Name: imaging approaches to assessments of toxicological oxidative stress using genetically-encoded fluorogenic sensors
Uploaded: 2018-02-07T14:00:00
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Los autores desean agradecer a Katelyn Lavrich por asistencia con diseño experimental y edición del manuscrito.

1. preparación de las células
Nota: Este procedimiento describe la transducción lentivirales de una línea celular inmortalizada (BEAS-2B; ATCC, Manassas, VA) para expresar el reportero deseado (roGFP2 o HyPer). Pueden utilizarse otras líneas/tipos de células o métodos de transferencia de genes, incluyendo transfección, como resultado un nivel de expresión del periodista adecuada para visualizar un número suficiente de células expresando su sensor por campo de visión (típicamente 5-1...

El uso de roGFP2 y HyPer en la detección de cambios en el intracelular EGSH y H2O2, respectivamente, ha sido bien descrito en anteriores estudios fisiológicos y toxicológicas 25,35,36 ,39,40,41,42,43. El protocolo descri...

Sin embargo, el término "estrés oxidativo" es citado con frecuencia como un mecanismo en toxicología, rara vez es este término se describe específicamente. El estrés oxidativo puede referirse a varios procesos intracelulares, incluyendo generación de especies reactivas del oxígeno, daño causado por los radicales libres, la oxidación de moléculas antioxidantes, y las cascadas de incluso la activación de la señalización específica. Una amplia gama de contaminantes ambientales1,2 y3,de agentes farmacéuticos4 se han documentado para inducir estrés oxidativo por cualquier acción directa del compuesto xenobiótico sí mismo5 ,6 o secundariamente por la producción de especies oxidantes como parte de una respuesta celular7,8,9,10. Por lo tanto es de gran interés en toxicología precisa observar y caracterizar los procesos oxidativos que conducen a resultados adversos. Los métodos convencionales de medición de estrés oxidativo incluyen identificación de biomoléculas oxidado11,12,13,14,15 o antioxidantes16 ,17,18,19,20, o la medición directa de las especies reactivas se21,22,23, 24. Sin embargo, estos métodos requieren típicamente trastornos celulares, que a menudo consume la muestra, elimina la resolución espacial y potencialmente introduce artefactos25. El desarrollo de métodos más sensibles y específicos para la detección de especies antioxidantes y marcadores de estrés oxidativo es ampliamente aplicable a la investigación de los efectos adversos de la exposición xenobiótico.
Microscopía de células vivas usando una nueva generación de sensores codificados genéticamente fluorógenos ha surgido como una poderosa herramienta para monitorear el estado redox intracelular de las células vivas. Estos sensores se expresan normalmente usando un vector bajo el control de un promotor viral que se introduce a través de metodologías de la transfección o transducción. Eficiencia alta expresión no es necesaria, ya que las células que expresan el sensor fluorescente pueden ser fácilmente identificadas visualmente. Para la evaluación toxicológica, se observan las células que expresan estos sensores utilizando microscopía de fluorescencia están expuestos a los compuestos xenobióticos en tiempo real. Este diseño experimental permite mediciones repetidas en la misma célula, permitiendo que la base establecida de cada célula actuar como su propio control. La alta resolución temporal que brinda imágenes de células vivas es muy adecuada para la detección de eventos oxidativos, especialmente los que son modestos en magnitud o transitorio en naturaleza. Además de ser sensible y específico para sus moléculas blanco, la fluorescencia de algunos de estos sensores puede ser excitada con dos longitudes de onda de la luz. Este fenómeno permite la emisión fluorescente a expresarse como un cociente, que permite el discernimiento de los cambios de señal asociados con respuestas de auténtico sensor de ésos causados por artefactos tales como variaciones en la expresión de sensor, espesor de célula, lámpara intensidad, fotoblanqueo y la sensibilidad de la fluorescencia detector26. Otra ventaja del uso de sensores fluorógenos es que puede orientarse a compartimentos celulares específicos, creando un nivel de resolución espacial que es incomparable por métodos convencionales25,26,27.
Una gran familia de sensores codificados genéticamente basados en proteína fluorescente verde (GFP) se han desarrollado y caracterizado al informe sobre una amplia variedad de marcadores fisiológicos, incluyendo el pH, temperatura, concentraciones de calcio y la relación ATP/ADP25 ,28,29,30,31. Entre ellas, son sensores del potencial redox de glutatión (GSHde E) y peróxido de hidrógeno (H2O2). Mientras que estos sensores fueron desarrollados para aplicaciones en fisiología y biología redox, también han sido adaptados para el estudio de estrés oxidativo inducido por xenobióticos. Específicamente, el protocolo descrito aquí describe el uso de la roGFP2 de sensor EGSH y el H2O2 sensor HyPer.
roGFP2 informa sobre el potencial redox intracelular glutation reducido y oxidado (GSH/GSSG) a través de un relé de redox que implican reductasas (Grx) y glutatión peroxidasa (GPx) y glutatión reductasa (GR) (figura 1)25, 32 , 33. glutatión es la molécula predominante antioxidante celular y está presente principalmente en su forma reducida (GSH) en concentración milimolar en el citosol25,34. Mientras EGSH se ha ligado no a un resultado funcional, se reconoce como un importante indicador del estado oxidativo intracelular34. Un aumento relativamente pequeño en la concentración de GSSG se traduce en un aumento en EGSH que es detectable por roGFP2. Igualmente importante, seguimiento de EGSH usando roGFP2 durante exposiciones xenobióticos puede potencialmente revelar mucho sobre el mecanismo de acción en varios puntos en el relé de redox y desviación de caminos asociados, tales como el fosfato de pentosa (figura 1 )35. El segundo sensor aquí, HyPer, es un intracelular H2O2 punta de prueba derivada de la inserción de proteína fluorescente amarilla (YFP) en el dominio regulador de bacteriana H2O2-transcripción sensible factor de OxyR136. Aunque se ha previamente considerado un dañino oxígeno reactivo intermedio, H2O2 se está reconociendo cada vez más como una importante molécula de señalización intracelular bajo condiciones fisiológicas37, 38, lo que sugiere que existen funciones no reconocidas para H2O2 en toxicología, así. Por ejemplo, exceso H2O2 inducida por una exposición xenobiótico podría ser un precursor de la desregulación en la señalización celular o un cambio en la bioenergética.
Ambos sensores fluorógenos genéticamente codificados se han expresado en varias líneas celulares establecidas, incluyendo la línea celular de carcinoma epidérmico humano A431 y la línea de células epiteliales bronquiales humanas BEAS-2B, para observar los cambios en EGSH y H2 O2 en respuesta a una variedad de riesgos toxicológicos. Estos incluyen gases contaminantes (ozono35), componentes solubles de partículas (1,2 naftoquinona39,40 y zinc41) y nanopartículas de níquel (datos no publicados). Estos estudios representan sólo un pequeño subconjunto de las posibles aplicaciones de estos dos sensores. Teóricamente, cualquier tipo de célula que es capaz de recibir y expresar el ADN de estos sensores a través de técnicas de biología molecular convencionales puede ser utilizado para evaluar los efectos de los xenobióticos sospechadas de alterar el estado oxidativo celular. Hasta la fecha, uno o más de estos sensores se ha expresado en diversos procariotas y eucariotas, incluyendo varios mamíferos, planta, bacterias y levadura celular tipos25,26,36,42. La lectura EGSH y H2O2 sensores es un cambio en la intensidad de fluorescencia emitida a 510 nm en la excitación con luz nm 488 y 404. Este método es ampliamente adaptable plataformas fluorométrico, incluyendo varios tipos de microscopía (confocal y campo amplio) y los lectores de la placa. El método aquí presentado permite observación sensible y específica de intracelular deGSH de E y H2O2 sistemas toxicológicos in vitro .

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:748px;" width="747">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:216px;">roGFP2 Plasmid</td>
			<td style="width:123px;">University of Oregon</td>
			<td style="width:243px;">N/A</td>
			<td style="width:167px;">Generous gift of S.J. Remington</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">HyPer Plasmid</td>
			<td style="width:123px;">Evrogen</td>
			<td>FP941</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Hydrogen Peroxide</td>
			<td style="width:123px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:243px;">H1009</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Dithiothreitol</td>
			<td style="width:123px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:243px;">10708984001</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">9,10-Phenanthrenequinone</td>
			<td style="width:123px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:243px;">156507</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Black Wall Glass Bottomed Dishes</td>
			<td style="width:123px;">Ted Pella</td>
			<td>14029-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">BEAS-2B cell line</td>
			<td style="width:123px;">American Type Culture Collection</td>
			<td style="width:243px;">CRL-9609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Keratinocyte Basal Medium</td>
			<td style="width:123px;">Lonza</td>
			<td style="width:243px;">192151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Keratinocyte Growth Medium BulletKit</td>
			<td style="width:123px;">Lonza</td>
			<td style="width:243px;">192060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Excel&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Microsoft Office Suite</td>
			<td style="width:243px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">NIS-Elements AR Imaging Software</td>
			<td style="width:123px;">Nikon</td>
			<td style="width:243px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Nikon C1si Confocal Imaging System</td>
			<td style="width:123px;">Nikon</td>
			<td style="width:243px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging approaches to assessments of toxicological oxidative stress using genetically-encoded fluorogenic sensors

Mientras que el estrés oxidativo es un mecanismo toxicológico comúnmente citado, los métodos convencionales de estudio sufren una serie de deficiencias, incluyendo la destrucción de la muestra, introducción de posibles artefactos y la falta de especificidad para el reactivo especies implicadas. Por lo tanto, es una necesidad actual en el campo de la toxicología de métodos no destructivos, sensibles y específicos que puede ser utilizado para observar y cuantificar las perturbaciones redox intracelular, más comúnmente contempladas como estrés oxidativo. Aquí, presentamos un método para el uso de dos sensores fluorógenos codificado genéticamente, roGFP2 y HyPer, para ser utilizado en estudios de imágenes de células vivas para observar respuesta oxidativa inducida por xenobióticos. roGFP2 se equilibra con el potencial redox glutatión (GSHde E), mientras que el HyPer detecta directamente el peróxido de hidrógeno (H2O2). Ambos sensores pueden ser expresadas en varios tipos de células mediante transfección o transducción y pueden ser dirigidas a compartimentos celulares específicos. Lo más importante, microscopía de células vivas usando estos sensores ofrece alta resolución espacial y temporal que no es posible usando métodos convencionales. Cambios en la intensidad de fluorescencia controlados a 510 nm sirve como lectura para ambos sensores codificados genéticamente fluorógenos cuando excitados secuencialmente por 404 nm y 488 nm luz. Esta propiedad hace que ambos radiométrica de los sensores, eliminando artefactos comunes de microscopia y corregir las diferencias en la expresión del sensor entre las células. Esta metodología se puede aplicar en una variedad de plataformas fluorométrica capaces de emocionantes y que recoge las emisiones en las longitudes de onda prescritas, lo que es conveniente para el uso con sistemas de proyección de imagen confocales y microscopía de amplio campo convencional placa lectores. Ambos sensores fluorógenos genéticamente codificados se han utilizado en una variedad de tipos de células y estudios toxicológicos para monitorear celulares EGSH y H2O2 generación en tiempo real. Se describe aquí es un método estandarizado que es ampliamente adaptable fluorométrica plataformas para la aplicación de roGFP2 y HyPer en la evaluación toxicológica de células vivas de estrés oxidativo y tipos de la célula.

El uso de roGFP2 y HyPer en la detección de cambios en EGSH e intracelular H2O2 ha sido bien descrito previamente25,36,42,43 y se demuestra aquí. Imágenes confocales de células que expresan roGFP2 en la línea de base y la siguiente adición de H2O2 y TDT se muestran en la figura 2</...

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Imaging Approaches to Assessments of Toxicological Oxidative Stress Using Genetically-encoded Fluorogenic Sensors

Este manuscrito describe el uso de reporteros fluorógenos genéticamente codificados en una aplicación de imágenes de células vivas para el examen de estrés oxidativo inducido por xenobióticos. Este enfoque experimental ofrece inigualable resolución espaciotemporal, la sensibilidad y especificidad evitando muchas de las deficiencias de los métodos convencionales usados para la detección de estrés oxidativo toxicológica.

Enfoques de evaluación de estrés oxidativo toxicológico mediante sensores codificados genéticamente fluorógenos la proyección de imagen

While oxidative stress is a commonly cited toxicological mechanism, conventional methods to study it suffer from a number of shortcomings, including ...

The overall goal of this methodology is to establish the use of genetically-encoded redox sensors for the specific assessment of toxicant-induced perturbations in redox homeostasis. By overcoming the significant limitations of conventional approaches used with oxidative stress, this method will help answer key questions pertaining to toxicological oxidative stress. The main advantage of this technique is that it combines a high degree of specificity and sensitivity with unparalleled spacio-temporal resolution to investigate toxicological oxidative stress in living cells.Perform all imaging analysis using a confocal microscope equipped with laser lines at 404 and 488 nanometers, and environmental controls to maintain an appropriate temperature, humidity, and/or gas concentration suitable for the cells throughout the duration of the experiment. If using high values of relative humidity, use an objective heater and/or heating tape to keep any surfaces that may come in contact with the humidified atmosphere at or slightly above the temperature at which the humidity is generated to prevent condensation. Turn on all microscope components, and set up all equipment required for sequential excitation at 488 and 404 nanometers with emission at 510 nanometers.Ensure all components of the optical configuration are set appropriately for real-time acquisition. Set up a stage-top environmental chamber to maintain constant temperature at 37 degrees celsius, 5%CO2 atmosphere, and greater than 95%humidity. Prior to starting image acquisition, equilibrate the environmental chamber for at least 10 minutes after the initial set-up of all environmental controls.Place the dish of cells on the stage top within the environmental chamber. With the desired objective lens, find the focal plane of cells using the eyepiece and white light and ensure normal morphology. A 1.4 numerical aperture 60 X violet corrected oil-immersed objective lens is commonly used, which permits identification of intracellular compartments while maximizing the optical resolution of the confocal system.Check the fluorescence expression of the cells in the field of view while visualizing the cells under wide-field fluorescence illumination with an appropriate filter set such as flourescian-isothioanate or FITC. At this point, using wide-field illumination while looking through the eyepiece is more convenient because it is easier to move the dish to select a field of cells to study. Once a desired field of view is found, close the environmental chamber.Use the focus maintaining feature to facilitate maintenance of a stable focal plane throughout the study. Next, set up acquisition parameters to ensure optimal assessment of the sensor of interest across the desired exposure period. To do so, adjust the laser power for excitation at 488 nanometers and emission at 510 nanometers.Choose a laser power level that allows visualization of the cells and keep this constant between samples or replicate dishes. Use the confocal controls of the acquisition software to ensure that the selected focal plane has been optimized for maximal florescence emission intensity in the center of the cells by scanning at 488 nanometers while adjusting the Z-plane. Use a high gain setting while adjusting for the Z-plane with the most over-exposed cells.Once the appropriate focal plane has been found, return the gain to a setting that is most optimal for the fluorescence of the reporter being used without over-saturating the pixels being observed. Then, use the gain to fine-tune the baseline fluorescence. With roGFP2, establish the baseline near the upper limit of the instrument without over-saturation, as these cells will lose 510 nanometer fluorescence induced by 488 nanometer excitation when the glutathione redox potential increases.Repeat these steps with excitation at 404 nanometers and emission at 510 nanometers. Gain settings for the 404 nanometer excitation wavelength are opposite to those used with 488 nanometer excitation for each sensor. In general, fluorescence of the 404 nanometer excitation will be considerably lower than that obtainable with the 488 nanometer excitation in cells expressing roGFP2, as a 404 nanometer peek is a relatively minor excitation maximum for this sensor.Set up the acquisition software to sequentially excite the two excitation wavelengths and collect emissions for both at 510 nanometers and at a predetermined time interval throughout the desired length of the experiment. For real-time assessment of experimental parameters, choose at least five to 10 sensor-expressing cells in the field, and establish them as regions of interest to monitor their fluorescence changes during the experiment. Next, dissolve the environmental toxicant, 9, 10-PQ in dimethyl sulfoxide to a concentration of 15 millimolar.Dilute the dissolved toxicant in basal-cell media to a 250 micromolar working solution for a final concentration of 25 micromolar. Additionally, prepare a working solution of hydrogen peroxide for later use in this protocol. Once the experimental parameters have been defined, begin the time course acquisition.Establish a baseline period of at least five minutes prior to starting xenobiotic exposures. Expose the cells to the toxicant being investigated using conventional approaches for in-vitro dosing. Monitor changes in fluorescence during the exposure period.Perform subsequent injections as needed. Take great care not to shift the dish during injections so that the same cells are followed throughout the entire time course while imaged in the same focal plane. At the end of the experiment, expose the cells to the appropriate controls to fully oxidize and reduce roGFP2.The addition of control simuli validates sensor responsiveness at the end of the exposure and confirms that the responses observed are not the direct result of damage to the forport. So, it is especially important in the initial evaluation of a toxin. For these studies, use one millimolar hydrogen peroxide to determine the maximum sensor response.Wait at least five minutes to allow the sensor to respond and then inject a reducing agent such as DTT to reduce the sensor and return it to a level of fluorescence at or near its established baseline. Finally, perform data analysis as described in the text protocol. Shown here are representative results illustrating an established dose response generated using the bronchial epithelial cell line Bees 2B expressing roGFP2.Cursor shown to exposure five micromolar, 25 micromolar, or 100 micromolar doses of hydrogen peroxide. Exposure of bees 2B cells to a previously untested environmental toxicant, 9, 10-PQ induces a gradual but potent increase in the intracellular glutathione redox potential as assessed by roGFP2. Here, each line depicts the raw roGFP2 ratio of individual cells in the dish.Although the test compound produces a maximal response comparable to one millimolar hydrogen peroxide, this known redox cycler caused a change in the sensor that was fully reduced with the addition of five millimolar DTT, suggesting that the sensor remains functional following exposure to this redox-active organic compound. This approach will aid toxicologists in investigating key mechanistic events in toxican-induced oxidative stress, paving the way for more focus studies in the emergent field of redox toxicology across a broad spectrum of toxicants and cell types. After watching this video, you should have a good understanding of how to use genetically encoded sensors and live-cell microscopy to monitor pivotal markers of toxicological oxidative stress with high sensitivity and specificity at unmatched spacio-temporal resolution.

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