Name: isolation and characterization of neutrophil-derived microparticles for functional studies
Uploaded: 2018-03-02T15:00:00
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北西ファインバーグ学校の医学フローサイトメトリーのコアを実行する博士 Suchitra スワミナサンのテクニカル サポートに感謝しております。(NIH) DK101675 によって提供された資金。

すべての動物の仕事は、北西 IACUC によって承認されました。すべての実験は、調和とすべての関連する規制・制度のガイドラインの遵守に完了しました。献血者の人権のインフォームド コンセントを提示され、署名されて。さらに、本研究ではすべての被験者は、福祉の機関および連邦政府のガイドラインに従って扱われました。
注: プロトコルの手順は以下のサブセ?...

<ol>
	<li>Hickey, M. J., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravascular+immunity:+the+host-pathogen+encounter+in+blood+vessels.">Intravascular immunity: the host-pathogen encounter in blood vessels.</a> Nat Rev Immunol. 9 (5), 364-375 (2009).</li><li>Nathan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+and+immunity:+challenges+and+opportunities.">Neutrophils and immunity: challenges and opportunities.</a> Nat Rev Immunol. 6 (3), 173-182 (2006).</li><li>Kolaczkowska, E., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+recruitment+and+function+in+health+and+inflammation.">Neutrophil recruitment and function in health and inflammation.</a> Nat Rev Immunol. 13 (3), 159-175 (2013).</li><li>Butin-Israeli, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deposition+of+microparticles+by+neutrophils+onto+inflamed+epithelium:+a+new+mechanism+to+disrupt+epithelial+intercellular+adhesions+and+promote+transepithelial+migration.">Deposition of microparticles by neutrophils onto inflamed epithelium: a new mechanism to disrupt epithelial intercellular adhesions and promote transepithelial migration.</a> FASEB J. , (2016).</li><li>Gasser, O., Schifferli, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activated+polymorphonuclear+neutrophils+disseminate+anti-inflammatory+microparticles+by+ectocytosis.">Activated polymorphonuclear neutrophils disseminate anti-inflammatory microparticles by ectocytosis.</a> Blood. 104 (8), 2543-2548 (2004).</li><li>Swamydas, M., Lionakis, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+purification+and+labeling+of+mouse+bone+marrow+neutrophils+for+functional+studies+and+adoptive+transfer+experiments.">Isolation, purification and labeling of mouse bone marrow neutrophils for functional studies and adoptive transfer experiments.</a> J Vis Exp. (77), e50586 (2013).</li><li>Shet, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+blood+microparticles:+technical+aspects+and+challenges.">Characterizing blood microparticles: technical aspects and challenges.</a> Vasc Health Risk Manag. 4 (4), 769-774 (2008).</li><li>Dey-Hazra, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+circulating+microparticles+by+flow+cytometry:+influence+of+centrifugation,+filtration+of+buffer,+and+freezing.">Detection of circulating microparticles by flow cytometry: influence of centrifugation, filtration of buffer, and freezing.</a> Vasc Health Risk Manag. 6, 1125-1133 (2010).</li><li>Slater, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+Microparticles+Deliver+Active+Myeloperoxidase+to+Injured+Mucosa+To+Inhibit+Epithelial+Wound+Healing.">Neutrophil Microparticles Deliver Active Myeloperoxidase to Injured Mucosa To Inhibit Epithelial Wound Healing.</a> J Immunol. 198 (7), 2886-2897 (2017).</li><li>Enjeti, A. K., Lincz, L., Seldon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bio-maleimide+as+a+generic+stain+for+detection+and+quantitation+of+microparticles.">Bio-maleimide as a generic stain for detection and quantitation of microparticles.</a> Int J Lab Hematol. 30 (3), 196-199 (2008).</li><li>Headland, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil-derived+microvesicles+enter+cartilage+and+protect+the+joint+in+inflammatory+arthritis.">Neutrophil-derived microvesicles enter cartilage and protect the joint in inflammatory arthritis.</a> Sci Transl Med. 7 (315), (2015).</li><li>Andersson, T., Dahlgren, C., Lew, P. D., Stendahl, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+surface+expression+of+fMet-Leu-Phe+receptors+on+human+neutrophils.+Correlation+to+changes+in+the+cytosolic+free+Ca2++level+and+action+of+phorbol+myristate+acetate.">Cell surface expression of fMet-Leu-Phe receptors on human neutrophils. Correlation to changes in the cytosolic free Ca2+ level and action of phorbol myristate acetate.</a> J Clin Invest. 79 (4), 1226-1233 (1987).</li></ol>

分離・同定多形核白血球由来の MPs のためのプロトコルは、この通信で説明されます。キーのいくつかの重要なポイントは、プロシージャの成功のためのアカウントに撮影する必要があります。まず、Pmn を新鮮な分離し、自発的な活性化と脱顆粒を防ぐために分離の 2 時間以内の実験で使用する必要があります。Pmn 分離時、刺激のポイントまでのすべての処理は、活性化と早期 MP リリース<s...

最近では、「微粒子/ミクロベシクル「細胞細胞質または細胞膜由来が新興が示唆された、直径 50 1,000 nm に至るこれら構造が生物学的情報を運ぶことができる偉大な科学的な興味のなると携帯電話通信の非標準のメソッドとして機能します。免疫細胞の MPs と Pmn のホストの防衛の1、2、炎症性応答3、および創傷治癒に重要な役割を与えられたの関心は、好中球 (Pmn) 作り出される特にそれら4. 興味を持って、これまで多数のレポートを示しているプロ炎症性と抗炎症機能 PMN MPs の5潜在的なコンテキスト-病気-種-、MPs の臓器固有の役割を示唆しています。
この通信で説明されているプロトコルは、健康と病気における MPs の機能を研究するコスト効果の高い、革新的な柔軟メソッドを提供します。彼らは多くのモデル有機体、器官、および刺激条件に適用されます。彼らは MPs のいくつかの種類の同定を可能にする、プロ炎症性と抗炎症機能に対処するため、将来的に使用できます。例として記述されている上皮創傷治癒の in vitroおよびin vivoにおける PMN MPs の関数を勉強する方法があります。マウス骨髄由来の Pmn は前述方法6からいくつかの変更と合わせられたの隔離のため提案するプロトコル。
さらに、この研究で説明されているプロトコルは検出と PMN MPs の 2 つの相補的な方法で見つけることができます特定のマーカーの評価、: 西部のしみし、フローサイトメトリーします。我々 は、標準プロトコル5を使用して MPs の免疫ブロットは簡単で信頼性の高い、しかし、流れ cytometry 計測器、および改良された騒音に信号の比率の感度の最近の進歩により、MPs のさらなる分析このメソッドを使用して見つけます。本研究では記述されていたプロトコルを組み込む最近の進歩と遠心分離速度と時間のサンプル フィルタ リングと凍結/ストレージの条件のための7の加算への変更を含む元の研究の記事からの提言,8、および「バック グラウンド ノイズ」を削減、PMN MPs の検出限界を向上、MPs のさまざまなサイズの間で区別する方法。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:968px;" width="967">
	<tbody>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:257px;">DMEM</td>
			<td style="width:181px;">Corning</td>
			<td style="width:181px;">10-041-CV</td>
			<td style="width:348px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:257px;">Fetal Bovine Serum (Heat inactivated)</td>
			<td style="width:181px;">Atlanta Biologics</td>
			<td style="width:181px;">S11150</td>
			<td style="width:348px;"></td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:257px;">Penicillin/Streptomycin (10,000 units penicillin / 10,000 mg/ml strep)</td>
			<td style="width:181px;">GIBCO</td>
			<td style="width:181px;">15140</td>
			<td style="width:348px;"></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;width:257px;">0.5 M EDTA</td>
			<td style="width:181px;">Fisher</td>
			<td style="width:181px;">BP2482</td>
			<td style="width:348px;"></td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:257px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:181px;">Sigma</td>
			<td style="width:181px;">S9888</td>
			<td style="width:348px;">Sterile and filtered through a 0.1 micron filter unit</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:257px;">Sterile filtered Histopaque 1077</td>
			<td style="width:181px;">Sigma</td>
			<td style="width:181px;">10771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:257px;">Sterile filtered Histopaque 1119</td>
			<td style="width:181px;">Sigma</td>
			<td style="width:181px;">11191</td>
			<td style="width:348px;">Density 1.119 g/ml.&#160; Solution of polysucrose and&#160; sodium diatrizoate. Bring to room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:257px;">Phosphate Buffered Saline (PBS) without Calcium and Magnesium</td>
			<td style="width:181px;">Cellgro</td>
			<td style="width:181px;">210-40-CV</td>
			<td style="width:348px;"></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;width:257px;">Ethyl Alcohol (200 proof)</td>
			<td style="width:181px;">Decon labs</td>
			<td style="width:181px;">2701</td>
			<td style="width:348px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:257px;">HBBS</td>
			<td style="width:181px;">Corning</td>
			<td style="width:181px;">21-022-CV</td>
			<td style="width:348px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:257px;">Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td style="width:181px;">Sigma</td>
			<td style="width:181px;">T8154&#160;SIGMA</td>
			<td style="width:348px;">Diluted 1:2 for cell viability counting</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:257px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:181px;">Abbot</td>
			<td style="width:181px;">50033</td>
			<td style="width:348px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:257px;">Anti-human CD11b-APC conjugated</td>
			<td style="width:181px;">Biolegend</td>
			<td style="width:181px;">301350</td>
			<td style="width:348px;">Clone ICRD44 (Final concetration: 1 &#181;g/mL)</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">BODIPY FL</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>B10250</td>
			<td style="width:348px;">N-(2-aminoethyl) maleimide&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Annexin V Binding Buffer</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>422201</td>
			<td style="width:348px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Calibration Beads for Flow Cytometry</td>
			<td>BioCytex</td>
			<td>7803</td>
			<td style="width:348px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">FITC Annexin V</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>640906</td>
			<td style="width:348px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Polymorphprep</td>
			<td>Axis-Shield PoC AS</td>
			<td></td>
			<td style="width:348px;">Sodium diatrizoate/Dextran 500, density 1.113 g/ml</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;width:257px;">C57BL/6 mice</td>
			<td style="width:181px;">Jackson Labs</td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td style="width:348px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:257px;">15 ml centrifuge tubes</td>
			<td style="width:181px;">Corning</td>
			<td style="width:181px;">430053</td>
			<td style="width:348px;"></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;width:257px;">50 ml centrifuge tubes</td>
			<td style="width:181px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:181px;">352070</td>
			<td style="width:348px;"></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;width:257px;">25 ml serological pipettes</td>
			<td style="width:181px;">Celltreat</td>
			<td style="width:181px;">229225B</td>
			<td style="width:348px;"></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;width:257px;">10 ml serological pipettes</td>
			<td style="width:181px;">Celltreat</td>
			<td style="width:181px;">229210B</td>
			<td style="width:348px;"></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;width:257px;">5 ml serological pipettes</td>
			<td style="width:181px;">Celltreat</td>
			<td style="width:181px;">229205B</td>
			<td style="width:348px;"></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;width:257px;">Pasteur pipettes&#160;</td>
			<td style="width:181px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:181px;">357575</td>
			<td style="width:348px;"></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;width:257px;">25 G x 5/8 in. Needles (precision glide needles)</td>
			<td style="width:181px;">BD</td>
			<td style="width:181px;">305122</td>
			<td style="width:348px;"></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;width:257px;">100 &#181;m cell strainers</td>
			<td style="width:181px;">Celltreat</td>
			<td style="width:181px;">229485</td>
			<td style="width:348px;"></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;width:257px;">Vacutainer tubes</td>
			<td style="width:181px;">BD</td>
			<td style="width:181px;">367251</td>
			<td style="width:348px;"></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;">LSR Fortessa Special Order Research Product (SORP)</td>
			<td>BD</td>
			<td>(SORP)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;">Swinging bucket centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>75007210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>(L8-80 M)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Micro-centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>&#160;VV-17703-15 (Fresco 17)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Swinging bucket centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>&#160;75004503 (Megafuge 40R)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Biopsy forceps, 28 cm</td>
			<td>Storz</td>
			<td>27071zj</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Image J</td>
			<td>National Institute of Health</td>
			<td>Open source&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and characterization of neutrophil-derived microparticles for functional studies

多形核好中球由来マイクロパーティクル (PMN)-国会議員) が脂質二重層、サイズ直径 50-1,000 nm に至ると球状機構の解明。MPs は、新しく進化して、細胞間コミュニケーションとシグナリング機械の重要な部分です。彼らのサイズと彼らのリリースの性質のため最近まで MP 存在を見落としていた。しかし、技術の向上と分析方法健康および病気の機能今浮上しています。ここに示すプロトコルは、フローサイトメトリーとイムノブロットによって分離して PMN MPs を評価を目指しています。さらに、いくつかの実装例のとおりです。MP 分離のこれらのプロトコルは高速で低コスト、および高価なキットの使用を必要としません。また、彼らは MPs 前 MP リリースする前にコピー元のセルのラベルし同様、次の分離、フローサイトメトリーによる可視化・解析用膜固有の蛍光染料を使用してのラベルにできます。これらのメソッドただし、Pmn と MPs と高度な分析機器の必要性の純度を含むいくつかの制限があります。ハイエンドの流れの cytometer は確実に MPs を分析し、ノイズまたは自動蛍光性のための偽肯定的な読み取りを最小限に抑えるために必要です。記述されていたプロトコル分離し、MP 器官を定義する使用ことができ、そのマーカーと異なる刺激的な条件の下での組成変化の特徴します。エクソソーム対膜の粒子の内容が異なっているかどうか、組織の恒常性に異なる役割を満たしているかどうかを調査するためサイズの不均一性を利用できます。最後に、次の分離と MPs、細胞応答の機能および様々 な疾患モデル (を含む、多形核白血球の炎症性疾患、炎症性腸疾患や急性肺障害など) の特性を探索できます。

代表的なヒトから分離された、マウスの Pmn MPs のフローサイトメトリーによる解析は、図 1に表示されます。PMN MPs のサイズの不均一性を評価して、図 1A, Bに示すように、サイズのビーズを比較することにより MPs。 メモ人間のする、サイズの不均一性に有意差は認められなかったマウスと人間の MPs の間.同様?...

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Isolation and Characterization of Neutrophil-derived Microparticles for Functional Studies

新しいプロトコルを特定し人間由来の微粒子を特徴付けるとおりマウス好中球。これらのプロトコルは遠心、フローサイトメトリーとイムノブロット微粒子コンテンツを分析する手法を活用し、細胞機能のさまざまなセル型から派生した微粒子の役割を研究する使用できます。

分離と機能研究の好中球由来の微粒子のキャラクタリゼーション

Polymorphonuclear neutrophil-derived microparticles (PMN)-MPs) are lipid bilayer, spherical microvesicles with sizes ranging from 50&#8211;1,000 nm in ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation of Functional Cardiac Immune Cells

機能心臓の免疫細胞の単離

Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5  These immune cells, which ...

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

機能と分子生物学的研究のためのプライマリマウスII型肺胞上皮細胞のフローサイトメトリ分離

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments

機能研究のためのマウス骨髄好中球と養子移入実験の分離、精製とラベリング

Neutrophils are critical effector cells of the innate immune system. They are rapidly recruited at sites of acute inflammation and exert protective or ...

Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection

Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection

プロデュース上皮損傷の解析<em&gt;赤痢アメーバ</em&gt;感染症

Entamoeba histolytica is the causative agent of human amoebiasis, a major cause of diarrhea and hepatic abscess in tropical countries. Infection is ...

Detecting Glycogen in Peripheral Blood Mononuclear Cells with Periodic Acid Schiff Staining

過ヨウ素酸シッフ染色で末梢血単核細胞中のグリコーゲンの検出

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. ...

Isolation and Characterization of Neutrophils with Anti-Tumor Properties

抗腫瘍特性を有する好中球の単離とキャラクタリゼーション

Neutrophils, the most abundant of all white blood cells in the human circulation, play an important role in the host defense against invading ...

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

上の機能的研究のための3Dヒト肺組織モデル<em&gt;結核菌</em&gt;感染

Tuberculosis (TB) still holds a major threat to the health of people worldwide, and there is a need for cost-efficient but reliable models to help us ...

Isolation, Characterization and Functional Examination of the Gingival Immune Cell Network

単離、特徴付けおよび歯肉免疫細胞ネットワークの機能検討

Immune cell networks in tissues play a vital role in mediating local immunity and maintaining tissue homeostasis, yet little is known of the resident ...

Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes

マウスの小腸リンパ球の単離およびフローサイトメトリーキャラクタリゼーション

The intestines &#8212; which contain the largest number of immune cells of any organ in the body &#8212; are constantly exposed to foreign antigens, both ...