La ricostituzione è il processo di ripristino di una biomolecola isolata alla sua forma o funzionalità originale. Questo approccio viene spesso utilizzato quando si studiano le proteine di membrana, che consentono molti importanti processi cellulari e influenzano il comportamento dei lipidi vicini. Tuttavia, la complessità dell'ambiente cellulare rende le funzioni proteiche di membrana difficili da studiare in situ. Le proteine possono essere estratte e purificate, ma le loro effettive funzioni non possono essere valutate senza una membrana. Pertanto, le proteine di membrana isolate vengono ricostituite mediante integrazione in una membrana lipidica artificiale, come un liposoma. Questo video introdurrà i principi della ricostituzione delle proteine di membrana, una procedura di ricostituzione generale e alcune applicazioni in biochimica.

Le membrane cellulari sono costituite principalmente da fosfolipidi e proteine di membrana. I fosfolipidi formano un doppio strato in cui le teste di fosfato idrofilo interagiscono con l'interno e l'esterno acquoso della cellula, mentre le code di acidi grassi idrofobi interagiscono tra loro nel doppio strato.

Alcune proteine di membrana interagiscono con la membrana solo per interazioni elettrostatiche o non covalenti. Altre, chiamate "proteine integrali", sono incorporate nel doppio strato lipidico.

Come il doppio strato, le proteine integrali hanno estremità idrofile e un centro idrofobo e sono mantenute in posizione da interazioni idrofobiche. Le proteine integrali che coprono l'intera membrana sono conosciute come "proteine transmembrana".

Le interazioni tra queste proteine e la membrana sono così forti che anche la lisi delle cellule non le separerà. Un tensioattivo speciale chiamato detergente viene utilizzato per estrarre le proteine. Simili ai fosfolipidi, i detergenti hanno teste idrofile e code lipofile e possono entrare liberamente nella membrana.

All'interno della membrana, le code lipofile del detergente interagiscono con il nucleo proteico idrofobo. Questo circonda la proteina con un guscio delle teste detergenti idrofile, che interrompe le interazioni proteina-lipidi.

Il complesso proteina-detergente è ora facilmente separato dalla membrana. Il detergente rende il complesso solubile in soluzioni acquose e pronto per la ricostituzione in una membrana artificiale.

Le proteine sono spesso ricostituite nelle membrane dei liposomi, che sono vescicole artificiali. Per preparare i liposomi, i lipidi secchi vengono idratati e agitati per indurre la formazione di vescicole. Quando viene aggiunto un detergente, viene incorporato nelle membrane liposomiche.

Per ricostituire la proteina, le proteine solubilizzate e i liposomi vengono combinati, quindi il detergente viene rimosso dalla soluzione mediante dialisi o adsorbimento chimico. Le proteine e i liposomi si assemblano rapidamente in proteolipolismi, quindi solo i gruppi idrofili sono esposti. Le proteine quindi funzionano come farebbero in una membrana cellulare e possono essere studiate in isolamento.

Ora che abbiamo trattato le basi della ricostituzione proteica, esaminiamo un protocollo per ricostituire le proteine di membrana nei liposomi.

Per iniziare a isolare le proteine di membrana, le cellule vengono lysed. Le cellule ininterrotte vengono rimosse con la centrifugazione.

Il surnatante viene centrifugato ad una velocità maggiore per pellettizzare le membrane. Il pellet viene ri-sospeso e viene aggiunto un detergente per estrarre le proteine.

I detriti cellulari rimanenti vengono rimossi mediante centrifugazione aggiuntiva. La proteina viene purificata dal surnatante con cromatografia su colonna e quindi concentrata o purificata ulteriormente secondo necessità.

Per iniziare a preparare i liposomi, una sospensione di fosfolipidi in solvente organico viene essiccata sotto azoto o argon.

I fosfolipidi sono idratati con tampone idratante e la miscela viene sonicata per finire di creare i liposomi.

Il detergente viene aggiunto per solubilizzare i liposomi, che viene poi combinato con le proteine.

Il detergente viene quindi rimosso mediante adsorbimento su perline di polistirolo, dialisi o una colonna legante il detergente. I proteolipolisi risultanti sono pronti per essere purificati e utilizzati in esperimenti successivi.

Ora che hai familiarità con le basi di una procedura di ricostituzione proteica di membrana, diamo un'occhiata ad alcune applicazioni della ricostituzione proteica in biochimica.

Una proteina di trasporto di membrana è stata ricostituita per ottenere una comprensione più chiara del suo meccanismo di trasporto. La sua funzione post-ricostituzione è stata verificata con un efflusso di ioni ioduro. Successivamente, l'attività di trasporto è stata studiata in presenza di vari inibitori e potenziatori del canale ionico di piccole molecole. In questo modo, si potrebbero studiare le interazioni dirette di queste piccole molecole con la proteina di trasporto.

Le proteine di membrana che legano la clorofilla e i carotenoidi nelle piante raccolgono la luce, promuovono la separazione della carica e mitigano i danni alla luce. Ricostituendo queste proteine che raccolgono la luce, è possibile studiare la loro dinamica di ripiegamento e l'interazione con i pigmenti. Le proteine di raccolta della luce ricostituite con questa tecnica avevano proprietà ottiche molto simili alle proteine native. La spettroscopia di emissione di fluorescenza può quindi essere utilizzata per studiare il trasferimento di energia dai pigmenti alle proteine ricostituite per la raccolta della luce.

Hai appena visto il video di JoVE sulla ricostituzione delle proteine di membrana. La ricostituzione è un modo per trasferire proteine importanti a una cellula mimica per ulteriori indagini. Questo video ha coperto i principi della ricostituzione proteica, un protocollo di ricostituzione e alcune applicazioni in biochimica. Grazie per l'attenzione!