Name: high-resolution volume imaging of neurons by the use of fluorescence exclusion method and dedicated microfluidic devices
Uploaded: 2018-03-26T12:30:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-resolution Volume Imaging of Neurons by the Use of Fluorescence eXclusion Method and Dedicated Microfluidic Devices at JoVE.com

Författarna vill erkänna ChiLab, material och Microsystems laboratorium - Politecnico di Torino - DISAT, i personen av Prof. C F Pirri, Dr M Cocuzza och Dr S L Marasso, för deras värdefulla stöd i processutveckling och enheten fabrication. Vi tackar Victor Racine från Quantacell för diskussion och stöd i bildbehandling. Vi är tacksamma att Isabelle Grandjean och Manon Chartier från djur anläggning av Institut Curie för deras stöd för möss, och Pablo Vargas och Ana-Maria Lennon (Institut Curie) för att förse oss med GFP LifeAct möss. Vi är tacksamma att Olivier Thouvenin från Institut Langevin och Clotilde Cadart, Larisa Venkova och Matthieu Piel från Institut Curie - UMR 144, för deras hjälp i förståelsen av fluorescens uteslutandet metod. Slutligen tackar vi den tekniska plattformen av Institut Pierre-Gilles de Gennes (CNRS UMS 3750) för deras stöd i mikrofabrikation. Detta arbete stöds delvis av den europeiska forskningen rådet Advanced Grant nr 321107 ”CellO” PSL Université (SwithNeuroTrails-projektet), ANR Investissement pris, och IPGG Labex och Equipex.

<ol>
	<li>Jun, S., Taheri-Araghi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-size+maintenance:+universal+strategy+revealed.">Cell-size maintenance: universal strategy revealed.</a> Trends Microbiol. 23 (1), 4-6 (2015).</li><li>Zlotek-Zlotkiewicz, E., Monnier, S., Cappello, G., Le Berre, M., Piel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+volume+and+mass+measurements+show+that+mammalian+cells+swell+during+mitosis.">Optical volume and mass measurements show that mammalian cells swell during mitosis.</a> J. Cell Biol. 211 (4), 765-774 (2015).</li><li>Kim, G. H., Kosterin, P., Obaid, A. L., Salzberg, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mechanical+spike+accompanies+the+action+potential+in+Mammalian+nerve+terminals.">A mechanical spike accompanies the action potential in Mammalian nerve terminals.</a> Biophys J. 92 (9), 3122-3129 (2007).</li><li>Iacono, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+Hypertrophy+in+Asymptomatic+Alzheimer+Disease.">Neuronal Hypertrophy in Asymptomatic Alzheimer Disease.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 67 (6), 578-589 (2008).</li><li>Cheli, V. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+Deletion+of+the+L-Type+Calcium+Channel+Cav1.+2+in+Oligodendrocyte+Progenitor+Cells+Affects+Postnatal+Myelination+in+Mice.">Conditional Deletion of the L-Type Calcium Channel Cav1. 2 in Oligodendrocyte Progenitor Cells Affects Postnatal Myelination in Mice.</a> J Neurosci. 36 (42), 10853-10869 (2016).</li><li>Kneynsberg, A., Collier, T. J., Manfredsson, F. P., Kanaan, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+and+semi-quantitative+measurements+of+axonal+degeneration+in+tissue+and+primary+neuron+cultures.">Quantitative and semi-quantitative measurements of axonal degeneration in tissue and primary neuron cultures.</a> J Neurosci Methods. 266, 32-41 (2016).</li><li>Fouquet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+axial+resolution+in+confocal+microscopy+with+new+high+refractive+index+mounting+media.">Improving axial resolution in confocal microscopy with new high refractive index mounting media.</a> PloS one. 10 (3), (2015).</li><li>Aguet, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+dynamics+of+dividing+cells+imaged+by+lattice+light-sheet+microscopy.">Membrane dynamics of dividing cells imaged by lattice light-sheet microscopy.</a> Mol Biol Cell. 27 (22), 3418-3435 (2016).</li><li>Roland, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannabinoid-induced+actomyosin+contractility+shapes+neuronal+morphology+and+growth.">Cannabinoid-induced actomyosin contractility shapes neuronal morphology and growth.</a> eLife. 3, (2014).</li><li>Lu, Y. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viscoelastic+properties+of+individual+glial+cells+and+neurons+in+the+CNS.">Viscoelastic properties of individual glial cells and neurons in the CNS.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 103 (47), 17759-17764 (2006).</li><li>Chen, J., Xue, C., Zhao, Y., Chen, D., Wu, M. H., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+impedance+flow+cytometry+enabling+high-throughput+single-cell+electrical+property+characterization.">Microfluidic impedance flow cytometry enabling high-throughput single-cell electrical property characterization.</a> Int J Mol Sci. 16 (5), 9804-9830 (2015).</li><li>Bottier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+measurement+of+the+height+and+volume+of+migrating+cells+by+a+novel+fluorescence+microscopy+technique.">Dynamic measurement of the height and volume of migrating cells by a novel fluorescence microscopy technique.</a> Lab Chip. 11, 3855-3863 (2011).</li><li>Cadart, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+eXclusion+Measurement+of+volume+in+live+cells.">Fluorescence eXclusion Measurement of volume in live cells.</a> Methods Cell Biol. 139, 103-120 (2017).</li><li>Marasso, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+graphene+based+nanocomposite+for+application+in+3D+flexible+micro-supercapacitors.">A novel graphene based nanocomposite for application in 3D flexible micro-supercapacitors.</a> Materials Research Express. 3 (6), 065001 (2016).</li><li>Welch, C. C., Goodyear, A. L., Wahlbrink, T., Lemme, M. C., Mollenhauer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silicon+etch+process+options+for+micro-and+nanotechnology+using+inductively+coupled+plasmas.">Silicon etch process options for micro-and nanotechnology using inductively coupled plasmas.</a> Microelectronic Engineering. 83 (4), 1170-1173 (2006).</li><li>Fath, T., Ke, Y. D., Gunning, P., G&#246;tz, J., Ittner, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+support+cultures+of+hippocampal+and+substantia+nigra+neurons.">Primary support cultures of hippocampal and substantia nigra neurons.</a> Nat. Protoc. 4 (1), 78-85 (2008).</li><li>Getting intensity values from single ROI. Image Intensity Processing Available from: <a target="_blank" href="https://imagej.net/Image_Intensity_Processing">https://imagej.net/Image_Intensity_Processing</a> (2017)</li><li>19. Tools. ImageJ User Guide Available from: <a target="_blank" href="https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146-19.html">https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146-19.html</a> (2017)</li></ol>

Författarna förklarar någon intressekonflikt.

Volym avbildning av nervceller utgör en utmaning för FXm teknik på grund av de långa och tunna förlängningar av dessa celler. Det här protokollet beskriver varianter av samma typ av mikrofabricerade enhet tillägnad neuron imaging.
Bredvid delarna av mikrofabricerade design, val av målet är grundläggande för fluorescens utslagning imaging och innebär en avvägning mellan laterala upplösning och bildskärpa. Det har visats i 13 att en hög NA som leder till ett djup av fokus mindre än höjden som kammaren inte var skadligt för precisionen för volymmätning om imaging utfördes på fokus och om en tillräcklig marginal lämnas mellan konturen av objektet av i nterest och gränserna för integration ytan. Dock försämrar användningen av en kammare som är mycket högre än skärpedjupet skärpa på grund av fotonen diffusion, vilket jämnar ut kanterna av anmärker av intresserar. Tillverkning av en 3 µm hög kammare minskar denna laterala oskärpa och förutsatt exceptionellt väl definierade fluorescerande utslagning bilder även med hög NA (0,8) 40 X mål att visualisera neuronala grenar laterala med hög upplösning.
Chip montering är ett kritiskt steg, särskilt när det gäller 3 µm hög chambers, men försiktig manipulation som beskrivs i punkt 4.1.2 undviker kollapsen av taket. Kicken ytbehandlar volym-förhållande som är kopplade till dessa tunna kammare upp även frågan om stabiliteten i Dextran koncentration över tid. Vi har kontrollerat att ytan absorptionen av Dextran efter en natt av inkubering var försumbar: efter ersättande Dextran av PBS, är skillnaden i stödnivå mellan pelaren och bakgrunden var ungefär 1 per 1000 av den ursprungliga intensitet kontrasten mellan dessa två regioner i närvaro av Dextran. Observera att nervceller kan följa både på det nedre täckglaset och på PDMS taket. Denna effekt försvinner när med mönstrade coverslips (dvs. när vi inte Inkubera självhäftande molekyler inom PDMS kammaren), som beläggningen är därför strängt lokaliserade nedtill på kammaren.
Förutom sin utmanande morfologi, nervceller är snarare lämpade för FXm på grund av att en av den största begränsningen av metoden, dvs dextran endocytos, är mycket begränsad i dessa celler. Vi väljer en 10 kDa formulering att undertrycka på lång räckvidd (timmar) någon synlig endocytos fenomen.
Sammanfattningsvis, balanseras konceptuella enkelheten i FXm av en rad experimentella problem som har lösts av detta protokoll, till exempel nanometriska PDMS strävhet och Mikrometerinställning kammare höjd eller bakgrundskorrektion att korrigera för unevennessen av PDMS taket mellan pelarna. Men ger användningen av en nära mikroflödessystem kammare att begränsa det fluorescerande mediet några särskilda begränsningar som behovet av stödpelarna, vilket sänker den effektiva ytan för celladhesion, eller nödvändigheten att utesluta soma från central kammare att iaktta neuronala förlängningar med den högsta klarhet, som begränsar regionerna i cellen tillgänglig för högupplösta observation. En möjlig utveckling av denna metod skulle vara att bli av med denna fysiska inneslutningen, för att ersättas av en optisk. Den nya utvecklingen av lätta blad mikroskopi kan kombineras med fördel med FXm i framtiden.

Exakt kunskap om cellulära volym har uppmärksammats ökat under de senaste åren, driven av frågan om cell storlek homeostas i encelliga mikroorganismer 1 och mer generellt i mitotiska celler 2. Frågan om cellvolym är dock relevant också för efter mitotiska celler, som nervceller utgör en paradigmatisk exempel.
Volymen är faktiskt en viktig signatur av fysiologiska och patologiska händelser vid olika skalor och tidpunkter i neuronala liv, från övergående axonal deformation är associerad till elektrisk aktivitet (millisekund skala) 3 till den oåterkalleliga neuronala svullnad som inträffar under den asymtomatiska fasen av neurodegenerativa sjukdomar (åren hos människa) 4. I största Volymändring sker dock i en mellanliggande tidsskala dagar eller veckor (beroende på den ansedda organismen) under neuronal tillväxt. Utökad och komplexa morfologi av nervceller väcker multiplar frågor, bland vilka regleringen av cellstorleken. Axonal längd och diameter är verkligen hårt reglerad i vivo, med värden som är specifika för varje neuronala typ 5,6.
Dessa frågor, komplexa att hantera i vivo, kan också behandlas på ett förenklat sätt in vitro-. I detta mål krävs en metod tillägnad volymmätning snabbt nog att följa tillväxtdynamik (dvs. i en tidsskala minuter) och kompatibel med observation över timmar eller dagar. Flera metoder har utvecklats under åren för att ge en direkt eller indirekt tillgång till cellulära volym in vitro. Cell återuppbyggnad från confocal imaging är en av dem, men denna metod innebär märkning och upprepade exponeringar för ljus medan du visar en begränsad axiella upplösning på ca 500 nm 7. Observera att dessa två sista nackdelar delvis övervinnas genom en mer sofistikerad och senaste metod som heter galler ljus ark mikroskopi 8. Atomic Force Microscopy har varit användas 9 men denna skanning metod är av kärnan långsam och omständlig. Den fysiska kontakten som det kräver med cellen kan dessutom störa mätningen med tanke på den extrema mjukheten av nervceller 10. Indirekta metoden använder impedans eller resonans har använts för olika cell typer 11, men är otillräcklig för utökad självhäftande celler som nervceller.
En av de mest lovande metoderna bygger på måttet på den uteslutna mängden celler i en nära kammare fylld med ett fluorescerande färgämne. Metoden fluorescens utslagning (FXm) är enkel i sin princip eftersom det kräver ingen märkning, och är lämplig för snabba och långsiktiga optisk avbildning av cellpopulationer med en potentiellt sub optiska axiella upplösning. Mer exakt, beror upplösningen i z på maximal fluorescensintensiteten i kultur kammaren (dvs. i regionen saknar celler) dividerat med det dynamiska omfånget av kameran, även om flera bullerkällor begränsa denna ultimata resolution. Denna metod har varit mycket kraftfullt att följa volymen av migrerar vidhäftande celler 12 eller studera Volymändring under Mitos av däggdjursceller, som noggrant beskrivs i 13. Nervceller utgör emellertid en metodologisk utmaning för FXm med tanke på deras omfattande förgrening in i sub Mikrometerinställning processer.
Vi presenterar här en metod som leder till tillverkning av släta FXm chambers att komma åt med hög precision volym och höjd av neuronala grenar och dynamiska strukturer som deltar i neuronal tillväxt som tillväxt kottar.
Chambers bör ha liknande höjder än objektet att mäta för att optimera axiella upplösning. Därför har vi utformat olika FXm enheter kännetecknas av centrala mätning kammare i tre olika höjder. Den tunnaste (3 µm i höjd) är tillägnad neurite mätning: här låg höjd utesluter soma, som förblir i nära 15 µm hög mellanliggande kammaren. Tjockare centrala chambers (10-12 µm) är tillräckligt höga för att följa den hela celltillväxten. Enheten har även två reservoarer placerade på vardera sidan av den centrala kammaren. Fyra injektion hål (IH) genomförs således och betecknas enligt följande: in- och utlopp tjänar till att införa de cellulära suspensioner i chipet, medan de två andra foder behållarna.
Vi har första fabricerade kalibrering coverslips för höjdmätningar med fotoresist strukturer av känd geometri. Vi har sedan avbildas gratis växande nervceller, men också morfologiskt begränsad nervceller in i micropatterns av vidhäftning.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmalab System 100</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td></td>
			<td>To perform DRIE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MJB4 mask aligner</td>
			<td>SUSS MicroTec</td>
			<td></td>
			<td>SU-8 photolithography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NXQ 4006 Mask aligner</td>
			<td>Neutronix Quintel</td>
			<td></td>
			<td>Photolithography associated to DRIE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>Diener Electronic</td>
			<td>Pico PCCE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture hood</td>
			<td>ADS Laminaire</td>
			<td>Optimale 12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Heraeus Multifuge X1R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator 37 &#176;C 5% CO2</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MCO-170AICUVH-PE IncuSafe CO2 Incubator</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescence microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMi8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS Oven between 65 and 80 &#176;C</td>
			<td>Memmert</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mechanical profilometer</td>
			<td>Veeco</td>
			<td>Dektak 6M Stylus Profiler</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical profilometer</td>
			<td>Veeco</td>
			<td>Wyko NT9100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum desiccator</td>
			<td>Verrerie Villeurbanaise (Kartel Labware)</td>
			<td>230KAR</td>
			<td>Diameter 200 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic bath sonicator</td>
			<td>Labo Moderne</td>
			<td>SHE1000</td>
			<td>Volume of the bath: 0.8 liter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hotplate</td>
			<td>Stuart SD162</td>
			<td>SD162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DRIE</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Supplementary data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Su8 Mask 1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Supplementary data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Su8 Mask 2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Supplementary data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Su8 Mask 3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Supplementary data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S1805 calibration stripes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Supplementary data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small laboratory equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mm hole puncher</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>29002519 (US reference)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel or razor blade</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9&#34; Stainless Steel Flat Spatula with Spoon</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>82027-532</td>
			<td>To demold PDMS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Top Lip Wafer Handling</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>63042-096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved tweezer</td>
			<td>FST</td>
			<td>Dumont #7 Forceps - Standard / Dumoxel</td>
			<td>To manipulate glass coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Substrates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer</td>
			<td>Prolog Semicor Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24x24 mm glass coverslips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoresists and developpers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AZ 1518 positive photoresist</td>
			<td>Microchemicals GmbH</td>
			<td></td>
			<td>Before DRIE process, thicknes 1.8 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AZ 351B developer</td>
			<td>Microchemicals GmbH</td>
			<td></td>
			<td>To develop positive AZ 1518 photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 2007</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 2025</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 2050</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PGMA developer</td>
			<td>Technic</td>
			<td></td>
			<td>To develop SU-8 negative photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microposit S1805 resist</td>
			<td>Chimie Tech Services</td>
			<td></td>
			<td>Positive photoresist used to obtain 0.5&#181;m high structures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MF 26A developer</td>
			<td>Chimie Tech Services</td>
			<td></td>
			<td>To develop positive S1805 photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory consumables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable plastic pipette 3 mL</td>
			<td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P100 Petri dishes</td>
			<td>TPP</td>
			<td>93100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL syringe</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>SS+20ES1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transparent scotch tape</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square wipes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>115-2148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>DUTSCHER</td>
			<td>90260</td>
			<td>Plastic paraffin film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(3-Methacryloxypropyl)trichlorosilane</td>
			<td>abcr</td>
			<td>AB 109004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS and curing agent Sylgard 184</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>761036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isopropanol</td>
			<td></td>
			<td>W292907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly-ornithine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4957 - 50 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>02865</td>
			<td>99.8%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-methacryloxypropyl-trimethoxysilane</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>M6514-25ML</td>
			<td>(C4H5O2)-(CH2)3- Si(OCH3)3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acetic acid</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>71251-5ML-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran 10kW conjugated with Alexa488</td>
			<td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td>
			<td>D22910</td>
			<td>Absoprtion at 488 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran 10kW conjugated with Alexa647</td>
			<td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td>
			<td>D22914</td>
			<td>Absoprtion at 647 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM</td>
			<td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td>
			<td>21090-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td>
			<td>26050088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td>
			<td>12587-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax 200 mM</td>
			<td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate GIBCO 100 mM</td>
			<td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td>
			<td>15710-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS 10x</td>
			<td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td>
			<td>14180-046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes 1M</td>
			<td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td>
			<td>15630-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trypsin-EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>59418C-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal</td>
			<td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal without phenol red</td>
			<td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td>
			<td>12348-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Softwares</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Routine in Matlab for background normalization</td>
			<td>Quantacell</td>
			<td>Contact Victor Racine: victor.racine@quantacell.com</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To select specific ROI for image analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Routine</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td>Supplementary data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Routine</td>
			<td>Matlab</td>
			<td></td>
			<td>Supplementary data</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-resolution volume imaging of neurons by the use of fluorescence exclusion method and dedicated microfluidic devices

Volym är en viktig parameter angående fysiologiska och patologiska kännetecken av nervceller på olika tidsskalor. Nervceller är ganska unika celler angående deras utökade förgrenat morfologier och följaktligen höja flera metodologiska utmaningar för volymmätning. I det särskilda fallet med in vitro- neuronal tillväxt, bör den valda metoden inkluderar sub Mikrometerinställning axiella upplösning kombinerat med full-fält observation på tidsskalor från minuter till timmar eller dagar. Till skillnad från andra metoder som cell form återuppbyggnad med confocal imaging, elektriskt-baserade mätningar eller Atomic Force Microscopy, har den nyligen utvecklade fluorescens utslagning metoden (FXm) potential att uppfylla dessa utmaningar. Men trots att de är enkla i dess princip, kräver genomförandet av en högupplöst FXm för nervceller flera justeringar och en särskild metod. Vi presenterar här en metod baserad på kombinationen av fluorescens utslagning, låg-ojämnheter flera fack mikroflödessystem enheter och slutligen micropatterning att uppnå in vitro- mätningar av lokal neuronala volym. Den höga upplösningen som tillhandahålls av enheten tillät oss att mäta den lokala volymen av neuronala processer (neuriter) och volymen av vissa specifika strukturer som deltar i neuronal tillväxt, såsom tillväxt kottar (GCs).

Resultatet av processen för tillverkning som beskrivs i avsnitt 1 och 2 illustreras av bilder av figur 1A-1B och kurvan i figur 1 c. Tabellen i figur 1 d visar ojämnheter värdena av två olika representativa områden av PDMS chip, dvs i central och 20 µm hög nästa mellanliggande kammaren. En minskning av ojämnheter med en faktor på ca 7 har erhållits med etsade Si wafer i stället för SU-8 fotoresist. FXm var sedan först tillämpas på en fotoresist rand av känd geometri (figur 2A) inom en 10 µm hög kammare. Efter bildbehandling och intensitet till höjd konvertering (se grafen av figur 2B), FXm profiler utförs på tvärsnitt längs denna rand (figur 2 c) ger önskad höjd profiler (figur 2D). Figur 2D visar jämförelsen mellan profiler som erhållits med mekanisk profilometry och FXm metoder. Dessa profiler, inklusive kant och platå värde, är mycket lika, validera metoden. Observera att spridningen av FXm data inte är representativa för den ultimata resolutionen av metoden, som vidare bedömas i figur 3 och figur 4, men resultaten från lågintensivt anställd för att undvika en möjlig effekt av den mycket svaga Auto-fluorescens av fotoresist i GFP-kanal.
Då observerade vi neuriter i 3 µm och 10 µm hög kammare (figur 3). Standardavvikelsen för bakgrundsljud är ungefär 18 nm efter intensitet till höjd konvertering och bakgrunden korrigering. Detta värde är något högre än fysiska ojämnheter på PDMS ytor gjuten på kisel ytor (12 nm, se tabellen i figur 1 d) men mycket lägre än den strävhet som mäts på PDMS erhållits från SU-8 formar. Dessa resultat belysa mervärdet av att borra brunnar i kiselskivor i stället för att öppna hål i SU-8 fotoresist att gjuta pelarna. Ett sådant lågt värde tillåter en hög signal till brus-förhållande och mycket tydliga bilder i volym som det visas i figur 3A. Som ett exempel på data som hämtas från sådana bilder, vi beräknas volymen av 1,6 µm (dvs 10 pixlar) brett neurite skiva (se grafen av figur 3B). Använda i en första approximation en linjär passform av dessa data ger en genomsnittlig neurite höjdvärde av cirka 400 nm, att jämföras med t.ex. 500-nm axonal diameter Funna i 10 dagar gamla ungar inom corpus callosum 5. Vi har också kombinerat FXm med micropatterns av vidhäftning bestående av seriellt abutted 2 µm och 6 µm breda ränder 30 µm i längd. Vårt mål var att studera inverkan av neurite bredd på dess 3D-formen. Figur 3 c visar en 3D-representation i falsk färg av en hela neuron-bild som erhållits i en 10 µm hög kammare. Neuriter sprids på 2 µm och 6 µm breda ränder, medan soma ligger på delen av den största randen. Höjd profiler drogs i tre olika tvärsnitt. I konsekvens med graph visas i figur 3A, integrerade ytan över tvärsnitt ökar med neurite bredd (figur 3D).
Vi har också fokuserat på tillväxt kon (GC) 3D-strukturer. Figur 4 A-B visar två olika GC profilerna som erhållits i en 3 µm hög kammare, som belyser deras Grenade sub-strukturen. Dessutom utförde vi time-lapse experiment för att följa dynamiken i volymen av GCs i en 12 µm hög kammare. Figur 4 c visar en cykel av krympande och reaktivering av en given GC inom en tidsskala på några tiotals minuter. Tack vare användningen av GFP-lifeact möss, tillväxt kottar var lokaliserade i GFP utsläpp våglängden (510 nm) från deras höga aktin koncentration. Den ytan som identifierats vid våglängden som användes för att integrera över dextran utsläpp våglängden på 647 nm att beräkna GC volym. Figur 4 d visar slutligen fördelningen av GC volym vid olika tidpunkter och läge på tre olika neuroner, centrerad på ett värde av ca 6 µm3.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56923/56923fig1v2.jpg"> Figur 1: FXm PDMS chambers. (A) system av fyra olika huvudsakliga stegen av mikrofabrikation leder till den slutliga mögel. Platsen av inlopp, utlopp och reservoarer indikeras. Skala barer: 1 mm. (B) bild av PDMS FXm kammaren erhålls med en optisk profilometer. Denna bild visar den centrala kammaren innehållande 3 rader av 10 µm hög pelare och mellanliggande avdelningar med 20, 50 och 90 µm i höjd. Skalstapeln: 500 µm. (C) tvärsnittsvyn av chip i två streckad linje dras i (B). Gul/guld: tvärsnitt utefter pelare, blå: tvärsnitt mellan pelarna. (D) menar värden av PDMS råhet mätt på 50 × 50 µm2 områden gjutna på kisel och på 20 µm hög SU-8 mellanliggande förbränningskammaren (se pilarna för lokalisering av dessa områden). Genomsnittliga värden erhölls från mätningar av tre olika områden. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/56923fig1v2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56923/56923fig2.jpg"> Figur 2: kalibrering av FXm metoden använder en fotoresist rand som objekt av intresse. (A) GFP-fluorescens bild tagen i en 10 µm hög kammare fylld med 10.000 MW dextran absorberande på 488 nm vid 1 mg/mL. (B: bakgrund, P: pelaren). Observation med en torr 40 X NA 0,8 objektiv. Skalstapeln: 50 µm. (B) linjär kalibrering lag erhållits från genomsnittliga intensiteten av de två färgade rektanglar som visas i A. (C) fluorescens intensiteten profil erhålls i nivå med den blå streckad linje visas i (A), passerar fotoresist rand (0.45 µm hög positiv fotoresist). (D) jämförelse av de profiler som erhålls från mekaniska profilometer (svarta prickar) och FXm efter intensitet till höjd konvertering av data av (B) (blå prickar). <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/56923fig2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56923/56923fig3.jpg"> Figur 3: Neurite volym imaging. (A) Neurite sträcker sig in i centrala 3 µm hög kammaren från soma ligger i nästa 15 µm mellanliggande kammaren. Imaging utförs med 10 000 MW dextran absorberande på 488 nm och en 40 X, NA 0,8 torka mål. Den infällda erhållits efter användning av rutinen bakgrund minskning belyser de två neuriter och valt att rita grafen till höger. Skala barer: 30 µm. (B) Neurite skiva volym som en funktion av neurite bredd erhålls från 22 profilerna (genomsnitt på 10 pixlar, dvs på en 1,6 µm ”neurite slice”) visas i (A). Den heldragna linjen representerar en linjär passform lutning 0,4 µm passerar genom origo. (C) falsk färgbild av en mönstrad neuron på en självhäftande remsa tillverkad av successiva 2 µm och 6 µm breda stubbar (representerade i vitt). Mätningarna gjordes i en 10 µm hög kammare fylld med 10.000 MW dextran absorberande på 647 nm och använder en 40 x NA 0,8 torka mål. (D) höjd profiler motsvarar de färgade streckade linjer som visas i (C), att hålla samma färgkod. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/56923fig3large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56923/56923fig4.jpg"> Figur 4: statiska och dynamiska tillväxt kon imaging. (A-B) Tillväxt kon höjd profiler erhålls i en 3 µm hög kammare efter intensitet till höjd konvertering längs de gula linjerna som visas i tillhörande bilder. Observation som utförs med en fyllning med 10 000 MW dextran absorberande på 488 nm och en 40 X, NA 0,8 torka mål. (C) hela neuron imaging i en 12 µm hög kammare fylld med 10.000 MW dextran absorberande på 647 nm. Observationer har gjorts i två fluorescerande kanaler: GFP för tillväxt kon lokalisering (streckad gul linje) och CY5 att beräkna GC volym från fluorescens utslagning. Ytan ingår streckad gul linje användes för att beräkna GC volym. Diagrammet visar variationen av GC volym över tid och associerade morfologier i både god Jordbrukarsed och CY5 kanaler i två representativa olika tidpunkter. Alla data förvärvades använder en 40 x NA 0,8 torka mål varje 3 min. skala barer: 10 µm. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/56923fig4large.jpg" target="_blank">vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Steg</td>
			<td>Maskera 1:8 µm skikt</td>
			<td>Maskera 2:30 µm skikt</td>
			<td>Maskera 3:40 µm skikt</td>
		</tr>
<tr>
<td>SU-8 typ</td>
			<td>2007</td>
			<td>2025</td>
			<td>2050</td>
		</tr>
<tr>
<td>Spincoating</td>
			<td>30 s @ 2000 rpm</td>
			<td>30 s @ 3050 rpm</td>
			<td>30 s @ 3250 rpm</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mjuk baka</td>
			<td>3 min @ 95 ° C</td>
			<td>2 min @ 65 ° C + 6 min @ 95 ° C</td>
			<td>3 min @ 65 ° C + 7 min @ 95 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Exponering energi</td>
			<td>110 mJ/cm2
</td>
			<td>155 mJ/cm2
</td>
			<td>170 mJ/cm2
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Efter exponering baka</td>
			<td>4 min @ 95 ° C</td>
			<td>1 min @ 65 ° C + 6 min @ 95 ° C</td>
			<td>2 min @ 65 ° C + 7 min @ 95 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Utveckling</td>
			<td>2 min 30 s</td>
			<td>5 min</td>
			<td>6 min</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hårda baka (tillval)</td>
			<td>3-5 min vid 200 ° C</td>
			<td>3-5 min vid 200 ° C</td>
			<td>3-5 min vid 200 ° C</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1: utförda Photolithography steg för att bygga en enhet som innehåller en central avdelning med 12 μm i höjd. Höjder på mellanliggande avdelningar: 20, 50 och 90 µm.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Steg</td>
			<td>Maskera 1:10 µm skikt</td>
			<td>Maskera 2:30 µm skikt</td>
			<td>Maskera 3:40 µm skikt</td>
		</tr>
<tr>
<td>SU-8 typ</td>
			<td>2007</td>
			<td>2025</td>
			<td>2050</td>
		</tr>
<tr>
<td>Spincoating</td>
			<td>30 s @ 1500 rpm</td>
			<td>30 s @ 3050 rpm</td>
			<td>30 s @ 3250 rpm</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mjuk baka</td>
			<td>3 min @ 95 ° C</td>
			<td>2 min @ 65 ° C + 6 min @ 95 ° C</td>
			<td>3 min @ 65 ° C + 7 min @ 95 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Exponering energi</td>
			<td>125 mJ/cm2
</td>
			<td>155 mJ/cm2
</td>
			<td>170 mJ/cm2
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Efter exponering baka</td>
			<td>4 min @ 95 ° C</td>
			<td>1 min @ 65 ° C + 6 min @ 95 ° C</td>
			<td>2 min @ 65 ° C + 7 min @ 95 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Utveckling</td>
			<td>2 min 30 s</td>
			<td>5 min</td>
			<td>6 min</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hårda baka (tillval)</td>
			<td>3-5 min vid 200 ° C</td>
			<td>3-5 min vid 200 ° C</td>
			<td>3-5 min vid 200 ° C</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 2: utförda Photolithography steg för att bygga en enhet som innehåller en central avdelning med 10 μm i höjd. Höjder på mellanliggande avdelningar: 20, 50 och 90 µm.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Steg</td>
			<td>Maskera 1:12 µm skikt</td>
			<td>Maskera 2:32 µm skikt</td>
			<td>Maskera 3:40 µm skikt</td>
		</tr>
<tr>
<td>SU-8 typ</td>
			<td>2015</td>
			<td>2025</td>
			<td>2050</td>
		</tr>
<tr>
<td>Spincoating</td>
			<td>30 s @ 3250 rpm</td>
			<td>30 s @ 2500 rpm</td>
			<td>30 s @ 3250 rpm</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mjuk baka</td>
			<td>3 min @ 95 ° C</td>
			<td>2 min @ 65 ° C + 5 min @ 95 ° C</td>
			<td>3 min @ 65 ° C + 7 min @ 95 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Exponeringstid</td>
			<td>140 mJ/cm2
</td>
			<td>157 mJ/cm2
</td>
			<td>170 mJ/cm2
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Efter exponering baka</td>
			<td>4 min @ 95 ° C</td>
			<td>1 min @ 65 ° C + 5 min @ 95 ° C</td>
			<td>2 min @ 65 ° C + 7 min @ 95 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Utveckling</td>
			<td>3 min</td>
			<td>5 min</td>
			<td>6 min</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hårda baka (tillval)</td>
			<td>3-5 min vid 200 ° C</td>
			<td>3-5 min vid 200 ° C</td>
			<td>3-5 min vid 200 ° C</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 3: utförda Photolithography steg för att bygga en enhet som innehåller en central avdelning med 3 μm i höjd. Höjder på mellanliggande avdelningar: 18, 50 och 90 µm.
Kompletterande data 1: masks_neuron_volume_chips.tiff. Schematisk bild av de masker som används för att tillverka PDMS enheten (DRIE mask och masker 1-3). <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/masks_neuron_volume_chips.tiff">Vänligen klicka här för att hämta den här filen.</a>
Kompletterande data 2: filen ”masks_neuron_volume_chips.dxf”. Elektroniska filer gör det möjligt för att tillverka DRIE masken och masker 1-3. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/masks_neuron_volume_chips.dxf">Vänligen klicka här för att hämta den här filen.</a>
Kompletterande data 3: ”Mask_Photoresist-stripes.dxf”. Elektroniska filer gör det möjligt för att tillverka den mask som används för photolithographyen av fotoresist ränder. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/Mask_Photoresist-stripes.dxf">Vänligen klicka här för att hämta den här filen.</a>
Kompletterande data 4: fil conversion_mattotiff.m <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/conversion_mattotiff.m">vänligen klicka här för att hämta den här filen.</a>
Kompletterande data 5: fil importfilevol.m <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/importfilevol.m">vänligen klicka här för att hämta den här filen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about High-resolution Volume Imaging of Neurons by the Use of Fluorescence eXclusion Method and Dedicated Microfluidic Devices at JoVE.com

High-resolution Volume Imaging of Neurons by the Use of Fluorescence eXclusion Method and Dedicated Microfluidic Devices

Volym är en viktig parameter om fysiologiska och patologiska egenskaperna hos cellerna. Vi beskriver en fluorescerande utslagning metod så att full-fältmätningar av in vitro- neuronala volym med sub Mikrometerinställning axiella upplösning krävs för analysen av neuriter och dynamiska strukturer antyds i neuronal tillväxt.

Högupplösta volym Imaging av nervceller genom användning av fluorescens uteslutning metod och dedikerade mikroflödessystem enheter

Volume is an important parameter regarding physiological and pathological characteristics of neurons at different time scales. Neurons are quite unique ...

The overall goal of this procedure is to allow full field measurement of in vitro neuronal volume with submicrometric axial resolution required for the analysis of neurites in dynamic structures implied in neuronal growth. This method can help answer key questions in the field of cellular neuroscience regarding the dynamics of volume changes at the subsididal scale during the nongrowth or axon degeneration. The main advantage of this technique is that it provides submicrometric axial resolution combined with full fit observation and time scale to hours or days.To begin the procedure, demold the PDMS block under a chemical hood by pouring isopropanol on it. Next, place it on the stainless steel bench of the hood. Cut around the silicone wafer and demold the PDMS replica.Then, cut around the chip and leave a two millimeter margin using a scalpel or a razor blade. Punch the inlet by pressing the 1.5 millimeter diameter puncher firmly and actuate it in order to cut and carve the hole of the inlet. Do the same at the four dedicated zones of the chip where liquid will be injected.Afterward, clean the chip by sticking and peeling the adhesive tape on the microstructured side. Sprinkle isopropanol on both sides. Then, dry the chip with pressurized nitrogen using an air blow gun.In this procedure, place each coverslip on a spin-coater located in a clean room environment. Apply a drop of the positive photoresist to cover about 75%of the coverslip and spin-coat at 4000 rpm for 30 seconds to reach a final thickness of 0.45 micrometer. Place the coverslips on a hotplate with a surface temperature of 115 degrees Celsius for one minute.Using a mask aligner, expose each coverslip at a wavelength of 435 nanometer through the dedicated mask according to the fabricant parameters. Next, prepare two glass crystallizing dishes, one containing the developer without dilution, the other containing deionized water. Dip the coverslips one by one in the developer for one minute while continuously and gently stirring the crystallizing dish.Then, submerge the wafer in deionized water for about five seconds. Transfer the wafer to an absorbent paper and dry it with pressurized nitrogen using an air blow gun. Place both the PDMS chip and the glass dish on which it will be bonded into the plasma chamber for surface activation.Next, deposit a drop of water on a rectangular thick microscope glass slide and stick the coverslip on the glass slide by capillarity. Under a microscope, mark the location of the photoresist stripes at the rear of the glass slide. Place the patterned glass coverslip on the mask holder of the mask aligner.Rely on the mark made to center the photoresist reference objects. To increase the optic contrast, place a silicon wafer beneath the PDMS chip. The silicon wafer should remain firmly attached on the chuck during the alignment process.Then, place the PDMS chip on the mobile substrate holder of the mask aligner. Subsequently, lift the chuck enough to visualize both the chip and the array of photoresist stripes located on the coverslip while staying behind the mechanical contact. Perform alignment and achieve mechanical contact between the chip and the coverslip by lifting the chuck until the surface of PDMS pillars touches the glass coverslip.After that, lower the chuck. Remove the coverslip bonded to the chip from the mask holder. Then, place the device into a 35 millimeter Petri dish and transfer everything into the oven for five to ten minutes to increase the bonding strength.Thirty minutes after bonding, place a ten microliter pipette tip filled with PLO solution at the inlet. Then, load the liquid until forming a drop on top. Repeat the same operation at the outlet and reservoirs.Subsequently, add PBS in the Petri dish all around the chip. Seal the Petri dish with a paraffin film and incubate at room temperature with a minimum of five hours. Then, press a ten microliter tip cone lightly into each injection hole and suck up the excess liquid.Next, replace PLO as well as the PBS surrounding the chip by the culture medium. Afterward, place the chip in the incubator regulated at 37 degrees Celsius and 5%carbon dioxide until neurons seed with a minimum of five hours incubation time. In this procedure, draw up the culture medium from the chip.Collect two to three microliters of the freshly resuspended cell solution and inject it at the inlet. Immediately repeat the same operation at the outlet. Inject about the same volume of culture medium in each reservoir.Quickly observe the chip under the microscope to check the density of the cells. The order of magnitude of the optimal cell density corresponds to about five to ten cells within the square surface delimited by four pillars. Repeat the procedure of injection of 0.5 to 1 microliter of cell suspension to reach the targeted cell density.For imaging, replace the culture medium with the imaging medium. Then, place the chip under an epifluorescence microscope. Acquire images of cells from single to multiple successive images in case of time-lapse experiments.Shown here are the representative observations of a calibration photoresist stripe and neurons. Higher magnification images and cross-sections of these objects are displayed on the right. The representative neurites and a three micrometer high central chamber are shown here.The volume of neurite slice can be computed as a function of neurite width. And here are the representative growth cones and a three micrometer high central chamber. Their substructures emerge clearly from an optical background noise of about 20 nanometers.Time-lapse observations of life act neurons seeded into a 12 micrometer high chamber to follow the cycle of shrinking and reactivation of the growth cone within a time scale of a few tens of minutes. While attempting this procedure, it's important to have an access to a deep ion etching equipment to fabricate the silicon mud. After watching this video, you should have a good understanding of how to align a structured glass coverslip with a PDMS chip.Once mastered, this technique can be reproducibly applied to the quantification of neurology in 3d. This technique paved the way for researchers in the field of pharmacology to explore the effect of various drugs with actual caliber all in closed cone shape. Don't forget that working with primary neurons require a lot of care to avoid contamination and shatters.Be always gentle and quick when changing media in order to limit the time they spend outside incubator.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

An Organotypic Slice Assay for High-Resolution Time-Lapse Imaging of Neuronal Migration in the Postnatal Brain

En Organotypic Slice-analys för högupplöst Time-lapse avbildning av neuronala migration i Postnatal Brain

Neurogenesis in the postnatal brain depends on maintenance of three biological events: proliferation of progenitor cells, migration of neuroblasts, as ...

A Rapid Approach to High-Resolution Fluorescence Imaging in Semi-Thick Brain Slices

En snabb metod för högupplöst fluorescens avbildning i semi-Tjock hjärnan skivor

A fundamental goal to both basic and clinical neuroscience is to better understand the identities, molecular makeup, and patterns of connectivity that are ...

High-resolution Functional Magnetic Resonance Imaging Methods for Human Midbrain

Högupplösta functional magnetic resonance imaging metoder för Human mitthjärnan

Functional MRI (fMRI) is a widely used tool for non-invasively measuring correlates of human brain activity. However, its use has mostly been focused upon ...

High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

Högupplöst Live avbildning av cellens beteende i utvecklingsländerna neuroepitelet

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central ...

Analysis of Developing Tooth Germ Innervation Using Microfluidic Co-culture Devices

Analys av Utveckling Tooth Germ Innervation Använda mikroflödes Co-kultur-enheter

Innervation plays a key role in the development, homeostasis and regeneration of organs and tissues. However, the mechanisms underlying these phenomena ...

High-resolution Structural Magnetic Resonance Imaging of the Human Subcortex In Vivo and Postmortem

High-resolution Structural Magnetic Resonance Imaging of the Human Subcortex In Vivo and Postmortem

Högupplöst Strukturell Magnetic Resonance Imaging av Human subcortex<I&gt; In Vivo</I&gt; Och Postmortem

The focus of this study was to test the resolution limits of structural MRI of a postmortem brain compared to living human brains. The resolution of ...

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Fluorescens och Bioluminescence avbildning av Subcellulär Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; I Aged hippocampus nervceller

Susceptibility to neuron cell death associated to neurodegeneration and ischemia are exceedingly increased in the aged brain but mechanisms responsible ...

High-Resolution Quantitative Immunogold Analysis of Membrane Receptors at Retinal Ribbon Synapses

Högupplösta Kvantitativ immunogold Analys av membranreceptorer på näthinnan Ribbon synapser

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA ...

Imaging Neurons within Thick Brain Sections Using the Golgi-Cox Method

Imaging nervceller inom Tjocka hjärnsnitt Använda Golgi-Cox Method

The Golgi-Cox method of neuron staining has been employed for more than two hundred years to advance our understanding of neuron morphology within ...

High-resolution Confocal Imaging of the Blood-brain Barrier: Imaging, 3D Reconstruction, and Quantification of Transcytosis

Högupplösta Confocal avbildning av den Blood - brain barriären: bildbehandling, 3D rekonstruktion och kvantifiering av transcytos

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic multicellular interface that regulates the transport of molecules between the circulation and the brain. ...