Name: high-resolution volume imaging of neurons by the use of fluorescence exclusion method and dedicated microfluidic devices
Uploaded: 2018-03-26T12:30:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-resolution Volume Imaging of Neurons by the Use of Fluorescence eXclusion Method and Dedicated Microfluidic Devices at JoVE.com

Os autores querem reconhecer ChiLab, materiais e laboratório Microsystems - Politecnico di Torino - DISAT, na pessoa do Prof C F Pirri, Dr. M Cocuzza e Dr. S L Marasso, pelo seu precioso apoio no processo de desenvolvimento e fabricação de dispositivo. Agradecemos Victor Racine de Quantacell para discussão e suporte no processamento de imagem. Estamos gratos a Isabelle Grandjean e Manon Chartier da instalação de Animal do Institut Curie para sua sustentação para os ratos e Pablo Vargas e Ana-Maria Lennon (Institut Curie) para nos fornecer com os ratos de GFP LifeAct. Estamos gratos à Olivier Thouvenin do Institut Langevin e Clotilde Cadart, Larisa Venkova e Matthieu Piel do Institut Curie - UMR 144, por sua ajuda na compreensão da exclusão da fluorescência método. Finalmente, agradecemos a plataforma tecnológica do Institut Pierre-Gilles de Gennes (CNRS UMS 3750) pelo seu apoio em microfabrication. Este trabalho foi financiado em parte pelo Europeu pesquisa Conselho Advanced Grant no. 321107 "Violoncelo", Université de PSL (projeto SwithNeuroTrails), d'Avenir ANR Investissement e o Labex IPGG e Equipex.

<ol>
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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+graphene+based+nanocomposite+for+application+in+3D+flexible+micro-supercapacitors.">A novel graphene based nanocomposite for application in 3D flexible micro-supercapacitors.</a> Materials Research Express. 3 (6), 065001 (2016).</li><li>Welch, C. C., Goodyear, A. L., Wahlbrink, T., Lemme, M. C., Mollenhauer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silicon+etch+process+options+for+micro-and+nanotechnology+using+inductively+coupled+plasmas.">Silicon etch process options for micro-and nanotechnology using inductively coupled plasmas.</a> Microelectronic Engineering. 83 (4), 1170-1173 (2006).</li><li>Fath, T., Ke, Y. D., Gunning, P., G&#246;tz, J., Ittner, L. 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Os autores declaram não haverá conflito de interesses.

Imagem de volume de neurônios constitui um desafio para a técnica de FXm devido as longas e finas extensões dessas células. Este protocolo descreve as variantes do mesmo tipo de dispositivo microfluidic dedicado a imagem latente do neurônio.
Ao lado os aspectos do design microfluídicos, a escolha do objetivo é fundamental para a imagem latente de exclusão de fluorescência e implica um trade-off entre resolução lateral e a nitidez da imagem. Tem sido demonstrado em 13 que um at alta, levando a uma profundidade de foco menor do que a altura da câmara não foi prejudicial para a precisão de medição de volume se a imagem foi executada em foco e se é deixada uma margem suficiente entre o contorno do objeto de nterest e os limites da superfície de integração. No entanto, o uso de uma câmara muito maior do que a profundidade de foco prejudica a clareza de imagem devido à difusão de fótons, que suaviza as bordas dos objetos de interesse. A fabricação de uma câmara alta 3 µm reduzida a essa indefinição lateral e forneceu imagens de exclusão fluorescente excepcionalmente bem definidas mesmo usando alta at 40 (0,8) X objetivos Visualizar neuronais ramos com alta resolução lateral.
Chip de montagem é uma etapa crítica, em particular no caso de 3 µm câmaras altas, mas manipulação cuidadosa conforme descrito no ponto 4.1.2 evita o colapso do telhado. A superfície elevada à relação do volume associada a estas câmaras finas também levantou a questão da estabilidade da concentração de dextrano ao longo do tempo. Temos verificado que a superfície absorção do Dextran após uma noite de incubação foi insignificante: depois de substituir o Dextran pela PBS, a diferença de intensidade entre o pilar e o plano de fundo foi cerca de 1 por 1000 do contraste entre a intensidade inicial Estas duas regiões na presença de dextrano. Note-se que os neurônios podem aderir na lamela inferior e o telhado de PDMS. Este efeito desaparece quando usando estampadas lamelas (ou seja, quando nós não incubar adesivas moléculas dentro da câmara PDMS), como o revestimento, portanto, é estritamente localizado na parte inferior da câmara.
Além de sua morfologia desafiador, os neurônios são bastante adequados para FXm devido ao fato de que dentre a grande limitação do método, ou seja, endocitose de dextrano, é muito limitado nestas células. Nós escolhemos um 10 kDa formulação para suprimir a longo alcance (horas) qualquer fenômeno visível endocitose.
Em conclusão, a simplicidade conceitual do FXm é equilibrada por um conjunto de questões experimentais que foram resolvidos pelo presente protocolo, como nanométrica aspereza PDMS e altura de câmara micrométrica ou correcção de fundo para corrigir o desnível de o teto de PDMS entre pilares. No entanto, o uso de uma câmara estreita microfluidic confinar o meio fluorescente produz alguns condicionalismos específicos, como a necessidade de pilares de apoio, que reduz a superfície eficaz disponível para adesão celular, ou a necessidade de excluir a soma da central Câmara de observar neuronais extensões com a maior clareza, o que restringe as regiões da célula acessível à observação de alta resolução. Uma possível evolução desse método seria para se livrar deste confinamento físico, a ser substituído por um óptico. O novo desenvolvimento da microscopia de luz folha pode ser combinado vantajosamente com FXm no futuro.

O conhecimento preciso do volume celular tem atraído maior atenção nos últimos anos, impulsionada pelo problema da homeostase de tamanho de célula em microorganismos unicelulares 1 e, mais geralmente, em células mitóticas 2. No entanto, a questão do volume das células é pertinente também para células pós mitóticas, para o qual os neurônios constituem um exemplo paradigmático.
Volume é de fato uma importante assinatura de eventos fisiológicos e patológicos em diferentes escalas e pontos de tempo na vida neuronal, da deformação de axonal transitória associada à atividade elétrica (escala de milissegundos) 3 para o irreversível neuronal inchaço ocorrendo durante a fase assintomática da Neurodegenerativas Doenças (ao longo de anos em humanos) 4. No entanto, a maior alteração de volume ocorre em uma escala de tempo intermediário de dias ou semanas (dependendo do organismo considerado) durante o crescimento neuronal. A prolongada e complexa morfologia de neurônios levanta questões de múltiplos, entre os quais a regulação do tamanho da célula. Diâmetro e comprimento axonal são na verdade firmemente regulado na vivo, com valores específicos para cada tipo neuronal 5,6.
Estas questões, complexos de abordar na vivo, também podem ser abordadas de uma forma simplificada in vitro. Com esse objetivo, um método dedicado à medição de volume rápido suficiente para acompanhar a dinâmica de crescimento (ou seja, em uma escala de tempo de minutos) e compatível com a observação ao longo de horas ou dias é necessária. Vários métodos têm sido desenvolvidos ao longo dos anos para proporcionar um acesso directo ou indirecto ao volume celular in vitro. Célula de reconstrução de imagem latente confocal é um deles, mas este método implica a rotulagem e repetidas exposições à luz ao mesmo tempo mostrando uma resolução axial limitada de cerca de 500 nm 7. Note que estes dois últimos inconvenientes são parcialmente superados por um método mais sofisticado e mais recente chamado retículo microscopia de luz-folha 8. Microscopia de força atômica tem sido usado 9 , mas este método de varredura é por essência lenta e tediosa. Além disso, o contato físico com a célula requer pode interferir com a medição Considerando a extrema suavidade dos neurônios 10. Método indireto usando impedância ou ressonância têm sido empregadas para 11tipos de célula diferente, mas são insuficientes para estendido adesivas células como os neurônios.
Um dos métodos mais promissores baseia-se na medida do volume excluído das células em uma câmara de perto com um corante fluorescente. O método de exclusão de fluorescência (FXm) é simples no seu princípio, pois requer sem rotulagem e é apropriado para a imagem latente ótica rápido, a longo prazo, de populações de células com uma resolução axial potencialmente sub óptica. Mais precisamente, a resolução em z depende da intensidade de fluorescência máxima na cultura câmara (ou seja, na região desprovida de células) dividida pela faixa dinâmica da câmera, embora várias fontes de ruído limitam esta resolução final. Este método tem sido muito poderoso a seguir o volume da migração de células aderentes 12 ou para estudar a mudança de volume durante a mitose de células de mamíferos, como exaustivamente descrito em 13. No entanto, os neurônios constituem um desafio metodológico para FXm considerando sua extensa ramificação em processos sub micrométricas.
Apresentamos aqui um método que conduz para a fabricação das câmaras de FXm suaves acesso com alta precisão o volume e altura de ramificações neuronais e estruturas dinâmicas envolvidas em crescimento neuronal, como cones de crescimento.
Câmaras devem ter alturas semelhantes que o objeto para medir a fim de otimizar a resolução axial. Portanto, nós projetamos dispositivos diferentes do FXm caracterizados por câmaras de medição central de três alturas diferentes. O mais fino (3 µm de altura) dedica-se à medição do axônio: esta baixa altura exclui a soma, que permanecem na próximo câmara intermediária alta 15 µm. Câmaras de centrais mais espessas (10 a 12 µm) são suficientemente altas para acompanhar o crescimento de células inteiras. O dispositivo também inclui dois reservatórios localizados em ambos os lados da câmara central. Quatro furos de injeção (IH), portanto, são implementados e são designados como segue: a entrada e saída servem para introduzir as suspensões celulares no chip, Considerando que os dois outros alimentam os reservatórios.
Temos a primeira calibração fabricados lamelas para medições de altura, usando estruturas de fotorresiste da geometria conhecida. Nós então ter fotografado livre neurônios crescentes, mas também morfologicamente restrito neurônios em micropatterns de adesão.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmalab System 100</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td></td>
			<td>To perform DRIE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MJB4 mask aligner</td>
			<td>SUSS MicroTec</td>
			<td></td>
			<td>SU-8 photolithography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NXQ 4006 Mask aligner</td>
			<td>Neutronix Quintel</td>
			<td></td>
			<td>Photolithography associated to DRIE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>Diener Electronic</td>
			<td>Pico PCCE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture hood</td>
			<td>ADS Laminaire</td>
			<td>Optimale 12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Heraeus Multifuge X1R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator 37 &#176;C 5% CO2</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MCO-170AICUVH-PE IncuSafe CO2 Incubator</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescence microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMi8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS Oven between 65 and 80 &#176;C</td>
			<td>Memmert</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mechanical profilometer</td>
			<td>Veeco</td>
			<td>Dektak 6M Stylus Profiler</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical profilometer</td>
			<td>Veeco</td>
			<td>Wyko NT9100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum desiccator</td>
			<td>Verrerie Villeurbanaise (Kartel Labware)</td>
			<td>230KAR</td>
			<td>Diameter 200 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic bath sonicator</td>
			<td>Labo Moderne</td>
			<td>SHE1000</td>
			<td>Volume of the bath: 0.8 liter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hotplate</td>
			<td>Stuart SD162</td>
			<td>SD162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DRIE</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Supplementary data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Su8 Mask 1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Supplementary data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Su8 Mask 2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Supplementary data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Su8 Mask 3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Supplementary data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S1805 calibration stripes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Supplementary data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small laboratory equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mm hole puncher</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>29002519 (US reference)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel or razor blade</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9&#34; Stainless Steel Flat Spatula with Spoon</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>82027-532</td>
			<td>To demold PDMS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Top Lip Wafer Handling</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>63042-096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved tweezer</td>
			<td>FST</td>
			<td>Dumont #7 Forceps - Standard / Dumoxel</td>
			<td>To manipulate glass coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Substrates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer</td>
			<td>Prolog Semicor Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24x24 mm glass coverslips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoresists and developpers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AZ 1518 positive photoresist</td>
			<td>Microchemicals GmbH</td>
			<td></td>
			<td>Before DRIE process, thicknes 1.8 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AZ 351B developer</td>
			<td>Microchemicals GmbH</td>
			<td></td>
			<td>To develop positive AZ 1518 photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 2007</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 2025</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 2050</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PGMA developer</td>
			<td>Technic</td>
			<td></td>
			<td>To develop SU-8 negative photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microposit S1805 resist</td>
			<td>Chimie Tech Services</td>
			<td></td>
			<td>Positive photoresist used to obtain 0.5&#181;m high structures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MF 26A developer</td>
			<td>Chimie Tech Services</td>
			<td></td>
			<td>To develop positive S1805 photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory consumables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable plastic pipette 3 mL</td>
			<td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P100 Petri dishes</td>
			<td>TPP</td>
			<td>93100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL syringe</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>SS+20ES1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transparent scotch tape</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square wipes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>115-2148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>DUTSCHER</td>
			<td>90260</td>
			<td>Plastic paraffin film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(3-Methacryloxypropyl)trichlorosilane</td>
			<td>abcr</td>
			<td>AB 109004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS and curing agent Sylgard 184</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>761036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isopropanol</td>
			<td></td>
			<td>W292907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly-ornithine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4957 - 50 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>02865</td>
			<td>99.8%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-methacryloxypropyl-trimethoxysilane</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>M6514-25ML</td>
			<td>(C4H5O2)-(CH2)3- Si(OCH3)3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acetic acid</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>71251-5ML-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran 10kW conjugated with Alexa488</td>
			<td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td>
			<td>D22910</td>
			<td>Absoprtion at 488 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran 10kW conjugated with Alexa647</td>
			<td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td>
			<td>D22914</td>
			<td>Absoprtion at 647 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM</td>
			<td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td>
			<td>21090-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td>
			<td>26050088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td>
			<td>12587-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax 200 mM</td>
			<td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate GIBCO 100 mM</td>
			<td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td>
			<td>15710-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS 10x</td>
			<td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td>
			<td>14180-046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes 1M</td>
			<td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td>
			<td>15630-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trypsin-EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>59418C-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal</td>
			<td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal without phenol red</td>
			<td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td>
			<td>12348-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Softwares</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Routine in Matlab for background normalization</td>
			<td>Quantacell</td>
			<td>Contact Victor Racine: victor.racine@quantacell.com</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To select specific ROI for image analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Routine</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td>Supplementary data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Routine</td>
			<td>Matlab</td>
			<td></td>
			<td>Supplementary data</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-resolution volume imaging of neurons by the use of fluorescence exclusion method and dedicated microfluidic devices

Volume é um parâmetro importante referentes às características fisiológicas e patológicas dos neurônios em escalas de tempo diferentes. Os neurônios são células bastante singular sobre suas morfologias ramificadas estendidas e consequentemente aumentar vários desafios metodológicos para a medição do volume. No caso particular de em vitro crescimento neuronal, a metodologia escolhida deve incluir a resolução axial sub micrométrica, combinada com a observação de campo integral em escalas de tempo de minutos a horas ou dias. Ao contrário de outros métodos, como a reconstrução de forma celular usando a imagem latente confocal, eletricamente com base em medições ou microscopia de força atômica, o método de exclusão de fluorescência recentemente desenvolvido (FXm) tem o potencial para atender a esses desafios. No entanto, apesar de ser simples em seu princípio, implementação de um FXm de alta resolução para os neurônios requer vários ajustes e uma metodologia dedicada. Apresentamos aqui um método baseado na combinação de exclusão de fluorescência, dispositivos microfluídicos de múltiplos compartimentos de baixa rugosidade e finalmente micropatterning para alcançar em vitro medições de volume neuronal local. A alta resolução fornecida pelo dispositivo nos permitiu medir o volume local de processos neuronais (neuritos) e o volume de algumas estruturas específicas envolvidas no crescimento neuronal, tais como cones de crescimento (GCs).

O resultado do processo de fabricação descrito nas seções 1 e 2 é ilustrado pelas imagens da figura 1A-1B e a curva da Figura 1. A tabela da Figura 1 exibe os valores de rugosidade de duas diferentes áreas representativas de PDMS chip, ou seja, na região central e a câmara intermediária alta próxima de 20 µm. Obteve-se uma diminuição da rugosidade por um fator de cerca de 7 usando gravado da bolacha de Si em vez de fotorresiste SU-8. Em seguida, FXm primeiro foi aplicado em uma faixa de fotorresiste da geometria conhecida (Figura 2A) dentro de uma câmara de alta de 10 µm. Após processamento de imagem e intensidade para conversão de altura (ver gráfico da Figura 2B), perfis de FXm realizadas em cortes transversais ao longo desta faixa (Figura 2) fornecem os perfis de altura desejada (Figura 2D). Figura 2D mostra a comparação entre perfis obtidos usando profilometry mecânico e métodos FXm. Estes perfis, incluindo o valor de borda e planalto, são muito semelhantes, validando o método. Observe que a dispersão dos dados FXm não é representativa da resolução final do método, como novo avaliada na Figura 3 e Figura 4, mas resultados da baixa intensidade empregadas para evitar um possível efeito de muito fraco autofluorescência do fotorresiste no canal da GFP.
Em seguida, observamos neuritos em 3 µm e 10 µm alta câmaras (Figura 3). O desvio padrão de ruído de fundo é de cerca de 18 nm após a intensidade para correção de conversão e fundo de altura. Este valor é ligeiramente maior do que o física rugosidade das superfícies PDMS fundidas em superfícies de silício (12 nm, consulte a tabela da Figura 1) mas muito mais baixo do que a rugosidade medida em PDMS obtidos de moldes de SU-8. Esses resultados destacam o valor acrescentado da perfuração de poços em wafers de silício, em vez de abrir buracos em SU-8 fotorresiste para lançar pilares. Um valor tão baixo permite que um sinal elevado à relação de ruído e imagens muito claras em volume como o exibido na Figura 3A. Como um exemplo dos dados que podem ser obtidos de tais imagens, nós calculado o volume de 1,6 µm (ou seja, 10 pixels) de axônio grande fatia (ver o gráfico da Figura 3B). Usando em uma primeira aproximação um ajuste linear destes dados dá um valor de altura média axônio de cerca de 400 nm, para ser comparado com , por exemplo, o 500 nm diâmetro axonal encontrado em 10 dias velhos filhotes dentro do corpo caloso 5. Também combinamos FXm com micropatterns de adesão consiste em série confinou 2 µm e 6 µm de listras largas de 30 µm de comprimento. Nosso objetivo foi estudar a influência da largura do axônio na sua forma 3D. A Figura 3 mostra uma representação 3D em cor falsa de uma neurônio toda imagem obtida em uma câmara de alta de 10 µm. Neuritos estão se espalhando em 2 µm e 6 µm de listras largas, Considerando que a soma está localizado na extremidade da faixa maior. Perfis de altura foram divididos em três seções diferentes de cruz. Em coerência com o gráfico apresentado na Figura 3A, a superfície integrado sobre o aumento de seções transversais com a largura do axônio (Figura 3D).
Enfocamos também estruturas 3D de crescimento cone (GC). Figura 4 A-B exibe dois diferentes GC perfis obtidos em uma câmara de alta 3 µm, que destacam sua estrutura ramificada de sub. Além disso, foram realizadas experiências de lapso de tempo para acompanhar a dinâmica do volume de GCs em uma câmara de alta 12 µm. A Figura 4 mostra um ciclo de encolhimento e reativação de um GC determinado dentro de uma escala de tempo de algumas dezenas de minutos. Graças à utilização de GFP-lifeact ratos, cones de crescimento foram localizados no comprimento de onda de emissão de GFP (510 nm) de sua concentração elevada de actina. A superfície identificada no comprimento de onda foi usada para integrar-se ao longo do comprimento de onda de emissão de dextran em 647 nm para calcular o volume de GC. Figura 4 mostra finalmente a distribuição do volume de GC em pontos diferentes de tempo e local em três diferentes neurônios, centrados em um valor de cerca de 6 µm3.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56923/56923fig1v2.jpg"> Figura 1: câmaras FXm PDMS. (A) esquemas das quatro etapas principais diferentes de microfabrication levando ao molde final. A localização da entrada, saída e reservatórios são indicados. Escala de bares: 1 mm. (B) imagem da câmara de PDMS FXm obtida usando um perfilômetro óptico. Esta imagem mostra a câmara central contendo 3 fileiras de 10 µm altos pilares e as câmaras intermédias de 20, 50 e 90 µm de altura. Barra de escala: 500 µm. (C) vista transversal do chip ao longo de duas linhas tracejadas desenhado em (B). Amarelo/ouro: seção transversal ao longo de pilares, azuis: secção transversal entre pilares. (D) significa valores de rugosidade do PDMS medido em 50 × 50 µm2 áreas moldadas em silicone e sobre a câmara intermediária alta de 20 µm SU-8 (veja as setas para a localização dessas áreas). Valores médios foram obtidos de medições de três áreas diferentes. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/56923fig1v2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56923/56923fig2.jpg"> Figura 2: calibração de FXm método usando uma faixa de fotorresiste como o objeto de interesse. (A) imagem de GFP-fluorescência de uma câmara de alta de 10 µm tirada repleta de 10.000 dextrano MW absorvente em 488 nm a 1 mg/mL. (B: plano de fundo, p: pilar). Observação com um objectivo de ND X 0.8 40 seco. Barra de escala: lei 50 µm. (B) calibração Linear obtida a intensidade média dos dois retângulos coloridos mostrado no perfil de intensidade da fluorescência (C) obtido ao nível da linha tracejada azul exibido em (A), cruzando o fotorresiste listra (0,45 µm alta positiva fotorresiste). (D) comparação dos perfis obtidos de mecânico perfilômetro (pontos pretos) e FXm depois de intensidade para conversão da altura dos dados de (B) (pontos azuis). <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/56923fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56923/56923fig3.jpg"> Figura 3: imagem de volume de axônio. (A) axônio estendendo-se para a câmara alta central de 3 µm de soma, localizado na câmara intermédia em seguida 15 µm. Imagem executada usando 10.000 dextrano MW absorvente em 488 nm e uma 40 X, at 0.8 secar o objectivo. O baixo-relevo obtidos após o uso de rotina de redução de fundo destaca os dois neuritos e escolhido para plotar o gráfico à direita. Escala de barras:de 30 µm. (B) axônio fatia de volume em função da largura do axônio obtidos a partir do 22 perfis (média de 10 pixels, ou seja, em um 1,6 µm "fatia do axônio") mostrados em (A). A linha sólida representa um ajuste linear de inclinação 0,4 µm passa a origem. (C) imagem em falsa cor de um neurônio estampado em uma faixa adesiva feita de sucessivas de 2 µm e 6 µm de largura tocos (representados em branco). As medições foram feitas em uma câmara alta de 10 µm, cheia de 10.000 dextrano MW absorvente em 647 nm e usando um at 40 x 0.8 secar o objectivo. (D) perfis de altura correspondente para as linhas tracejadas coloridas mostradas em (C), mantendo o mesmo código de cor. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/56923fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56923/56923fig4.jpg"> Figura 4: imagem de cone de crescimento dinâmico e estático. (A-B) Perfis de altura de cone de crescimento obtidas em uma câmara de alta 3 µm após intensidade para conversão de altura ao longo das linhas amarelas exibido em imagens associadas. Observação realizada utilizando um preenchimento com 10.000 dextrano MW absorvente em 488 nm e uma 40 X, at 0.8 secar o objectivo. (C) imagem de neurônio toda em uma câmara de alta 12 µm repleto de 10.000 dextrano MW absorvente em 647 nm. As observações foram feitas em dois canais fluorescentes: GFP para localização de cone de crescimento (linhas tracejadas para amarelas) e CY5 para calcular o volume de GC da exclusão de fluorescência. A superfície incluída por linhas tracejadas amarelas foi usada para calcular o volume de GC. O gráfico mostra a variação do volume de GC com o tempo e morfologias associadas em ambos GFP e CY5 canais em dois pontos representativos de tempo diferentes. Todos os dados foram adquiridos usando um at 40 x 0.8 secar objectivo todos os bares de escala de 3 min.: 10 µm. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/56923fig4large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Passo</td>
			<td>1:8 µm camada de máscara</td>
			<td>Máscara de 02:30 µm camada</td>
			<td>Máscara 03:40 µm camada</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tipo de SU-8</td>
			<td>2007</td>
			<td>2025</td>
			<td>2050</td>
		</tr>
<tr>
<td>Spincoating</td>
			<td>30 s @ 2000RPM</td>
			<td>30 s @ 3050 rpm</td>
			<td>30 s @ 3250 rpm</td>
		</tr>
<tr>
<td>Bolos mole</td>
			<td>3 min @ 95 ° C</td>
			<td>2 min @ 65 ° C + 6 min @ 95 ° C</td>
			<td>3 min @ 65 ° C + 7 min @ 95 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Energia de exposição</td>
			<td>110 mJ/cm2
</td>
			<td>155 mJ/cm2
</td>
			<td>170 mJ/cm2
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Bolos de pós-exposição</td>
			<td>4 min @ 95 ° C</td>
			<td>1 min @ 65 ° C + 6 min @ 95 ° C</td>
			<td>2 min @ 65 ° C + 7 min @ 95 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Desenvolvimento</td>
			<td>2 min 30 s</td>
			<td>5 min</td>
			<td>6 min</td>
		</tr>
<tr>
<td>Difícil Asse (opcional)</td>
			<td>3-5 min @ 200 ° C</td>
			<td>3-5 min @ 200 ° C</td>
			<td>3-5 min @ 200 ° C</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1: fotolitos etapas executadas para construir um dispositivo que contém uma câmara central de 12 μm de altura. Alturas das câmaras intermediárias: 20, 50 e 90 µm.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Passo</td>
			<td>Máscara 01:10 µm de camada</td>
			<td>Máscara de 02:30 µm camada</td>
			<td>Máscara 03:40 µm camada</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tipo de SU-8</td>
			<td>2007</td>
			<td>2025</td>
			<td>2050</td>
		</tr>
<tr>
<td>Spincoating</td>
			<td>30 s @ 1500rpm</td>
			<td>30 s @ 3050 rpm</td>
			<td>30 s @ 3250 rpm</td>
		</tr>
<tr>
<td>Bolos mole</td>
			<td>3 min @ 95 ° C</td>
			<td>2 min @ 65 ° C + 6 min @ 95 ° C</td>
			<td>3 min @ 65 ° C + 7 min @ 95 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Energia de exposição</td>
			<td>125 mJ/cm2
</td>
			<td>155 mJ/cm2
</td>
			<td>170 mJ/cm2
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Bolos de pós-exposição</td>
			<td>4 min @ 95 ° C</td>
			<td>1 min @ 65 ° C + 6 min @ 95 ° C</td>
			<td>2 min @ 65 ° C + 7 min @ 95 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Desenvolvimento</td>
			<td>2 min 30 s</td>
			<td>5 min</td>
			<td>6 min</td>
		</tr>
<tr>
<td>Difícil Asse (opcional)</td>
			<td>3-5 min @ 200 ° C</td>
			<td>3-5 min @ 200 ° C</td>
			<td>3-5 min @ 200 ° C</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 2: fotolitos etapas executadas para construir um dispositivo que contém uma câmara central de 10 μm de altura. Alturas das câmaras intermediárias: 20, 50 e 90 µm.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Passo</td>
			<td>Máscara 01:12 µm de camada</td>
			<td>Máscara 02:32 µm camada</td>
			<td>Máscara 03:40 µm camada</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tipo de SU-8</td>
			<td>2015</td>
			<td>2025</td>
			<td>2050</td>
		</tr>
<tr>
<td>Spincoating</td>
			<td>30 s @ 3250 rpm</td>
			<td>30 s @ 2500rpm</td>
			<td>30 s @ 3250 rpm</td>
		</tr>
<tr>
<td>Bolos mole</td>
			<td>3 min @ 95 ° C</td>
			<td>2 min @ 65 ° C + 5 min @ 95 ° C</td>
			<td>3 min @ 65 ° C + 7 min @ 95 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tempo de exposição</td>
			<td>140 mJ/cm2
</td>
			<td>157 mJ/cm2
</td>
			<td>170 mJ/cm2
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Bolos de pós-exposição</td>
			<td>4 min @ 95 ° C</td>
			<td>1 min @ 65 ° C + 5 min @ 95 ° C</td>
			<td>2 min @ 65 ° C + 7 min @ 95 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Desenvolvimento</td>
			<td>3 min</td>
			<td>5 min</td>
			<td>6 min</td>
		</tr>
<tr>
<td>Difícil Asse (opcional)</td>
			<td>3-5 min @ 200 ° C</td>
			<td>3-5 min @ 200 ° C</td>
			<td>3-5 min @ 200 ° C</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 3: fotolitos etapas executadas para construir um dispositivo que contém uma câmara central de 3 μm de altura. Alturas das câmaras intermediárias: 18, 50 e 90 µm.
Dados complementares 1: masks_neuron_volume_chips.tiff. Visão esquemática das máscaras usadas para fabricar o dispositivo PDMS (máscara DRIE e máscaras 1-3). <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/masks_neuron_volume_chips.tiff">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Dados adicionais 2: arquivo "masks_neuron_volume_chips.dxf". Arquivos eletrônicos que permite fabricar a máscara DRIE e máscaras 1-3. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/masks_neuron_volume_chips.dxf">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Dados suplementares 3: "Mask_Photoresist-stripes.dxf". Arquivos eletrônicos que permite fabricar a máscara utilizada para os fotolitos de fotorresiste listras. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/Mask_Photoresist-stripes.dxf">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Dados adicionais 4: arquivo conversion_mattotiff.m <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/conversion_mattotiff.m">clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Dados suplementares 5: arquivo importfilevol.m <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/importfilevol.m">clique aqui para baixar este arquivo.</a>

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High-resolution Volume Imaging of Neurons by the Use of Fluorescence eXclusion Method and Dedicated Microfluidic Devices

Volume é um parâmetro importante sobre células características fisiológicas e patológicas. Nós descrevemos um método de exclusão fluorescente permitindo a medição de campo integral em vitro neuronal volume com sub micrométrica resolução axial, necessária para a análise de neuritos e estruturas dinâmicas implicadas em crescimento neuronal.

De alta resolução Volume Imaging de neurônios pela exclusão da utilização da fluorescência método e dedicado Microfluidic dispositivos

Volume is an important parameter regarding physiological and pathological characteristics of neurons at different time scales. Neurons are quite unique ...

The overall goal of this procedure is to allow full field measurement of in vitro neuronal volume with submicrometric axial resolution required for the analysis of neurites in dynamic structures implied in neuronal growth. This method can help answer key questions in the field of cellular neuroscience regarding the dynamics of volume changes at the subsididal scale during the nongrowth or axon degeneration. The main advantage of this technique is that it provides submicrometric axial resolution combined with full fit observation and time scale to hours or days.To begin the procedure, demold the PDMS block under a chemical hood by pouring isopropanol on it. Next, place it on the stainless steel bench of the hood. Cut around the silicone wafer and demold the PDMS replica.Then, cut around the chip and leave a two millimeter margin using a scalpel or a razor blade. Punch the inlet by pressing the 1.5 millimeter diameter puncher firmly and actuate it in order to cut and carve the hole of the inlet. Do the same at the four dedicated zones of the chip where liquid will be injected.Afterward, clean the chip by sticking and peeling the adhesive tape on the microstructured side. Sprinkle isopropanol on both sides. Then, dry the chip with pressurized nitrogen using an air blow gun.In this procedure, place each coverslip on a spin-coater located in a clean room environment. Apply a drop of the positive photoresist to cover about 75%of the coverslip and spin-coat at 4000 rpm for 30 seconds to reach a final thickness of 0.45 micrometer. Place the coverslips on a hotplate with a surface temperature of 115 degrees Celsius for one minute.Using a mask aligner, expose each coverslip at a wavelength of 435 nanometer through the dedicated mask according to the fabricant parameters. Next, prepare two glass crystallizing dishes, one containing the developer without dilution, the other containing deionized water. Dip the coverslips one by one in the developer for one minute while continuously and gently stirring the crystallizing dish.Then, submerge the wafer in deionized water for about five seconds. Transfer the wafer to an absorbent paper and dry it with pressurized nitrogen using an air blow gun. Place both the PDMS chip and the glass dish on which it will be bonded into the plasma chamber for surface activation.Next, deposit a drop of water on a rectangular thick microscope glass slide and stick the coverslip on the glass slide by capillarity. Under a microscope, mark the location of the photoresist stripes at the rear of the glass slide. Place the patterned glass coverslip on the mask holder of the mask aligner.Rely on the mark made to center the photoresist reference objects. To increase the optic contrast, place a silicon wafer beneath the PDMS chip. The silicon wafer should remain firmly attached on the chuck during the alignment process.Then, place the PDMS chip on the mobile substrate holder of the mask aligner. Subsequently, lift the chuck enough to visualize both the chip and the array of photoresist stripes located on the coverslip while staying behind the mechanical contact. Perform alignment and achieve mechanical contact between the chip and the coverslip by lifting the chuck until the surface of PDMS pillars touches the glass coverslip.After that, lower the chuck. Remove the coverslip bonded to the chip from the mask holder. Then, place the device into a 35 millimeter Petri dish and transfer everything into the oven for five to ten minutes to increase the bonding strength.Thirty minutes after bonding, place a ten microliter pipette tip filled with PLO solution at the inlet. Then, load the liquid until forming a drop on top. Repeat the same operation at the outlet and reservoirs.Subsequently, add PBS in the Petri dish all around the chip. Seal the Petri dish with a paraffin film and incubate at room temperature with a minimum of five hours. Then, press a ten microliter tip cone lightly into each injection hole and suck up the excess liquid.Next, replace PLO as well as the PBS surrounding the chip by the culture medium. Afterward, place the chip in the incubator regulated at 37 degrees Celsius and 5%carbon dioxide until neurons seed with a minimum of five hours incubation time. In this procedure, draw up the culture medium from the chip.Collect two to three microliters of the freshly resuspended cell solution and inject it at the inlet. Immediately repeat the same operation at the outlet. Inject about the same volume of culture medium in each reservoir.Quickly observe the chip under the microscope to check the density of the cells. The order of magnitude of the optimal cell density corresponds to about five to ten cells within the square surface delimited by four pillars. Repeat the procedure of injection of 0.5 to 1 microliter of cell suspension to reach the targeted cell density.For imaging, replace the culture medium with the imaging medium. Then, place the chip under an epifluorescence microscope. Acquire images of cells from single to multiple successive images in case of time-lapse experiments.Shown here are the representative observations of a calibration photoresist stripe and neurons. Higher magnification images and cross-sections of these objects are displayed on the right. The representative neurites and a three micrometer high central chamber are shown here.The volume of neurite slice can be computed as a function of neurite width. And here are the representative growth cones and a three micrometer high central chamber. Their substructures emerge clearly from an optical background noise of about 20 nanometers.Time-lapse observations of life act neurons seeded into a 12 micrometer high chamber to follow the cycle of shrinking and reactivation of the growth cone within a time scale of a few tens of minutes. While attempting this procedure, it's important to have an access to a deep ion etching equipment to fabricate the silicon mud. After watching this video, you should have a good understanding of how to align a structured glass coverslip with a PDMS chip.Once mastered, this technique can be reproducibly applied to the quantification of neurology in 3d. This technique paved the way for researchers in the field of pharmacology to explore the effect of various drugs with actual caliber all in closed cone shape. Don't forget that working with primary neurons require a lot of care to avoid contamination and shatters.Be always gentle and quick when changing media in order to limit the time they spend outside incubator.

Research

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