Reconstitution est le processus de restauration d’une biomolécule isolé à sa forme originale ou sa fonctionnalité. Cette approche est souvent utilisée lors de l’étude des protéines membranaires qui permettent de nombreux processus cellulaires importants et affectent le comportement des lipides voisines. Cependant, la complexité de l’environnement de la cellule est difficile membrane fonctions protéiques d’étudier in situ. Les protéines peuvent être extraites et purifiées, mais leurs fonctions réelles ne peuvent être évaluées sans une membrane. Les protéines membranaires isolées sont donc reconstitué par l’intégration dans une membrane lipidique artificielle, par exemple un liposome. Cette vidéo va présenter les principes de reconstitution des protéines membranaires, une procédure de reconstitution générale et quelques applications en biochimie.

Membranes cellulaires se composent principalement de phospholipides et de protéines membranaires. Les phospholipides forment une bicouche dont les têtes de phosphate hydrophile interagissent avec l’aqueux intérieur et l’extérieur de la cellule, alors que les queues hydrophobes des acides gras interagissent entre eux dans la bicouche.

Certaines protéines de la membrane n’interagissent avec la membrane par des interactions électrostatiques ou non covalentes. D’autres, appelés « protéines intégrale », sont insérées dans la bicouche lipidique.

Comme la bicouche, protéines de l’integral ont les extrémités hydrophiles et hydrophobe Centre et sont maintenus en place par des interactions hydrophobes. Protéines intégrale qui s’étendent sur l’ensemble membrane sont connus comme « protéines transmembranaires ».

Les interactions entre ces protéines et la membrane sont si fortes que même lyser les cellules ne se séparera pas eux. Un agent tensio-actif spécial appelé un détergent est utilisé pour extraire les protéines. Similaires aux phospholipides, détergents ont la tête hydrophile et lipophile queues et peuvent entrer librement dans la membrane.

À l’intérieur de la membrane, les queues lipophiles du détergent interagissent avec le noyau de protéines hydrophobes. Il entoure la protéine avec une coquille des chefs détergents hydrophiles, qui perturbe les interactions protéines-lipides.

Le complexe protéine-détergent est maintenant facilement séparé de la membrane. Le détergent rend le complexe soluble dans des solutions aqueuses et prêts pour la reconstitution dans une membrane artificielle.

Les protéines sont souvent reconstitués dans les membranes des liposomes, qui sont des vésicules artificielles. Pour préparer les liposomes, lipides séchées sont hydratés et agités pour induire la formation de vésicules. Lorsqu’un détergent est ajouté, il est incorporé dans les membranes de liposome.

Pour reconstituer les protéines, les protéines solubilisées et les liposomes sont combinés, et puis le détergent est supprimé de la solution de dialyse ou adsorption chimique. Les protéines et les liposomes assemblent rapidement dans des protéoliposomes, alors que les groupes hydrophiles sont exposés. Les protéines fonctionnent alors puisqu’ils dans une membrane cellulaire et peuvent être étudiées isolément.

Maintenant que nous avons couvert les rudiments de la reconstitution de la protéine, Let ' s go via un protocole pour la reconstitution des protéines de la membrane dans les liposomes.

Pour commencer à isoler les protéines de la membrane, les cellules sont lysées. Ininterrompue de cellules est éliminée par centrifugation.

Le surnageant est centrifugé à une vitesse supérieure pour granuler les membranes. Le culot est remises en suspension et ajouter un détergent pour extraire les protéines.

Les débris restants de la cellule sont enlevée par centrifugation supplémentaire. La protéine est purifiée à partir du surnageant par chromatographie sur colonne et ensuite concentrée ou purifiée davantage selon les besoins.

Pour commencer à préparer les liposomes, une suspension des phospholipides dans un solvant organique est séchée sous azote ou argon.

Les phospholipides sont hydratés avec tampon d’hydratation, et le mélange est sonication pour achever la création les liposomes.

Un détergent est ajouté à solubiliser les liposomes, qui se combine alors avec les protéines.

Le détergent est ensuite retiré par adsorption sur des billes de polystyrène, dialyse ou une colonne de liaison de détergent. Les protéoliposomes qui en résultent sont prêts à être purifié et utilisé dans des expériences ultérieures.

Maintenant que vous êtes familier avec les bases d’une procédure de reconstitution de protéines membranaires, regardons quelques applications de reconstitution de la protéine en biochimie.

Une protéine de membrane-transport a été reconstituée pour acquérir une compréhension plus claire de son mécanisme de transport. Sa reconstitution après fonction a été vérifiée avec un efflux des ions iodure. Ensuite, l’activité de transport a été étudiée en présence de divers inhibiteurs du canal ionique petite molécule et potentialisateurs. De cette façon, les contacts directs de ces petites molécules avec la protéine de transport pourraient être étudiées.

Chlorophylle et protéines membranaires caroténoïde chez les plantes récoltent lumière, promouvoir la séparation des charges et atténuer les dégâts légers. En reconstituant ces protéines de récolte de la lumière, leur dynamique et l’interaction avec pigments pliantes peuvent être étudiés. Les protéines de lumière reconstitués avec cette technique avaient des propriétés optiques très similaires aux protéines natives. Spectroscopie d’émission de fluorescence permet ensuite d’étudier le transfert d’énergie des pigments aux protéines lumière reconstitués.

Vous avez juste regardé les vidéo de JoVE sur la reconstitution des protéines membranaires. Reconstitution est un moyen de transférer des protéines importantes à un imitateur de cellule pour complément d’enquête. Cette vidéo a couvert les principes de reconstitution de la protéine, un protocole de reconstitution et quelques applications en biochimie. Merci de regarder !