Name: high-resolution volume imaging of neurons by the use of fluorescence exclusion method and dedicated microfluidic devices
Uploaded: 2018-03-26T12:30:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-resolution Volume Imaging of Neurons by the Use of Fluorescence eXclusion Method and Dedicated Microfluidic Devices at JoVE.com

Авторы хотят признавать ChiLab, материалы и лабораторные Microsystems - Политехнического ди Торино - DISAT, в лице профессора C F Pirri, д-р M Cocuzza и д-р S L Marasso, за их ценные поддержку в процесс разработки и изготовления устройств. Мы благодарим Виктора Racine от Quantacell для обсуждения и поддержку в обработке изображений. Мы благодарны Isabelle Гранджин и Манон Шартье животных фонда Institut Curie для их поддержки для мышей и Пабло Варгас и Ана-Мария Леннон (Institut Кюри) за предоставление нам GFP LifeAct мышей. Мы благодарны Оливье Thouvenin от Institut Langevin и Клотильда Cadart, Лариса Venkova и Matthieu Piel от Institut Кюри - UMR 144, за их помощь в понимании флуоресценции исключения метод. Наконец мы благодарим технологической платформы Institut Пьер-Жиль де жен (CNRS UMS 3750) за их поддержку в микротехнологий. Эта работа частично поддержали европейских исследований Совета дополнительно грант № 321107 «Виолончель,» Université PSL (проект SwithNeuroTrails), практический НРУ будущее и ИНГГ Labex и Equipex.

<ol>
	<li>Jun, S., Taheri-Araghi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-size+maintenance:+universal+strategy+revealed.">Cell-size maintenance: universal strategy revealed.</a> Trends Microbiol. 23 (1), 4-6 (2015).</li><li>Zlotek-Zlotkiewicz, E., Monnier, S., Cappello, G., Le Berre, M., Piel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+volume+and+mass+measurements+show+that+mammalian+cells+swell+during+mitosis.">Optical volume and mass measurements show that mammalian cells swell during mitosis.</a> J. Cell Biol. 211 (4), 765-774 (2015).</li><li>Kim, G. H., Kosterin, P., Obaid, A. L., Salzberg, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mechanical+spike+accompanies+the+action+potential+in+Mammalian+nerve+terminals.">A mechanical spike accompanies the action potential in Mammalian nerve terminals.</a> Biophys J. 92 (9), 3122-3129 (2007).</li><li>Iacono, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+Hypertrophy+in+Asymptomatic+Alzheimer+Disease.">Neuronal Hypertrophy in Asymptomatic Alzheimer Disease.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 67 (6), 578-589 (2008).</li><li>Cheli, V. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+Deletion+of+the+L-Type+Calcium+Channel+Cav1.+2+in+Oligodendrocyte+Progenitor+Cells+Affects+Postnatal+Myelination+in+Mice.">Conditional Deletion of the L-Type Calcium Channel Cav1. 2 in Oligodendrocyte Progenitor Cells Affects Postnatal Myelination in Mice.</a> J Neurosci. 36 (42), 10853-10869 (2016).</li><li>Kneynsberg, A., Collier, T. J., Manfredsson, F. P., Kanaan, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+and+semi-quantitative+measurements+of+axonal+degeneration+in+tissue+and+primary+neuron+cultures.">Quantitative and semi-quantitative measurements of axonal degeneration in tissue and primary neuron cultures.</a> J Neurosci Methods. 266, 32-41 (2016).</li><li>Fouquet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+axial+resolution+in+confocal+microscopy+with+new+high+refractive+index+mounting+media.">Improving axial resolution in confocal microscopy with new high refractive index mounting media.</a> PloS one. 10 (3), (2015).</li><li>Aguet, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+dynamics+of+dividing+cells+imaged+by+lattice+light-sheet+microscopy.">Membrane dynamics of dividing cells imaged by lattice light-sheet microscopy.</a> Mol Biol Cell. 27 (22), 3418-3435 (2016).</li><li>Roland, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannabinoid-induced+actomyosin+contractility+shapes+neuronal+morphology+and+growth.">Cannabinoid-induced actomyosin contractility shapes neuronal morphology and growth.</a> eLife. 3, (2014).</li><li>Lu, Y. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viscoelastic+properties+of+individual+glial+cells+and+neurons+in+the+CNS.">Viscoelastic properties of individual glial cells and neurons in the CNS.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 103 (47), 17759-17764 (2006).</li><li>Chen, J., Xue, C., Zhao, Y., Chen, D., Wu, M. H., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+impedance+flow+cytometry+enabling+high-throughput+single-cell+electrical+property+characterization.">Microfluidic impedance flow cytometry enabling high-throughput single-cell electrical property characterization.</a> Int J Mol Sci. 16 (5), 9804-9830 (2015).</li><li>Bottier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+measurement+of+the+height+and+volume+of+migrating+cells+by+a+novel+fluorescence+microscopy+technique.">Dynamic measurement of the height and volume of migrating cells by a novel fluorescence microscopy technique.</a> Lab Chip. 11, 3855-3863 (2011).</li><li>Cadart, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+eXclusion+Measurement+of+volume+in+live+cells.">Fluorescence eXclusion Measurement of volume in live cells.</a> Methods Cell Biol. 139, 103-120 (2017).</li><li>Marasso, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+graphene+based+nanocomposite+for+application+in+3D+flexible+micro-supercapacitors.">A novel graphene based nanocomposite for application in 3D flexible micro-supercapacitors.</a> Materials Research Express. 3 (6), 065001 (2016).</li><li>Welch, C. C., Goodyear, A. L., Wahlbrink, T., Lemme, M. C., Mollenhauer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silicon+etch+process+options+for+micro-and+nanotechnology+using+inductively+coupled+plasmas.">Silicon etch process options for micro-and nanotechnology using inductively coupled plasmas.</a> Microelectronic Engineering. 83 (4), 1170-1173 (2006).</li><li>Fath, T., Ke, Y. D., Gunning, P., G&#246;tz, J., Ittner, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+support+cultures+of+hippocampal+and+substantia+nigra+neurons.">Primary support cultures of hippocampal and substantia nigra neurons.</a> Nat. Protoc. 4 (1), 78-85 (2008).</li><li>Getting intensity values from single ROI. Image Intensity Processing Available from: <a target="_blank" href="https://imagej.net/Image_Intensity_Processing">https://imagej.net/Image_Intensity_Processing</a> (2017)</li><li>19. Tools. ImageJ User Guide Available from: <a target="_blank" href="https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146-19.html">https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146-19.html</a> (2017)</li></ol>

Авторы заявляют никакого конфликта интересов.

Объем изображений нейронов представляет собой проблему для компании FXm технику из-за длинные и тонкие расширения этих клеток. Этот протокол описывает варианты того же типа microfluidic устройства, посвященный нейрон imaging.
Рядом аспектов microfluidic дизайн выбор цели является основополагающим для флуоресценции исключения воображения и предполагает компромисс между латеральное разрешение и четкость изображения. В 13 показано, что высокая NA, ведущих к глубине фокус меньше, чем высота камеры не наносит ущерб для точности измерения объема, если изображений была исполнена на фокус и если осталось достаточно разницы между контур объекта я выигравшим и границы поверхности интеграции. Однако использование камеры гораздо выше, чем Глубина фокуса ухудшает четкость изображения благодаря Фотон диффузии, которая сглаживает края объектов, представляющих интерес. Изготовление высокой палаты 3 мкм сократить этот боковой размытие и предоставляется исключительно четко флуоресцентные исключения изображения даже с помощью высоких NA (0.8) 40 X цели визуализировать нейрональных отраслей с высоким боковыми резолюции.
Чип сборка является важным шагом, в частности в случае 3 мкм высокие камеры, но тщательного манипуляции, как описано в 4.1.2 избегает распада крыши. Поверхности высокое соотношение объема, связанные с эти тонкие камеры также поднял вопрос о стабильности декстрана концентрации со временем. Мы проверили, что поверхности поглощения декстрана после одной ночи инкубации был незначительным: после замены декстрана, PBS, разность интенсивности между опорой и фон был приблизительно 1 на 1000 первоначального интенсивности контраст между Эти два региона в присутствии декстрана. Обратите внимание, что нейроны могут осаждаться и на нижнем coverslip на крыше PDMS. Этот эффект исчезает при использовании узорной coverslips (т.е. когда мы не инкубировать адгезивные молекулы в зале PDMS), как покрытие поэтому строго локализуется в нижней части камеры.
Помимо их сложной морфологией нейронов скорее подходит для компании FXm с тем, что одним из основных ограничений метода, т.е. декстрана эндоцитоза, является весьма ограниченным в этих клетках. Мы выбираем 10 кДа формулировка для подавления в долгосрочной перспективе диапазон (в часах) каких-либо видимых эндоцитоза явлений.
В заключение концептуальной простоты FXm уравновешивается набор экспериментальных вопросов, которые были решены настоящего Протокола, такие как нанометрические PDMS шероховатости и высота Микрометрический камеры или фоновая поправка для устранения неравномерности потолок PDMS между столбами. Однако использование тесном microfluidic палаты ограничиться флуоресцентные среднего дает несколько конкретных ограничений как необходимость поддержки столбов, который понижает эффективной поверхности, доступные для клеточной адгезии, или необходимость исключить сома из Центральной камеры для наблюдения нейрональных расширений с высокой ясностью, который ограничивает регионах ячейки доступными для наблюдения высокого разрешения. Одной возможной эволюции этого метода будет избавиться от этой физической изоляции, должны быть заменены одним оптическим. Новая разработка легких лист микроскопии могут быть объединены выгодно с компанией FXm в будущем.

Точное знание клеточного объема привлекла повышенное внимание в последние годы, движимый выпуск гомеостаза размер ячейки в одноклеточных микроорганизмов 1 и в целом в митотическая клетки 2. Однако вопрос о объема клетки уместно также для пост митотическая ячеек, для которых нейроны представляют собой парадигматический пример.
Объем является действительно важным подпись физиологические и патологические события в различных масштабах и моменты времени в нейрональных жизни, от переходных аксональное деформации, связанные с электрической активности (шкала миллисекунды) 3 к необратимым нейронов, отеки, происходящих во время бессимптомной фазы нейродегенеративных заболеваний (годами в организме человека) 4. Однако большой объем изменений происходит в промежуточные сроки дней или недель (в зависимости от рассматриваемых организма) во время роста нейронов. Расширенный и сложных морфологией нейронов поднимает вопросы кратные, среди которых регулирование размера ячейки. Аксональное Длина и диаметр являются действительно жестко регулируется в естественных условиях, с конкретных значений для каждого типа нейронов 5,6.
Эти вопросы, сложные решения в естественных условиях, могут также рассматриваться в упрощенном виде в пробирке. В этой цели метод, посвященный измерение объема быстро достаточно, чтобы следить за динамикой роста (т.е. в масштабе времени минут) и совместимы с наблюдения за несколько часов или дней не требуется. Несколько методов были разработаны с годами для обеспечения прямого или косвенного доступа к сотовой тома в пробирке. Реконструкция ячейки от конфокальная томография является одним из них, но этот метод подразумевает маркировки и повторные воздействия света, показывая ограниченной осевой разрешением около 500 Нм 7. Обратите внимание, что эти два последних недостатки частично преодолеть, более сложные и последние метод с именем решетка свет лист микроскопии 8. Атомная силовая микроскопия был используется 9 , но этот способ является по своей сути, медленно и утомительно. Кроме того физический контакт, который требует с ячейки могут помешать с измерением, учитывая крайняя мягкость нейронов 10. Косвенный метод, с помощью импеданс или резонанс использовались для различных клеточных типов 11, но распространяются недостаточно для клея клетки как нейронов.
Один из наиболее перспективных методов основан на меру исключенного объема клетки в тесной камере, заполнены с флуоресцентной краской. Метод исключения флуоресцирования (FXm) прост в своем принципе как требует не маркировки и подходит для быстрого, долгосрочные оптических изображений клеточных популяций с потенциально югу оптического осевого резолюции. Более точно в резолюции в z зависит от интенсивности максимум флюоресценции в камере культуры (т.е. в регионе лишенный клетки) делится на динамический диапазон камеры, хотя несколько источников шума ограничить это окончательное урегулирование. Этот метод был очень мощный следовать объем миграции адэрентных клеток 12 или для изучения изменение объема при митозе клеток млекопитающих, как подробно описано в 13. Однако нейроны представляют методологической проблемой для компании FXm, учитывая их обширные ветвления в югу Микрометрический процессы.
Мы представляем здесь метод, ведущих к изготовления гладких FXm камер для доступа с высокой точностью объем и высота ветвей нейронов и динамических структур, участвующих в нейрональных роста как конусы роста.
Камеры должны иметь аналогичные высот, чем объект для измерения с целью оптимизации осевой резолюции. Таким образом мы разработали различные устройства компании FXm характеризуется палат Центральной измерения трех различных высот. Тонкий (3 мкм в высоту) предназначен для измерения neurite: это низкая высота исключает сома, которые остаются в ближайшем высокой Промежуточная камера 15 мкм. Толстые Центральная камер (10 и 12 мкм) являются недостаточно высокими для того, чтобы следовать за весь клеточный рост. Устройство также включает в себя два водохранилища, расположенные по обе стороны центральной камеры. Четыре отверстия впрыска (IH) таким образом реализованы и обозначаются следующим образом: на входе и выходе служат ввести клеточных суспензий в чип, тогда как два других канала водохранилищ.
У нас есть первый сфабрикованные калибровки coverslips для измерения высоты, с использованием структуры фоторезиста известных геометрии. Мы затем образ свободный рост нейронов, но также морфологически ограничением нейронов в micropatterns сцепления.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmalab System 100</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td></td>
			<td>To perform DRIE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MJB4 mask aligner</td>
			<td>SUSS MicroTec</td>
			<td></td>
			<td>SU-8 photolithography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NXQ 4006 Mask aligner</td>
			<td>Neutronix Quintel</td>
			<td></td>
			<td>Photolithography associated to DRIE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>Diener Electronic</td>
			<td>Pico PCCE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture hood</td>
			<td>ADS Laminaire</td>
			<td>Optimale 12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Heraeus Multifuge X1R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator 37 &#176;C 5% CO2</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MCO-170AICUVH-PE IncuSafe CO2 Incubator</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescence microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMi8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS Oven between 65 and 80 &#176;C</td>
			<td>Memmert</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mechanical profilometer</td>
			<td>Veeco</td>
			<td>Dektak 6M Stylus Profiler</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical profilometer</td>
			<td>Veeco</td>
			<td>Wyko NT9100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum desiccator</td>
			<td>Verrerie Villeurbanaise (Kartel Labware)</td>
			<td>230KAR</td>
			<td>Diameter 200 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic bath sonicator</td>
			<td>Labo Moderne</td>
			<td>SHE1000</td>
			<td>Volume of the bath: 0.8 liter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hotplate</td>
			<td>Stuart SD162</td>
			<td>SD162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DRIE</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Supplementary data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Su8 Mask 1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Supplementary data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Su8 Mask 2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Supplementary data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Su8 Mask 3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Supplementary data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S1805 calibration stripes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Supplementary data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small laboratory equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mm hole puncher</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>29002519 (US reference)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel or razor blade</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9&#34; Stainless Steel Flat Spatula with Spoon</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>82027-532</td>
			<td>To demold PDMS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Top Lip Wafer Handling</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>63042-096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved tweezer</td>
			<td>FST</td>
			<td>Dumont #7 Forceps - Standard / Dumoxel</td>
			<td>To manipulate glass coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Substrates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer</td>
			<td>Prolog Semicor Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24x24 mm glass coverslips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoresists and developpers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AZ 1518 positive photoresist</td>
			<td>Microchemicals GmbH</td>
			<td></td>
			<td>Before DRIE process, thicknes 1.8 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AZ 351B developer</td>
			<td>Microchemicals GmbH</td>
			<td></td>
			<td>To develop positive AZ 1518 photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 2007</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 2025</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 2050</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PGMA developer</td>
			<td>Technic</td>
			<td></td>
			<td>To develop SU-8 negative photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microposit S1805 resist</td>
			<td>Chimie Tech Services</td>
			<td></td>
			<td>Positive photoresist used to obtain 0.5&#181;m high structures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MF 26A developer</td>
			<td>Chimie Tech Services</td>
			<td></td>
			<td>To develop positive S1805 photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory consumables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable plastic pipette 3 mL</td>
			<td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P100 Petri dishes</td>
			<td>TPP</td>
			<td>93100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL syringe</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>SS+20ES1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transparent scotch tape</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square wipes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>115-2148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>DUTSCHER</td>
			<td>90260</td>
			<td>Plastic paraffin film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(3-Methacryloxypropyl)trichlorosilane</td>
			<td>abcr</td>
			<td>AB 109004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS and curing agent Sylgard 184</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>761036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isopropanol</td>
			<td></td>
			<td>W292907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly-ornithine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4957 - 50 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>02865</td>
			<td>99.8%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-methacryloxypropyl-trimethoxysilane</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>M6514-25ML</td>
			<td>(C4H5O2)-(CH2)3- Si(OCH3)3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acetic acid</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>71251-5ML-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran 10kW conjugated with Alexa488</td>
			<td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td>
			<td>D22910</td>
			<td>Absoprtion at 488 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran 10kW conjugated with Alexa647</td>
			<td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td>
			<td>D22914</td>
			<td>Absoprtion at 647 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM</td>
			<td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td>
			<td>21090-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td>
			<td>26050088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td>
			<td>12587-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax 200 mM</td>
			<td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate GIBCO 100 mM</td>
			<td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td>
			<td>15710-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS 10x</td>
			<td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td>
			<td>14180-046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes 1M</td>
			<td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td>
			<td>15630-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trypsin-EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>59418C-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal</td>
			<td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal without phenol red</td>
			<td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td>
			<td>12348-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Softwares</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Routine in Matlab for background normalization</td>
			<td>Quantacell</td>
			<td>Contact Victor Racine: victor.racine@quantacell.com</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To select specific ROI for image analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Routine</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td>Supplementary data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Routine</td>
			<td>Matlab</td>
			<td></td>
			<td>Supplementary data</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-resolution volume imaging of neurons by the use of fluorescence exclusion method and dedicated microfluidic devices

Объем является важным параметром относительно характеристик физиологических и патологических нейронов в различных масштабах времени. Нейроны являются довольно уникальный клетки относительно их расширенной разветвленной морфологии и следовательно поднять ряд методологических проблем для измерения объема. В конкретном случае в vitro нейрональных роста выбранной методологии должен включать югу Микрометрический осевой резолюции, в сочетании с полный поле наблюдения на временных масштабах от минут до часов или дней. В отличие от других методов, как клетки форму реконструкция с использованием конфокальная томография, электрически на основе измерения или атомной силовой микроскопии недавно разработанный метод исключения флуоресцирования (FXm) имеет потенциал для выполнения этих задач. Однако хотя простые в своем принципе, осуществление разрешением FXm для нейронов требует несколько корректировок и посвященный методологии. Мы представляем здесь метод, основанный на сочетании флуоресценции отчуждения, низкой шероховатости несколькими отсеков microfluidic приборы и, наконец, micropatterning для достижения в vitro измерения объема местных нейронов. Высоким разрешением, предоставляемых устройством позволили нам измерить объем местных нейрональные процессы (невритов) и объем некоторых конкретных структур, участвующих в нейрональных роста, такие как конусы роста (ГСК).

Watch this Scientific Journal Video about High-resolution Volume Imaging of Neurons by the Use of Fluorescence eXclusion Method and Dedicated Microfluidic Devices at JoVE.com

High-resolution Volume Imaging of Neurons by the Use of Fluorescence eXclusion Method and Dedicated Microfluidic Devices

Объем является важным параметром относительно характеристик физиологических и патологических клеток. Мы описываем флуоресцентный исключения метод, позволяющий полный поле измерения объема в vitro нейронов с югу Микрометрический осевой резолюции, необходимые для анализа невритов и динамические структуры, подразумевается в нейрональных роста.

Высоким разрешением объем изображений из нейронов путем использования флуоресценции исключения метод и посвятил Microfluidic приборы

Volume is an important parameter regarding physiological and pathological characteristics of neurons at different time scales. Neurons are quite unique ...

The overall goal of this procedure is to allow full field measurement of in vitro neuronal volume with submicrometric axial resolution required for the analysis of neurites in dynamic structures implied in neuronal growth. This method can help answer key questions in the field of cellular neuroscience regarding the dynamics of volume changes at the subsididal scale during the nongrowth or axon degeneration. The main advantage of this technique is that it provides submicrometric axial resolution combined with full fit observation and time scale to hours or days.To begin the procedure, demold the PDMS block under a chemical hood by pouring isopropanol on it. Next, place it on the stainless steel bench of the hood. Cut around the silicone wafer and demold the PDMS replica.Then, cut around the chip and leave a two millimeter margin using a scalpel or a razor blade. Punch the inlet by pressing the 1.5 millimeter diameter puncher firmly and actuate it in order to cut and carve the hole of the inlet. Do the same at the four dedicated zones of the chip where liquid will be injected.Afterward, clean the chip by sticking and peeling the adhesive tape on the microstructured side. Sprinkle isopropanol on both sides. Then, dry the chip with pressurized nitrogen using an air blow gun.In this procedure, place each coverslip on a spin-coater located in a clean room environment. Apply a drop of the positive photoresist to cover about 75%of the coverslip and spin-coat at 4000 rpm for 30 seconds to reach a final thickness of 0.45 micrometer. Place the coverslips on a hotplate with a surface temperature of 115 degrees Celsius for one minute.Using a mask aligner, expose each coverslip at a wavelength of 435 nanometer through the dedicated mask according to the fabricant parameters. Next, prepare two glass crystallizing dishes, one containing the developer without dilution, the other containing deionized water. Dip the coverslips one by one in the developer for one minute while continuously and gently stirring the crystallizing dish.Then, submerge the wafer in deionized water for about five seconds. Transfer the wafer to an absorbent paper and dry it with pressurized nitrogen using an air blow gun. Place both the PDMS chip and the glass dish on which it will be bonded into the plasma chamber for surface activation.Next, deposit a drop of water on a rectangular thick microscope glass slide and stick the coverslip on the glass slide by capillarity. Under a microscope, mark the location of the photoresist stripes at the rear of the glass slide. Place the patterned glass coverslip on the mask holder of the mask aligner.Rely on the mark made to center the photoresist reference objects. To increase the optic contrast, place a silicon wafer beneath the PDMS chip. The silicon wafer should remain firmly attached on the chuck during the alignment process.Then, place the PDMS chip on the mobile substrate holder of the mask aligner. Subsequently, lift the chuck enough to visualize both the chip and the array of photoresist stripes located on the coverslip while staying behind the mechanical contact. Perform alignment and achieve mechanical contact between the chip and the coverslip by lifting the chuck until the surface of PDMS pillars touches the glass coverslip.After that, lower the chuck. Remove the coverslip bonded to the chip from the mask holder. Then, place the device into a 35 millimeter Petri dish and transfer everything into the oven for five to ten minutes to increase the bonding strength.Thirty minutes after bonding, place a ten microliter pipette tip filled with PLO solution at the inlet. Then, load the liquid until forming a drop on top. Repeat the same operation at the outlet and reservoirs.Subsequently, add PBS in the Petri dish all around the chip. Seal the Petri dish with a paraffin film and incubate at room temperature with a minimum of five hours. Then, press a ten microliter tip cone lightly into each injection hole and suck up the excess liquid.Next, replace PLO as well as the PBS surrounding the chip by the culture medium. Afterward, place the chip in the incubator regulated at 37 degrees Celsius and 5%carbon dioxide until neurons seed with a minimum of five hours incubation time. In this procedure, draw up the culture medium from the chip.Collect two to three microliters of the freshly resuspended cell solution and inject it at the inlet. Immediately repeat the same operation at the outlet. Inject about the same volume of culture medium in each reservoir.Quickly observe the chip under the microscope to check the density of the cells. The order of magnitude of the optimal cell density corresponds to about five to ten cells within the square surface delimited by four pillars. Repeat the procedure of injection of 0.5 to 1 microliter of cell suspension to reach the targeted cell density.For imaging, replace the culture medium with the imaging medium. Then, place the chip under an epifluorescence microscope. Acquire images of cells from single to multiple successive images in case of time-lapse experiments.Shown here are the representative observations of a calibration photoresist stripe and neurons. Higher magnification images and cross-sections of these objects are displayed on the right. The representative neurites and a three micrometer high central chamber are shown here.The volume of neurite slice can be computed as a function of neurite width. And here are the representative growth cones and a three micrometer high central chamber. Their substructures emerge clearly from an optical background noise of about 20 nanometers.Time-lapse observations of life act neurons seeded into a 12 micrometer high chamber to follow the cycle of shrinking and reactivation of the growth cone within a time scale of a few tens of minutes. While attempting this procedure, it's important to have an access to a deep ion etching equipment to fabricate the silicon mud. After watching this video, you should have a good understanding of how to align a structured glass coverslip with a PDMS chip.Once mastered, this technique can be reproducibly applied to the quantification of neurology in 3d. This technique paved the way for researchers in the field of pharmacology to explore the effect of various drugs with actual caliber all in closed cone shape. Don't forget that working with primary neurons require a lot of care to avoid contamination and shatters.Be always gentle and quick when changing media in order to limit the time they spend outside incubator.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

An Organotypic Slice Assay for High-Resolution Time-Lapse Imaging of Neuronal Migration in the Postnatal Brain

Органотипической Анализ фрагментов для высокого разрешения Time-Lapse Визуализация миграции нейронов в послеродовой мозга

Neurogenesis in the postnatal brain depends on maintenance of three biological events: proliferation of progenitor cells, migration of neuroblasts, as ...

A Rapid Approach to High-Resolution Fluorescence Imaging in Semi-Thick Brain Slices

Быстрое подход к высоким разрешением флуоресценции в Semi-ломтики толщиной мозга

A fundamental goal to both basic and clinical neuroscience is to better understand the identities, molecular makeup, and patterns of connectivity that are ...

High-resolution Functional Magnetic Resonance Imaging Methods for Human Midbrain

Высокое разрешение функциональной магнитно-резонансной томографии методы по правам мозга

Functional MRI (fMRI) is a widely used tool for non-invasively measuring correlates of human brain activity. However, its use has mostly been focused upon ...

High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

Высокое разрешение изображений Онлайн-клеточной поведения в развивающихся нейроэпителия

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central ...

Analysis of Developing Tooth Germ Innervation Using Microfluidic Co-culture Devices

Анализ Разработка зуб Микроб иннервации Использование Микрожидкостных Сотрудничество культуры устройств

Innervation plays a key role in the development, homeostasis and regeneration of organs and tissues. However, the mechanisms underlying these phenomena ...

High-resolution Structural Magnetic Resonance Imaging of the Human Subcortex In Vivo and Postmortem

High-resolution Structural Magnetic Resonance Imaging of the Human Subcortex In Vivo and Postmortem

Высокое разрешение Структурная магнитно-резонансная томография в подкорке человека<I&gt; В Vivo</I&gt; И Посмертный

The focus of this study was to test the resolution limits of structural MRI of a postmortem brain compared to living human brains. The resolution of ...

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Флуоресценции и Биолюминесценция изображений субклеточных Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; У пожилых нейронов гиппокампа

Susceptibility to neuron cell death associated to neurodegeneration and ischemia are exceedingly increased in the aged brain but mechanisms responsible ...

High-Resolution Quantitative Immunogold Analysis of Membrane Receptors at Retinal Ribbon Synapses

Высокое разрешение Количественный Immunogold Анализ мембранными рецепторами на сетчатки синапсах ленточного

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA ...

Imaging Neurons within Thick Brain Sections Using the Golgi-Cox Method

Нейроны обработки изображений внутри толстых срезов мозга с помощью метода Гольджи-Кокса

The Golgi-Cox method of neuron staining has been employed for more than two hundred years to advance our understanding of neuron morphology within ...

High-resolution Confocal Imaging of the Blood-brain Barrier: Imaging, 3D Reconstruction, and Quantification of Transcytosis

Высоким разрешением конфокальная томография Blood - brain барьер: Визуализация, 3D-реконструкции и количественной оценки Трансцитоз

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic multicellular interface that regulates the transport of molecules between the circulation and the brain. ...