Name: high-resolution volume imaging of neurons by the use of fluorescence exclusion method and dedicated microfluidic devices
Uploaded: 2018-03-26T12:30:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-resolution Volume Imaging of Neurons by the Use of Fluorescence eXclusion Method and Dedicated Microfluidic Devices at JoVE.com

Yazarlar süreç geliştirme ve cihaz imalat değerli destek için ChiLab, malzeme ve Microsystems laboratuvar - Politecnico di Torino - DISAT, Prof. C F Pirri, Dr. M Cocuzza ve Dr. S L Marasso, bizzat kabul etmek istiyorum. Victor Racine Quantacell üzerinden tartışma ve görüntü işleme desteği için teşekkürler. GFP LifeAct fareler ile bize sağlamak için hayvan tesisin Institut Curie destekleri için fare ve Pablo Vargas ve Ana-Maria Lennon (Institut Curie) Isabelle Grandjean ve Manon Chartier için sana şükrediyoruz. Olivier Thouvenin Institut Langevin ve Clotilde Cadart, Larisa Venkova ve Matthieu Piels üzerinden Institut Curie - UMR 144, Floresans dışlama yöntemi anlamada yardım için minnettarız. Nihayet, Institut Pierre-Gilles de Gennes (CNRS UMS 3750) teknolojik platform desteklerinden dolayı microfabrication içinde teşekkür ederim. Bu eser Avrupa Araştırma Konseyi gelişmiş Grant No 321107 tarafından "Çello," kısmen desteklenen PSL Université (SwithNeuroTrails Projesi), ANR Investissement d'Avenir ve IPGG Labex ve Equipex.

<ol>
	<li>Jun, S., Taheri-Araghi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-size+maintenance:+universal+strategy+revealed.">Cell-size maintenance: universal strategy revealed.</a> Trends Microbiol. 23 (1), 4-6 (2015).</li><li>Zlotek-Zlotkiewicz, E., Monnier, S., Cappello, G., Le Berre, M., Piel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+volume+and+mass+measurements+show+that+mammalian+cells+swell+during+mitosis.">Optical volume and mass measurements show that mammalian cells swell during mitosis.</a> J. Cell Biol. 211 (4), 765-774 (2015).</li><li>Kim, G. H., Kosterin, P., Obaid, A. L., Salzberg, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mechanical+spike+accompanies+the+action+potential+in+Mammalian+nerve+terminals.">A mechanical spike accompanies the action potential in Mammalian nerve terminals.</a> Biophys J. 92 (9), 3122-3129 (2007).</li><li>Iacono, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+Hypertrophy+in+Asymptomatic+Alzheimer+Disease.">Neuronal Hypertrophy in Asymptomatic Alzheimer Disease.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 67 (6), 578-589 (2008).</li><li>Cheli, V. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+Deletion+of+the+L-Type+Calcium+Channel+Cav1.+2+in+Oligodendrocyte+Progenitor+Cells+Affects+Postnatal+Myelination+in+Mice.">Conditional Deletion of the L-Type Calcium Channel Cav1. 2 in Oligodendrocyte Progenitor Cells Affects Postnatal Myelination in Mice.</a> J Neurosci. 36 (42), 10853-10869 (2016).</li><li>Kneynsberg, A., Collier, T. J., Manfredsson, F. P., Kanaan, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+and+semi-quantitative+measurements+of+axonal+degeneration+in+tissue+and+primary+neuron+cultures.">Quantitative and semi-quantitative measurements of axonal degeneration in tissue and primary neuron cultures.</a> J Neurosci Methods. 266, 32-41 (2016).</li><li>Fouquet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+axial+resolution+in+confocal+microscopy+with+new+high+refractive+index+mounting+media.">Improving axial resolution in confocal microscopy with new high refractive index mounting media.</a> PloS one. 10 (3), (2015).</li><li>Aguet, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+dynamics+of+dividing+cells+imaged+by+lattice+light-sheet+microscopy.">Membrane dynamics of dividing cells imaged by lattice light-sheet microscopy.</a> Mol Biol Cell. 27 (22), 3418-3435 (2016).</li><li>Roland, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannabinoid-induced+actomyosin+contractility+shapes+neuronal+morphology+and+growth.">Cannabinoid-induced actomyosin contractility shapes neuronal morphology and growth.</a> eLife. 3, (2014).</li><li>Lu, Y. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viscoelastic+properties+of+individual+glial+cells+and+neurons+in+the+CNS.">Viscoelastic properties of individual glial cells and neurons in the CNS.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 103 (47), 17759-17764 (2006).</li><li>Chen, J., Xue, C., Zhao, Y., Chen, D., Wu, M. H., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+impedance+flow+cytometry+enabling+high-throughput+single-cell+electrical+property+characterization.">Microfluidic impedance flow cytometry enabling high-throughput single-cell electrical property characterization.</a> Int J Mol Sci. 16 (5), 9804-9830 (2015).</li><li>Bottier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+measurement+of+the+height+and+volume+of+migrating+cells+by+a+novel+fluorescence+microscopy+technique.">Dynamic measurement of the height and volume of migrating cells by a novel fluorescence microscopy technique.</a> Lab Chip. 11, 3855-3863 (2011).</li><li>Cadart, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+eXclusion+Measurement+of+volume+in+live+cells.">Fluorescence eXclusion Measurement of volume in live cells.</a> Methods Cell Biol. 139, 103-120 (2017).</li><li>Marasso, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+graphene+based+nanocomposite+for+application+in+3D+flexible+micro-supercapacitors.">A novel graphene based nanocomposite for application in 3D flexible micro-supercapacitors.</a> Materials Research Express. 3 (6), 065001 (2016).</li><li>Welch, C. C., Goodyear, A. L., Wahlbrink, T., Lemme, M. C., Mollenhauer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silicon+etch+process+options+for+micro-and+nanotechnology+using+inductively+coupled+plasmas.">Silicon etch process options for micro-and nanotechnology using inductively coupled plasmas.</a> Microelectronic Engineering. 83 (4), 1170-1173 (2006).</li><li>Fath, T., Ke, Y. D., Gunning, P., G&#246;tz, J., Ittner, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+support+cultures+of+hippocampal+and+substantia+nigra+neurons.">Primary support cultures of hippocampal and substantia nigra neurons.</a> Nat. Protoc. 4 (1), 78-85 (2008).</li><li>Getting intensity values from single ROI. Image Intensity Processing Available from: <a target="_blank" href="https://imagej.net/Image_Intensity_Processing">https://imagej.net/Image_Intensity_Processing</a> (2017)</li><li>19. Tools. ImageJ User Guide Available from: <a target="_blank" href="https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146-19.html">https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146-19.html</a> (2017)</li></ol>

Yazarlar hiçbir çıkar çatışması beyan ederim.

Birim görüntüleme nöronların uzun ve ince uzantıları bu hücreler nedeniyle FXm tekniği için bir meydan okuma kabul ettiğiniz anlamına gelir. Bu iletişim kuralı aynı nöron görüntüleme için adanmış mikrosıvısal aygıt türü türevleri açıklar.
Mikrosıvısal tasarım yönleri, yanında objektif seçimi Floresans dışlama görüntüleme için esastır ve yanal çözünürlük ve görüntü netliği arasında bir denge anlamına gelir. 13 ' te odak derinliğe kadar Oda yüksekliği daha küçük önde gelen yüksek bir NA görüntüleme odak gerçekleştirdiyseniz ve ben nesnenin kontur arasında yeterli bir kenar boşluğu bırakıldığı takdirde birim ölçü duyarlık için zararlı olmadığını gösterilmiştir nterest ve entegrasyon yüzeyi sınırları. Ancak, odak derinliği yüksek bir odası kullanımı faiz nesnelerin kenarlarını foton difüzyon, hangi düzgünleştirir nedeniyle görüntü netliği bozar. 3 µm yüksek odası imalatı bu yanal bulanıklaştırma azaltılmış ve son derece iyi tanımlanmış floresan dışlama görüntüleri bile yüksek NA kullanarak sağlanan (0.8) 40 X hedefleri nöronal dalları yüksek yanal çözünürlük ile görselleştirmek için.
Montaj çip bir kritik adım, özellikle söz konusu olduğunda 3 µm yüksek chambers, ama dikkatli işleme 4.1.2 içinde açıklandığı gibi çatı çöküşü önler. Bu ince odalarına ilişkili hacim oranı yüksek yüzeye de zamanla Dextran konsantrasyon kararlılığını gündeme. Biz Dextran yüzey emilimini kuluçka bir geceden sonra önemsiz kontrol ettirin: PBS tarafından Dextran değiştirdikten sonra yoğunluk farkı ayağı ile arka plan arasında yaklaşık 1000 arasında ilk yoğunluğu kontrast başına 1 oldu Bu iki bölgenin Dextran huzurunda. Nöronların alt coverslip hem PDMS çatıda uygun unutmayın. Desenli coverslips (ne zaman PDMS odası içinde yapışkan molekülleri kuluçkaya değilYani ), kaplama olarak kullanarak bu nedenle kesinlikle odası dibinde yerelleştirildiğinde bu etkisi kaybolur.
Gerçeğini yöntemi, Yani dextran endositoz, büyük sınırlandırılması biridir çok sınırlı nedeniyle zorlu onların morfolojisi dışında nöronlar FXm için oldukça uygundur bu hücrelerde. Bir 10 seçtiğimiz kDa formülasyonu uzun bastırmak için aralığı (saat) herhangi görünür endositoz olayları.
Sonuç olarak, FXm kavramsal sadeliği bir dizi nanometric PDMS pürüzlülük ve micrometric odası yükseklik veya eşitsizlik için düzeltmek için arka plan düzeltme gibi mevcut protokolü tarafından çözüldüğünü deneysel sorununu tarafından dengelenir sütunlar arasında PDMS tavan. Ancak, floresan orta sınırlamak için yakın mikrosıvısal odası kullanımı birkaç belirli kısıtlamalar etkili yüzey hücre adezyon veya merkezden soma dışlamak için zorunluluk için kullanılabilir düşüren destek ayağı, ihtiyaç gibi verimleri odası nöronal uzantıları yüksek çözünürlüklü gözlem için erişilebilir hücre bölgelerinde kısıtlar en yüksek netlik ile gözlemlemek için. Bu yöntemin olası bir evrim optik bir tarafından değiştirilmesi bu fiziksel doğumdan kurtulmak olacaktır. Hafif levha mikroskobu yeni gelişme avantajlı FXm ile gelecekte birlikte.

Hücresel biriminin kesin bilgi hücre boyutu homeostazı tek hücreli mikroorganizmalar 1 ve daha genel olarak Mitotik hücre 2' deki sayısında tarafından tahrik son yıllarda artış dikkat çekti. Ancak, hücre hacmi için nöronlar paradigmatik bir örnek teşkil da sonrası Mitotik hücreler için ilgili sorunu.
Gerçekten de farklı ölçekler ve zaman-Puan fizyolojik ve patolojik olayların önemli bir imza elektriksel aktivite (milisaniye ölçek) 3 ' e geri dönüşü ile ilişkili geçici aksonal deformasyon gelen nöronal hayatında birimdir nöronal nörodejeneratif hastalıklar (insanlarda yılda) 4, asemptomatik aşamasında meydana gelen şişlik. Ancak, gün veya hafta (bağlı olarak düşünülmüş organizma) nöronal büyüme sırasında bir ara zaman ölçeği içinde en büyük birim değişikliği oluşur. Nöronların uzun ve karmaşık morfolojisi arasında hangi katları sorunlara yol açtı hücre boyutu düzenlenmesi. Aksonal uzunluğu ve çapı gerçekten sıkı bir şekilde düzenlenmiş vivo içindeher nöronal tip 5,6için belirli değerleri vardır.
Vivo, adrese karmaşık bu sorunları da basitleştirilmiş bir şekilde ele alınması tüp bebek. Bu amaçla adanmış Birim ölçümü için hızlı bir yöntem yeterli büyüme dinamikleri (Yani bir zaman ölçeğinde dakika) ve uyumlu saatler veya günler içinde gözlem ile takip etmek gereklidir. Yılda bir hücresel birim içinde vitrodoğrudan veya dolaylı erişim sağlamak için çeşitli yöntemler geliştirilmiştir. Hücre imar confocal görüntüleme üzerinden onlardan biri, ama bu yöntem yaklaşık 500 nm 7sınırlı Aksiyel çözünürlüğe gösterilen süre etiketleme ve tekrarlanan pozlama ışık anlamına gelir. Bu iki son sakıncaları kısmen kafes ışık sayfalık mikroskobu 8isimli daha sofistike ve son yöntemi tarafından üstesinden vardır unutmayın. Atomik kuvvet mikroskobu kullanılan 9 oldu ama bu tarama yöntemi tarafından yavaş ve sıkıcı özüdür. Ayrıca, fiziksel temas ile hücre gerektirir nöronlar 10aşırı yumuşaklığını dikkate alınarak ölçüm ile etkileşebilir. Empedans veya rezonans kullanarak dolaylı yöntem istihdam için 11farklı hücre türleri ama yetersiz yapışkanlı hücrelerin nöronlar gibi genişletilir.
En umut verici yöntemlerden birini hücreleri floresan bir boya ile dolu bir yakın odasında dışlanan hacmi ölçüsü temel alır. Floresans dışlama yöntemi (FXm) hiçbir etiketleme gerektirdiğinden, prensip olarak basittir ve hücre popülasyonlarının potansiyel olarak alt optik Aksiyel çözünürlüğü ile hızlı, uzun vadeli optik görüntüleme için uygundur. Gürültü çeşitli kaynaklardan bu nihai çözüm sınırlamak daha doğrusu, z çözünürlükte maksimum floresan yoğunluğu odasında kameranın dinamik alanı tarafından bölünmüş kültür (Yani bölgedeki hücreleri yoksun) bağlıdır. Bu yöntem çok güçlü geçirme yapışık hücreleri 12 hacmi takip etmek veya birim değişikliği sırasında mitoz iyice 13açıklandığı gibi memeli hücrelerinin çalışma olmuştur. Ancak, nöronlar için onların geniş yaklaşım alt micrometric süreçlerini göz önünde bulundurarak FXm metodolojik bir meydan okuma teşkil.
Burada düzgün FXm odaları imalatı için yüksek hassasiyetli birim ve nöronal dalları ve dinamik yapılar büyüme koni gibi nöronal büyüme dahil yüksekliği ile erişmek için önde gelen bir yöntem mevcut.
Chambers Aksiyel çözünürlük iyileştirmek amacıyla ölçmek için nesne daha benzer boyutlara sahip olmalıdır. Bu nedenle, biz üç farklı yükseklikte Merkezi ölçüm Odaları tarafından karakterize farklı FXm cihazlar tasarlanmıştır. En ince (3 µm) yüksekliği neurite ölçüm için adanmış: hangi çevre 15 µm yüksek orta odası içinde kalmak soma, bu düşük yükseklik dışlar. Daha kalın Merkezi chambers (10 ve 12 µm) bütün hücre büyüme takip için yeterince yüksek. Cihazın Ayrıca Merkezi odasının her iki tarafında bulunan iki rezervuarlar içerir. Dört enjeksiyon delik (ıh) böylece uygulanır ve aşağıdaki gibi belirlenir: diğer iki rezervuarlar besleme ise hücresel süspansiyonlar çipin tanıtmak için giriş ve çıkış hizmet.
İlk fabrikasyon kalibrasyon coverslips bilinen geometri fotorezist yapıları kullanarak yükseklik ölçüleri için var. Biz-sonra yansıma ücretsiz büyüyen nöronlar, ama aynı zamanda morfolojik kısıtlanmış nöronlar yapışma micropatterns.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmalab System 100</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td></td>
			<td>To perform DRIE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MJB4 mask aligner</td>
			<td>SUSS MicroTec</td>
			<td></td>
			<td>SU-8 photolithography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NXQ 4006 Mask aligner</td>
			<td>Neutronix Quintel</td>
			<td></td>
			<td>Photolithography associated to DRIE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>Diener Electronic</td>
			<td>Pico PCCE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture hood</td>
			<td>ADS Laminaire</td>
			<td>Optimale 12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Heraeus Multifuge X1R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator 37 &#176;C 5% CO2</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MCO-170AICUVH-PE IncuSafe CO2 Incubator</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescence microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMi8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS Oven between 65 and 80 &#176;C</td>
			<td>Memmert</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mechanical profilometer</td>
			<td>Veeco</td>
			<td>Dektak 6M Stylus Profiler</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical profilometer</td>
			<td>Veeco</td>
			<td>Wyko NT9100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum desiccator</td>
			<td>Verrerie Villeurbanaise (Kartel Labware)</td>
			<td>230KAR</td>
			<td>Diameter 200 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic bath sonicator</td>
			<td>Labo Moderne</td>
			<td>SHE1000</td>
			<td>Volume of the bath: 0.8 liter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hotplate</td>
			<td>Stuart SD162</td>
			<td>SD162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DRIE</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Supplementary data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Su8 Mask 1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Supplementary data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Su8 Mask 2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Supplementary data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Su8 Mask 3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Supplementary data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S1805 calibration stripes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Supplementary data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small laboratory equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mm hole puncher</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>29002519 (US reference)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel or razor blade</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9&#34; Stainless Steel Flat Spatula with Spoon</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>82027-532</td>
			<td>To demold PDMS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Top Lip Wafer Handling</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>63042-096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved tweezer</td>
			<td>FST</td>
			<td>Dumont #7 Forceps - Standard / Dumoxel</td>
			<td>To manipulate glass coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Substrates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer</td>
			<td>Prolog Semicor Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24x24 mm glass coverslips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoresists and developpers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AZ 1518 positive photoresist</td>
			<td>Microchemicals GmbH</td>
			<td></td>
			<td>Before DRIE process, thicknes 1.8 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AZ 351B developer</td>
			<td>Microchemicals GmbH</td>
			<td></td>
			<td>To develop positive AZ 1518 photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 2007</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 2025</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 2050</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PGMA developer</td>
			<td>Technic</td>
			<td></td>
			<td>To develop SU-8 negative photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microposit S1805 resist</td>
			<td>Chimie Tech Services</td>
			<td></td>
			<td>Positive photoresist used to obtain 0.5&#181;m high structures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MF 26A developer</td>
			<td>Chimie Tech Services</td>
			<td></td>
			<td>To develop positive S1805 photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory consumables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable plastic pipette 3 mL</td>
			<td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P100 Petri dishes</td>
			<td>TPP</td>
			<td>93100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL syringe</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>SS+20ES1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transparent scotch tape</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square wipes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>115-2148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>DUTSCHER</td>
			<td>90260</td>
			<td>Plastic paraffin film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(3-Methacryloxypropyl)trichlorosilane</td>
			<td>abcr</td>
			<td>AB 109004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS and curing agent Sylgard 184</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>761036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isopropanol</td>
			<td></td>
			<td>W292907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly-ornithine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4957 - 50 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>02865</td>
			<td>99.8%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-methacryloxypropyl-trimethoxysilane</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>M6514-25ML</td>
			<td>(C4H5O2)-(CH2)3- Si(OCH3)3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acetic acid</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>71251-5ML-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran 10kW conjugated with Alexa488</td>
			<td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td>
			<td>D22910</td>
			<td>Absoprtion at 488 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran 10kW conjugated with Alexa647</td>
			<td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td>
			<td>D22914</td>
			<td>Absoprtion at 647 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM</td>
			<td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td>
			<td>21090-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td>
			<td>26050088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td>
			<td>12587-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax 200 mM</td>
			<td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate GIBCO 100 mM</td>
			<td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td>
			<td>15710-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS 10x</td>
			<td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td>
			<td>14180-046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes 1M</td>
			<td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td>
			<td>15630-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trypsin-EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>59418C-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal</td>
			<td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal without phenol red</td>
			<td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td>
			<td>12348-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Softwares</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Routine in Matlab for background normalization</td>
			<td>Quantacell</td>
			<td>Contact Victor Racine: victor.racine@quantacell.com</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To select specific ROI for image analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Routine</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td>Supplementary data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Routine</td>
			<td>Matlab</td>
			<td></td>
			<td>Supplementary data</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-resolution volume imaging of neurons by the use of fluorescence exclusion method and dedicated microfluidic devices

Birim nöronların farklı zaman ölçeklerde fizyolojik ve patolojik özellikleri ile ilgili önemli bir parametredir. Nöronlar oldukça benzersiz hücre ile ilgili onların genişletilmiş ramified türleri morfoloji ve sonuç olarak ses ölçüm için birkaç metodolojik sorunlar yükseltmek. Vitro nöron büyüme özel durumda seçilen metodoloji dakika zaman ölçekten saat veya gün için tam alanlı gözlem ile birlikte alt micrometric eksenel çözünürlük içermelidir. Confocal görüntüleme, elektrikle tabanlı ölçümleri veya Atomik kuvvet mikroskobu kullanarak hücre şekli yeniden yapılanma gibi diğer yöntemlerinden farklı olarak, son zamanlarda geliştirilen Floresans dışlama yöntemi (FXm) bu zorlukları karşılamak için potansiyele sahiptir. Ancak, onun ilke olarak basit olmasına rağmen birden fazla ayarlamaları ve adanmış bir metodoloji nöronlar için yüksek çözünürlüklü bir FXm uygulanması gerektirir. Burada Floresans dışlama, düşük-pürüzlülük çok bölmeleri mikrosıvısal aygıtlar ve nihayet yerel nöronal birim vitro ölçümleri elde etmek için micropatterning kombinasyonuna göre bir yöntem mevcut. Aygıt tarafından sağlanan yüksek çözünürlüklü nöronal işlemleri (neurites) yerel birim ve belirli bazı yapılar büyüme koniler (GCs) gibi nöronal büyüme dahil hacmi ölçmek izin verdi.

1 ve 2 bölümlerinde açıklandığı imalat sürecinin sonucu şekil 1Agörüntüleri tarafından resimli-1B ve şekil 1 ceğrisi. Şekil 1 d PDMS çip, Yani orta ve 20 µm yüksek sonraki orta odası iki farklı temsilcisi alanı pürüzlülük değerlerini görüntüler. Pürüzlülük yaklaşık 7 faktör tarafından bir düşüş yerine SU-8 fotorezist kazınmış Si gofret kullanarak elde edilmiştir. O zaman, FXm ilk 10 µm yüksek odası içinde bilinen geometri (şekil 2A) fotorezist şerit üzerinde uygulandı. Görüntü işleme ve yoğunluk yükseklik dönüşüm sonra (bkz. şekil 2Bgrafik) kesit bu Şerit (şekil 2C) boyunca üzerinde gerçekleştirilen FXm profilleri sağlar istenilen yükseklik profilleri (şekil 2B). Şekil 2B mekanik profilometrisi ve FXm yöntemleri kullanılarak elde profilleri arasında karşılaştırma gösterir. Kenar ve yayla değer, dahil olmak üzere bu profiller, doğrulama yöntemi çok benzer. Not FXm veri saçılma olarak daha fazla şekil 3 ve şekil 4, değerlendirildi yönteminin son çözünürlük temsilcisi değildir ama çok zayıf bir olası etkisini önlemek için düşük yoğunluklu sonuçlarından istihdam Auto-Floresan, GFP kanaldaki fotorezist.
O zaman, biz neurites 3 µm ve 10 µm yüksek chambers (şekil 3) gözlenen. Yaklaşık 18 arka plan gürültü standart sapmasıdır nm yoğunluğu için yükseklik dönüşüm ve arka plan düzeltme sonra. Bu değer biraz yüksek--dan fiziksel PDMS yüzeylerde döküm silikon yüzey pürüzlülüğü (12 nm, şekil 1 dtablo bkz:) ama SU-8 kalıpları PDMS üzerinde ölçülen pürüzlülüğü elde daha çok daha düşük. Bu sonuçlar ayağı oyuncular için SU-8 fotorezist delik açmak yerine silikon gofret kuyu sondaj, katma değer vurgulayın. Düşük bir değer şekil 3Aiçinde görüntülenen bir birimdeki bir yüksek sinyal-gürültü oranı ve çok net görüntüler sağlar. Böyle görüntüleri alınabilmesi için veri örneği, biz 1,6 µm (Yani 10 piksel) geniş neurite hacmi hesaplanan (bkz. şekil 3Bgrafik) dilim. Bu veri doğrusal bir uyum içinde bir ilk yaklaşım kullanarak verir ortalama neurite yükseklik değeri yaklaşık 400 nm 500 nm aksonal çapı bulundu 10 gün içinde eski pups içinde corpus callosum 5 örneğin ile karşılaştırılmak üzere,. Ayrıca micropatterns oluşan seri olarak abutted 2 µm ve uzunluğu 30 µm 6 µm geniş çizgili yapıştırılması ile FXm birlikte. Amacımız neurite genişliği etkisi 3D şeklini çalışma olmuştur. Şekil 3 c 10 µm yüksek odasında elde edilen bütün nöron görüntünün yanlış renkte bir 3D temsil gösterir. Soma en büyük şerit ekstremite üzerinde bulunan, ancak Neurites 2 µm ve 6 µm geniş çizgili, yayılıyor. Yükseklik profilleri içinde üç farklı kesit çizildi. Şekil 3Aiçinde görüntülenen grafik ile tutarlılık içinde yüzey neurite genişliği (3D şekil) ile kesit artışı üzerinde entegre.
Biz de büyüme Koni (GC) 3D yapılar üzerinde duruldu. Şekil 4 A-B hangi dallı alt yapılarını vurgulamak bir 3 µm yüksek odasında, elde edilen iki farklı GC profillerini görüntüler. Buna ek olarak, GCs bir 12 µm yüksek odasında hacmi dinamikleri takip etmek zaman hata deneyler yapılır. Şekil 4 c daralma bir döngüsü ve birkaç dakika onlarca zaman ölçeğini içinde belirli bir GC reaktivasyonu görüntüler. GFP-lifeact fare kullanımı sayesinde, büyüme koniler GFP emisyon dalga boyu içinde lokalize (510 nm)--dan onların yüksek aktin konsantrasyon. Dalga boyu belirlenen yüzey dextran emisyon dalga boyu, 647 üzerinde entegre etmek için kullanılan nm GC birim hesaplamak için. Şekil 4 d sonunda yaklaşık 6 µm3değerini üzerinde ortalanmış üç farklı nöronlar GC birim farklı zaman noktaları ve konumu itibariyle dağılımı gösterir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56923/56923fig1v2.jpg"> Şekil 1: FXm PDMS chambers. (A) şemaları microfabrication son kalıp önde gelen dört farklı ana adımları. Giriş, çıkış ve su depoları konumunu belirtilir. Ölçek çubukları: 1 mm. (B) PDMS FXm odası bir optik profilometer kullanılarak elde görüntüsü. Bu görüntü 10 µm yüksek sütun ve 3 satır ve yüksekliği 20, 50 ve 90 µm ara odaları içeren orta odası gösterir. Ölçek çubuğu: 500 µm. (C) (B) çizilmiş iki kesik çizgiler boyunca çipin kesit görünümü. Sarı/altın: kesiti boyunca sütunlar, mavi: kesit sütunlar arasında. (D) PDMS pürüzlülük değerleri ölçülen üzerinde 50 × 50 µm2 alanları silikon ve 20 µm yüksek SU-8 orta odası kalıp demek (oklar bu alanların konum için bakınız). Ortalama değerleri üç farklı alanlarda ölçümleri elde edilmiştir. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/56923fig1v2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56923/56923fig2.jpg"> Şekil 2: Kalibrasyon fotorezist şerit ilgi nesnesi kullanarak FXm yönteminin. (A) bir 10 µm yüksek odasında alınan GFP-floresan görüntü 10.000 MW dextran 488 emici dolu nm'de 1 mg/mL. (B: arka plan, P: ayağı). Gözlem kuru 40 X NA 0,8 amacı ile. Ölçek çubuğu: 50 µm. (B) doğrusal kalibrasyon hukuk fotorezist geçiş A. (C) floresan yoğunluğu profil (A), görüntülenen mavi Kesikli çizgi düzeyde elde gösterilen iki renkli dikdörtgenlerin ortalama yoğunluğu elde Şerit (0,45 µm yüksek pozitif fotorezist). (D) mekanik profilometer (siyah nokta) ve FXm Yükseklik (B) (mavi noktalar) veri dönüştürme sonra yoğunluğu elde profilleri karşılaştırılması. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/56923fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56923/56923fig3.jpg"> Şekil 3: Neurite birim görüntüleme. (A) Neurite soma sonraki 15 µm ara odasında bulunan Merkez 3 µm yüksek odanın içine uzanan. 488 10.000 MW dextran emici kullanılarak gerçekleştirilen görüntüleme nm ve 40 X, NA 0,8 kuru amaç. İlave arka plan azaltma rutin olayları kullanımdan sonra iki neurites ve sağdaki grafik çizmek için seçilen elde. Ölçek çubukları: 30 µm. (B) Neurite dilim birim neurite genişliği bir fonksiyonu olarak elde edilen (A) gösterilen 22 profillerinden (ortalama 10 piksel, Yani 1.6 µm "neurite dilim" Tarih olarak). Düz çizgiyi başlangıç noktası geçen yamaç 0,4 µm lineer bir uyum gösterir. (C) bir yapıştırıcı şerit üzerinde desenli bir neuron yanlış renk imajı art arda 2 µm ve 6 µm geniş kütükleri (beyaz olarak temsil edilen) yaptı. Ölçümler 10.000 MW dextran 647 emici dolu bir 10 µm yüksek odasında yapılmıştır nm ve 40 x NA kullanarak 0,8 kuru amaç. (D) yükseklik profilleri aynı tutmak (C), gösterilen renkli kesik çizgiler için karşılık gelen renk kodu. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/56923fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56923/56923fig4.jpg"> Şekil 4: statik ve dinamik büyüme koni görüntüleme. (A-B) 3 µm yüksek odasında yükseklik dönüşüm ilişkili Albümdeki görüntülenen sarı çizgiler boyunca yoğunluk sonra elde edilen büyüme koni yükseklik profilleri de içerir. 10.000 MW dextran 488 emici ile dolgu kullanılarak gerçekleştirilen gözlem nm ve 40 X, NA 0,8 kuru amaç. (C) bütün nöron görüntüleme 12 µm yüksek odasında 10.000 MW dextran 647 emici dolu nm. Gözlem iki floresan kanallarında yapılan: GFP büyüme koni yerelleştirme (Kesikli sarı çizgiler) ve floresan dışlama birimden GC hesaplamak için CY5 için. Kesikli sarı çizgilerle dahil yüzey GC birim hesaplamak için kullanıldı. Grafik, iki temsilcisi farklı zaman noktalarda GFP ve CY5 kanaldaki GC birim varyasyon zaman ve ilişkili türleri Morfoloji üzerinde gösterir. Tüm verileri bir 40 x NA kullanarak satın alınan 0.8 kuru amaç her 3 dk. ölçek çubukları: 10 µm. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/56923fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Adım</td>
			<td>1:8 µm katman maskesi</td>
			<td>2:30 maske µm tabaka</td>
			<td>3:40 maske µm tabaka</td>
		</tr>
<tr>
<td>SU-8 tipi</td>
			<td>2007</td>
			<td>2025</td>
			<td>2050</td>
		</tr>
<tr>
<td>Spincoating</td>
			<td>30 s @ 2000 rpm</td>
			<td>30 s @ 3050 rpm</td>
			<td>30 s @ 3250 devir/dakika</td>
		</tr>
<tr>
<td>Yumuşak kek</td>
			<td>3 dakikada 95 ° C</td>
			<td>2 dakikada 65 ° C + 6 dakikada 95 ° C</td>
			<td>3 dakikada 65 ° C + 7 dakikada 95 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pozlama enerji</td>
			<td>110 mJ/cm2
</td>
			<td>155 mJ/cm2
</td>
			<td>170 mJ/cm2
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sonrası pozlama fırında</td>
			<td>@ 95 ° C 4 dk</td>
			<td>1 dakikada 65 ° C + 6 dakikada 95 ° C</td>
			<td>2 dakikada 65 ° C + 7 dakikada 95 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Geliştirme</td>
			<td>2 dk 30 sn</td>
			<td>5 dk</td>
			<td>6 dk</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sabit fırında (isteğe bağlı)</td>
			<td>3-5 dakikada 200 ° C</td>
			<td>3-5 dakikada 200 ° C</td>
			<td>3-5 dakikada 200 ° C</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1: Merkez TMMOB yüksekliği 12 mikron içeren bir aygıtı oluşturmak için gerçekleştirilen fotolitografi adımlar. Ara chambers yükseklikleri: 20, 50 ve 90 µm.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Adım</td>
			<td>Maske 1:10 µm tabaka</td>
			<td>2:30 maske µm tabaka</td>
			<td>3:40 maske µm tabaka</td>
		</tr>
<tr>
<td>SU-8 tipi</td>
			<td>2007</td>
			<td>2025</td>
			<td>2050</td>
		</tr>
<tr>
<td>Spincoating</td>
			<td>30 s @ 1500 rpm</td>
			<td>30 s @ 3050 rpm</td>
			<td>30 s @ 3250 devir/dakika</td>
		</tr>
<tr>
<td>Yumuşak kek</td>
			<td>3 dakikada 95 ° C</td>
			<td>2 dakikada 65 ° C + 6 dakikada 95 ° C</td>
			<td>3 dakikada 65 ° C + 7 dakikada 95 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pozlama enerji</td>
			<td>125 mJ/cm2
</td>
			<td>155 mJ/cm2
</td>
			<td>170 mJ/cm2
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sonrası pozlama fırında</td>
			<td>@ 95 ° C 4 dk</td>
			<td>1 dakikada 65 ° C + 6 dakikada 95 ° C</td>
			<td>2 dakikada 65 ° C + 7 dakikada 95 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Geliştirme</td>
			<td>2 dk 30 sn</td>
			<td>5 dk</td>
			<td>6 dk</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sabit fırında (isteğe bağlı)</td>
			<td>3-5 dakikada 200 ° C</td>
			<td>3-5 dakikada 200 ° C</td>
			<td>3-5 dakikada 200 ° C</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 2: yüksekliği 10 mikron merkezi bir odası içeren bir aygıtı oluşturmak için gerçekleştirilen fotolitografi adımlar. Ara chambers yükseklikleri: 20, 50 ve 90 µm.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Adım</td>
			<td>1:12 maske µm tabaka</td>
			<td>2:32 maske µm tabaka</td>
			<td>3:40 maske µm tabaka</td>
		</tr>
<tr>
<td>SU-8 tipi</td>
			<td>2015</td>
			<td>2025</td>
			<td>2050</td>
		</tr>
<tr>
<td>Spincoating</td>
			<td>30 s @ 3250 devir/dakika</td>
			<td>30 s @ 2500 rpm</td>
			<td>30 s @ 3250 devir/dakika</td>
		</tr>
<tr>
<td>Yumuşak kek</td>
			<td>3 dakikada 95 ° C</td>
			<td>2 dakikada 65 ° C + 5 dakikada 95 ° C</td>
			<td>3 dakikada 65 ° C + 7 dakikada 95 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Çekim hızı</td>
			<td>140 mJ/cm2
</td>
			<td>157 mJ/cm2
</td>
			<td>170 mJ/cm2
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sonrası pozlama fırında</td>
			<td>@ 95 ° C 4 dk</td>
			<td>1 dakikada 65 ° C + 5 dakikada 95 ° C</td>
			<td>2 dakikada 65 ° C + 7 dakikada 95 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Geliştirme</td>
			<td>3 dk.</td>
			<td>5 dk</td>
			<td>6 dk</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sabit fırında (isteğe bağlı)</td>
			<td>3-5 dakikada 200 ° C</td>
			<td>3-5 dakikada 200 ° C</td>
			<td>3-5 dakikada 200 ° C</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 3: yüksekliği 3 μm kalınlığında bir orta odası içeren bir aygıtı oluşturmak için gerçekleştirilen fotolitografi adımlar. Ara chambers yükseklikleri: 18, 50 ile 90 µm.
Ek veri 1: masks_neuron_volume_chips.tiff. Şematik PDMS aygıt (DRIE maskesi ve maskeleri 1-3) imal için kullanılan maskeler. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/masks_neuron_volume_chips.tiff">Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.</a>
Ek veri 2: dosyasını "masks_neuron_volume_chips.dxf". DRIE maskesi ve maskeleri 1-3 imal etmek izin elektronik dosyaları. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/masks_neuron_volume_chips.dxf">Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.</a>
Ek veri 3: "Mask_Photoresist-stripes.dxf". Fotorezist çizgili fotolitografi için kullanılan maskeyi imal etmek izin elektronik dosyaları. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/Mask_Photoresist-stripes.dxf">Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.</a>
Ek veri 4: conversion_mattotiff.m dosya <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/conversion_mattotiff.m">Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.</a>
Ek veri 5: importfilevol.m dosya <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/importfilevol.m">Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about High-resolution Volume Imaging of Neurons by the Use of Fluorescence eXclusion Method and Dedicated Microfluidic Devices at JoVE.com

High-resolution Volume Imaging of Neurons by the Use of Fluorescence eXclusion Method and Dedicated Microfluidic Devices

Cilt hücrelerinin fizyolojik ve patolojik özellikleri ile ilgili önemli bir parametredir. Biz tam alan ölçüm-in vitro nöron birim neurites ve dinamik yapıları nöronal artışa örtülü analizi için gerekli alt micrometric eksenel çözünürlük ile sağlayan bir floresan dışlama yöntemi açıklanmaktadır.

Yüksek çözünürlüklü ses görüntüleme, nöronlar Floresans kullanım dışlama yöntemi tarafından ve adanmış mikrosıvısal aygıtları

Volume is an important parameter regarding physiological and pathological characteristics of neurons at different time scales. Neurons are quite unique ...

The overall goal of this procedure is to allow full field measurement of in vitro neuronal volume with submicrometric axial resolution required for the analysis of neurites in dynamic structures implied in neuronal growth. This method can help answer key questions in the field of cellular neuroscience regarding the dynamics of volume changes at the subsididal scale during the nongrowth or axon degeneration. The main advantage of this technique is that it provides submicrometric axial resolution combined with full fit observation and time scale to hours or days.To begin the procedure, demold the PDMS block under a chemical hood by pouring isopropanol on it. Next, place it on the stainless steel bench of the hood. Cut around the silicone wafer and demold the PDMS replica.Then, cut around the chip and leave a two millimeter margin using a scalpel or a razor blade. Punch the inlet by pressing the 1.5 millimeter diameter puncher firmly and actuate it in order to cut and carve the hole of the inlet. Do the same at the four dedicated zones of the chip where liquid will be injected.Afterward, clean the chip by sticking and peeling the adhesive tape on the microstructured side. Sprinkle isopropanol on both sides. Then, dry the chip with pressurized nitrogen using an air blow gun.In this procedure, place each coverslip on a spin-coater located in a clean room environment. Apply a drop of the positive photoresist to cover about 75%of the coverslip and spin-coat at 4000 rpm for 30 seconds to reach a final thickness of 0.45 micrometer. Place the coverslips on a hotplate with a surface temperature of 115 degrees Celsius for one minute.Using a mask aligner, expose each coverslip at a wavelength of 435 nanometer through the dedicated mask according to the fabricant parameters. Next, prepare two glass crystallizing dishes, one containing the developer without dilution, the other containing deionized water. Dip the coverslips one by one in the developer for one minute while continuously and gently stirring the crystallizing dish.Then, submerge the wafer in deionized water for about five seconds. Transfer the wafer to an absorbent paper and dry it with pressurized nitrogen using an air blow gun. Place both the PDMS chip and the glass dish on which it will be bonded into the plasma chamber for surface activation.Next, deposit a drop of water on a rectangular thick microscope glass slide and stick the coverslip on the glass slide by capillarity. Under a microscope, mark the location of the photoresist stripes at the rear of the glass slide. Place the patterned glass coverslip on the mask holder of the mask aligner.Rely on the mark made to center the photoresist reference objects. To increase the optic contrast, place a silicon wafer beneath the PDMS chip. The silicon wafer should remain firmly attached on the chuck during the alignment process.Then, place the PDMS chip on the mobile substrate holder of the mask aligner. Subsequently, lift the chuck enough to visualize both the chip and the array of photoresist stripes located on the coverslip while staying behind the mechanical contact. Perform alignment and achieve mechanical contact between the chip and the coverslip by lifting the chuck until the surface of PDMS pillars touches the glass coverslip.After that, lower the chuck. Remove the coverslip bonded to the chip from the mask holder. Then, place the device into a 35 millimeter Petri dish and transfer everything into the oven for five to ten minutes to increase the bonding strength.Thirty minutes after bonding, place a ten microliter pipette tip filled with PLO solution at the inlet. Then, load the liquid until forming a drop on top. Repeat the same operation at the outlet and reservoirs.Subsequently, add PBS in the Petri dish all around the chip. Seal the Petri dish with a paraffin film and incubate at room temperature with a minimum of five hours. Then, press a ten microliter tip cone lightly into each injection hole and suck up the excess liquid.Next, replace PLO as well as the PBS surrounding the chip by the culture medium. Afterward, place the chip in the incubator regulated at 37 degrees Celsius and 5%carbon dioxide until neurons seed with a minimum of five hours incubation time. In this procedure, draw up the culture medium from the chip.Collect two to three microliters of the freshly resuspended cell solution and inject it at the inlet. Immediately repeat the same operation at the outlet. Inject about the same volume of culture medium in each reservoir.Quickly observe the chip under the microscope to check the density of the cells. The order of magnitude of the optimal cell density corresponds to about five to ten cells within the square surface delimited by four pillars. Repeat the procedure of injection of 0.5 to 1 microliter of cell suspension to reach the targeted cell density.For imaging, replace the culture medium with the imaging medium. Then, place the chip under an epifluorescence microscope. Acquire images of cells from single to multiple successive images in case of time-lapse experiments.Shown here are the representative observations of a calibration photoresist stripe and neurons. Higher magnification images and cross-sections of these objects are displayed on the right. The representative neurites and a three micrometer high central chamber are shown here.The volume of neurite slice can be computed as a function of neurite width. And here are the representative growth cones and a three micrometer high central chamber. Their substructures emerge clearly from an optical background noise of about 20 nanometers.Time-lapse observations of life act neurons seeded into a 12 micrometer high chamber to follow the cycle of shrinking and reactivation of the growth cone within a time scale of a few tens of minutes. While attempting this procedure, it's important to have an access to a deep ion etching equipment to fabricate the silicon mud. After watching this video, you should have a good understanding of how to align a structured glass coverslip with a PDMS chip.Once mastered, this technique can be reproducibly applied to the quantification of neurology in 3d. This technique paved the way for researchers in the field of pharmacology to explore the effect of various drugs with actual caliber all in closed cone shape. Don't forget that working with primary neurons require a lot of care to avoid contamination and shatters.Be always gentle and quick when changing media in order to limit the time they spend outside incubator.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

An Organotypic Slice Assay for High-Resolution Time-Lapse Imaging of Neuronal Migration in the Postnatal Brain

Doğum Sonrası Beyin Nöronal Göç Yüksek Çözünürlüklü Zaman Aşımı Görüntüleme için bir Organotipik Dilim Testi

Neurogenesis in the postnatal brain depends on maintenance of three biological events: proliferation of progenitor cells, migration of neuroblasts, as ...

A Rapid Approach to High-Resolution Fluorescence Imaging in Semi-Thick Brain Slices

Yarı Kalın Beyin Slices Yüksek Çözünürlük Floresans Görüntüleme Hızlı Bir Yaklaşım

A fundamental goal to both basic and clinical neuroscience is to better understand the identities, molecular makeup, and patterns of connectivity that are ...

High-resolution Functional Magnetic Resonance Imaging Methods for Human Midbrain

İnsan orta beyin için yüksek çözünürlüklü Fonksiyonel Manyetik Rezonans Görüntüleme Yöntemleri

Functional MRI (fMRI) is a widely used tool for non-invasively measuring correlates of human brain activity. However, its use has mostly been focused upon ...

High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

Gelişmekte Neuroepithelium Hücre Davranış Yüksek çözünürlüklü Canlı Görüntüleme

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central ...

Analysis of Developing Tooth Germ Innervation Using Microfluidic Co-culture Devices

Mikroakışkan Co-kültür Aygıtları Kullanma Diş Germ innervasyon Geliştirme Analizi

Innervation plays a key role in the development, homeostasis and regeneration of organs and tissues. However, the mechanisms underlying these phenomena ...

High-resolution Structural Magnetic Resonance Imaging of the Human Subcortex In Vivo and Postmortem

High-resolution Structural Magnetic Resonance Imaging of the Human Subcortex In Vivo and Postmortem

İnsan Subcortex yüksek çözünürlüklü yapısal Manyetik Rezonans Görüntüleme<I&gt; İn Vivo</I&gt; Ve Postmortem

The focus of this study was to test the resolution limits of structural MRI of a postmortem brain compared to living human brains. The resolution of ...

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Subselüler Ca Floresans ve Biyoparlaklık Görüntüleme<sup&gt; 2+</sup&gt; Yaşlı Hipokampal Nöronlar

Susceptibility to neuron cell death associated to neurodegeneration and ischemia are exceedingly increased in the aged brain but mechanisms responsible ...

High-Resolution Quantitative Immunogold Analysis of Membrane Receptors at Retinal Ribbon Synapses

Retina Şerit Sinapslar at Membran Reseptör Yüksek Çözünürlüklü Sayısal immunogold Analizi

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA ...

Imaging Neurons within Thick Brain Sections Using the Golgi-Cox Method

Golgi-Cox Yöntemiyle Kalın Beyin Bölümler içinde Görüntüleme Nöronlar

The Golgi-Cox method of neuron staining has been employed for more than two hundred years to advance our understanding of neuron morphology within ...

High-resolution Confocal Imaging of the Blood-brain Barrier: Imaging, 3D Reconstruction, and Quantification of Transcytosis

Kan - beyin bariyerini yüksek çözünürlüklü Confocal görüntüleme: görüntüleme, 3D yeniden yapılanma ve Transcytosis miktar

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic multicellular interface that regulates the transport of molecules between the circulation and the brain. ...