injection of 0.5 to 1 microliter of cell suspension to reach the targeted cell density.For imaging, replace the culture medium with the imaging medium. Then, place the chip under an epifluorescence microscope. Acquire images of cells from single to multiple successive images in case of time-lapse experiments.Shown here are the representative observations of a calibration photoresist stripe and neurons. Higher magnification images and cross-sections of these objects are displayed on the right. The representative neurites and a three micrometer high central chamber are shown here.The volume of neurite slice can be computed as a function of neurite width. And here are the representative growth cones and a three micrometer high central chamber. Their substructures emerge clearly from an optical background noise of about 20 nanometers.Time-lapse observations of life act neurons seeded into a 12 micrometer high chamber to follow the cycle of shrinking and reactivation of the growth cone within a time scale of a few tens of minutes. While attempting this procedure, it's important to have an access to a deep ion etching equipment to fabricate the silicon mud. After watching this video, you should have a good understanding of how to align a structured glass coverslip with a PDMS chip.Once mastered, this technique can be reproducibly applied to the quantification of neurology in 3d. This technique paved the way for researchers in the field of pharmacology to explore the effect of various drugs with actual caliber all in closed cone shape. Don't forget that working with primary neurons require a lot of care to avoid contamination and shatters.Be always gentle and quick when changing media in order to limit the time they spend outside incubator.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

An Organotypic Slice Assay for High-Resolution Time-Lapse Imaging of Neuronal Migration in the Postnatal Brain

Neurogenesis in the postnatal brain depends on maintenance of three biological events: proliferation of progenitor cells, migration of neuroblasts, as ...

A Rapid Approach to High-Resolution Fluorescence Imaging in Semi-Thick Brain Slices

A fundamental goal to both basic and clinical neuroscience is to better understand the identities, molecular makeup, and patterns of connectivity that are ...

High-resolution Functional Magnetic Resonance Imaging Methods for Human Midbrain

Høyoppløselige funksjonell magnetisk resonans imaging metoder for Human midbrain

Functional MRI (fMRI) is a widely used tool for non-invasively measuring correlates of human brain activity. However, its use has mostly been focused upon ...

High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

Høy oppløsning Live-Imaging of Cell Behavior i utviklingsland Neuroepithelium

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central ...

Analysis of Developing Tooth Germ Innervation Using Microfluidic Co-culture Devices

Analyse av Utvikling Tooth Germ Innervasjon Bruke mikrofluid Co-kultur Devices

Innervation plays a key role in the development, homeostasis and regeneration of organs and tissues. However, the mechanisms underlying these phenomena ...

High-resolution Structural Magnetic Resonance Imaging of the Human Subcortex In Vivo and Postmortem

High-resolution Structural Magnetic Resonance Imaging of the Human Subcortex In Vivo and Postmortem

Høyoppløselig Structural Magnetic Resonance Imaging of Human subcortex<I&gt; I Vivo</I&gt; Og Post mortem

The focus of this study was to test the resolution limits of structural MRI of a postmortem brain compared to living human brains. The resolution of ...

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Fluorescens og Bioluminesens Imaging av subcellulære Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; I Aged hippocampus nevroner

Susceptibility to neuron cell death associated to neurodegeneration and ischemia are exceedingly increased in the aged brain but mechanisms responsible ...

High-Resolution Quantitative Immunogold Analysis of Membrane Receptors at Retinal Ribbon Synapses

Høy oppløsning Kvantitativ immungull Analyse av membranreseptorer på retina Ribbon Synapses

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA ...

Imaging Neurons within Thick Brain Sections Using the Golgi-Cox Method

Imaging Nerveceller innenfor Tykke hjernesnitt Bruke Golgi-Cox Method

The Golgi-Cox method of neuron staining has been employed for more than two hundred years to advance our understanding of neuron morphology within ...

High-resolution Confocal Imaging of the Blood-brain Barrier: Imaging, 3D Reconstruction, and Quantification of Transcytosis

Høyoppløselig AC Confocal avbildning av blod - hjerne barrieren: bildebehandling, 3D rekonstruksjon og kvantifisering av Transcytosis

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic multicellular interface that regulates the transport of molecules between the circulation and the brain. ...