Name: in vivo single-molecule tracking at the drosophila presynaptic motor nerve terminal
Uploaded: 2018-01-14T14:00:00
Duration: 6 min 45 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal at JoVE.com

אנו מודים ז'אן-בפטיסט Sibarita, דניאל Choquet (IINS, CNRS/אוניברסיטת בורדו) על תמיכתם די עם הניתוח מולקולה בודדת. במיוחד תודה ניק Valmas, ג'סיקה Mcgaw (QBI, אוניברסיטת קווינסלנד) על עזרתם עם הווידאו מקליט, קריינות, כמו גם איור עיצוב גרפי. עבודה זו נתמכה על ידי הפרויקט גילוי המועצה מחקר אוסטרלי (AR) (DP170100125 ל- F.A.M.), המועצה למחקר אוסטרלי (ליף גרנט LE0882864 ל- F.A.M.), מלגת העתיד מועצת המחקר האוסטרלי (גרנט ליף (FT100100725 B.V.S.), LE130100078 כדי F.A.M.) NHMRC הפרוייקט הענק (APP1103923 כדי B.V.S.). F.A.M. הוא עמית מחקר בכיר NHMRC (ONT1060075).

1. עיצוב של הטרנסגניים דרוזופילה המבטאים חלבונים מתויג mEos2
<ol><li>בחר את החלבון כדי להיות מתויג עם החלבון mEos2. כדי להגדיל את שיעור ההצלחה הדמיה, בחר חלבונים עם תחום transmembrane קרום פלזמה עצביים14 (למשל, Syntaxin-1A), חלבונים הסינפטיות או autophagosomes26,27 (למשל, Synaptobrevin-2), או חלבונים cytosolic עם אינטרקציה קרובה עם קרום פלזמה עצביים חלבונים (למשל, Munc18-1).</li>
	<li>לבנות transgenes קידוד החלבון מתויג mEos2 (איור 1). לעצב את ואחורה צבעי יסוד חלבונים ו- mEos2. הערה: רצף קידוד mEos2 יכול הגברה מן פלסמיד pmEos2-N1, אשר נועדה הפתיל קצה קרבוקסילי של החלבון עניין. שיבוט לדוגמה ניתן לבצע על ידי ויוו רקומבינציה ב האפייה בעזרת את pFL44S-attB-MCS-w + וקטור14,28, לסירוגין שיטות השיבוט אחרות יכול לשמש כמו גיבסון הרכבה פרוטוקול29.<ol>
<li>Linearize וקטור עם BamHI, XbaI, שותף להפוך ura3 - תאי שמרים עם השברים PCR קידוד mEos2 ו החלבון עניין. מזריקים עוברי דרוזופילה הבונה כדי ליצור קו לטוס הטרנסגניים30.</li>
	</ol>
</li>
	<li>אחורי התרבויות לטוס הטרנסגניים בינוני שמרים ומולסה רגיל או איזה תחליף מתאים אחרים הכלולים צלוחיות פלסטיק. כדי להבטיח גדולים למדי ובריאה עם העיתון ons סינפטית31, למנוע זבובים, צפיפות הבקבוקונים והפיכה של זבובים כדי בקבוקונים חדשים לאחר לכל יום להטלת ביצים; פעולה זו מבטיחה השלישי לחלל הזחלים ניזונים היטב ולהגיע בגובה המתאים עד שהם התחילו לנדוד על בינוני. הרימו את הזבוב הטרנסגניים בטמפרטורת החדר (25 ° C). הערה: עם העיתון ons סינפטית גדולים נוטים להניב כמות גדולה יותר של חלבונים דמיינו במהלך דימות.</li>
</ol>2. ניתוח של זחל לחלל השלישי
<ol><li>להפוך ≤20 הבסיס של polydimethylsiloxane בצורת גליל או semicylindrical (PDMS) מ מ קוטר, ≤20 מ מ, גובה באמצעות ערכת elastomer הסיליקון המתאימים (איור 2 א). מערבבים elastomer סיליקון עם סיליקון התקשות הסוכן ביחס של 10:1.<ol>
<li>מערבבים את התערובת היטב עבור 5 דק לשפוך התערובת לתוך תבנית עם dimsensions המפורטים לעיל. . תן לזה להקשיח בתנור ב 100 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות. הבסיס PDMS יהווה הבסיס שעליו לבצע את ניתוח. להבטיח הבסיס PDMS משתלב הבדידות מאכל תת תרבות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>בחר זחל נודד לחלל השלישי מהקיר המבחנה. השתמש סטריאו-במיקרוסקופ אופטי בהגדלה 4.5 להמחיש הזחל להציב בבסיס גלילי PDMS עם הצד הגבי למעלה.</li>
	<li>השימוש מעוקל, בזווית פינצטה לתקוע סיכות minutien על הראש מעל הפה ווים, בין השניים הרחבת spiracles הקדמי, ו על הזנב מעל פי הטבעת, בין spiracles האחורי שני. הוסף µL 40 של שניידר חרקים בינוני בטמפרטורת החדר אל הזחל קיבוע. הערה: פתרונות, כמו Hemolyph (HL3 או HL6) עשוי לשמש גם במקום של שניידר-פתרון-32,-33.</li>
	<li>מספקים גישה דרך הצד הגבי של קיר הגוף בטן של הזחל על ידי שימוש minutien pin כדי פצעים וחתכים לתוך האמצע של הקיר.</li>
	<li>שימוש מעיין מספריים כדי לגזור את הקיר הגוף תפתח נקודת החיתוך. חתך לאורך הקו האמצעי ב- הקדמי-את ישבנה לכיוון34.</li>
	<li>השתמש בסדר מלקחיים ואביב מספריים את המעיים הזחל: להסיר את האיברים הפנימיים, כולל בלוטות הרוק, קנה הנשימה, הבטן. לשטוף את הזחל פעמיים עם בינוני חרקים של שניידר.</li>
	<li>עם מלקחיים בסדר, תחזיק את המדפים קיר הגוף שני למתוח אותם החוצה ובעדינות לתקוע שני פינים minutien בכל צד. זה צריך לייצר תכשיר בצורת משושה (איור 2 א).</li>
	<li>לנתק את המוח של חוט עצבי הגחון באמצעות מספריים האביב כדי להקטין את האפשרות של תנועת השרירים במהלך דימות; זה משמש גם להחזיק את ההכנה שווידאתם המנה הדמיה. השתמש את הפינצטה מעוקלים כדי לדחוף את כל הפינים minutien שש לתוך הבסיס PDMS. הערה: רק חלק קטן של הפינים צריך להיות מוטבע בתוך קיר הבטן.</li>
	<li>כדי לאשר כי הזחל שרדה את ההליך לנתיחה, מעט לתקוע את חוט עצבי הגחון, זה צריך להפיק התכווצות סחרור לקיר הבטן זחל.</li>
</ol>3. מעט אלכסונית תאורה יחיד-חלקיקים מעקב מיקרוסקופ
<ol><li>היפוך הבסיס זחל גזור-PDMS על גבי צלחת תת תרבות. למלא את הצלחת הדמיה 2 מיליליטר חרקים בינוני של טמפרטורת החדר שניידר (איור 2B).</li>
	<li>לאתר מוטורי לגלוקוז בקטעים השני והשלישי עם הסינפסות על שרירי הבטן 6 ו-735 באמצעות ה-x 63 / 1.2 נה טבילה במי המטרה של מיקרוסקופ פלואורסצנטי גמורה קרינה פלואורסצנטית (TIRF).</li>
	<li>השתמש את עיניות במיקרוסקופ כדי לאתר הזחל גזור; לזהות שריר 6 על-ידי שימוש שדה בהיר תאורה.</li>
	<li>השתמש בתוכנת רכישה של מיקרוסקופ (ראה טבלה של חומרים), בתצורת TIRF; החליקו את זווית המצלמה קולימטור 1° כדי להגדיל את עומק החדירה, אחרת תעבור זווית קריטית TIRF כדי להשיג תאורה עקיפה.</li>
	<li>. הפעילי את 488 ננומטר לייזר לדמיין mEos2 בירוק השתמש כוח לייזר נמוך (פחות מ- 5% של 22.8 mW) כדי למנוע הלבנת את קרינה פלואורסצנטית ירוק. לאתר את צמתי neuromuscular (אשר נראים כמו חרוזים על חוט) ולרכוש תמונה ברזולוציה נמוכה TIRF.</li>
	<li>לעבור בו זמנית על 405 ננומטר לייזר (photoconverts mEos2 מירוק מינים אדומים) ו לייזר nm (תמונה mEos2 photoconverted אדום) 561 למקם stochastically חלבונים פלורסנט mEos2 יחיד. הערה: מומלץ השימוש 405 ננומטר לייזר צריכת חשמל נמוכה (0.005% 0.9 4.78 mW) כמו זה מאפשר קצב photoconversion קבועים יחסית במהלך הסרט. שימוש בין 50 ל- 75% ננומטר לייזר 561 (20.1 mW), כמו זה מספיק כדי לרכוש פלורסצנטיות מן המין mEos2 אדום מבלי להשפיע לרעה על המורפולוגיה של רקמות השרירים המקיפים את צומת עצב-שריר.</li>
	<li>עבור כל שרשרת צומת עצב-שריר, רוכשים פעם סדרה מורכבת של מסגרות 15,000 או יותר ב 33 הרץ. שמור תבנית as.czi על מנת לשמר את המטה-נתונים הנלווה לעיון אפשרי.</li>
	<li>השתמש ImageJ כדי להמיר קבצי סרט '.czi' '.tiff'.</li>
	<li>לנתח את הסרטים רכשה עם מולקולה בודדת מתאים ומעקב אחר תוכנה אנליטית11,14,36 כגון TrackMate פיג ' י/ImageJ37 (ראה טבלה של חומרים). מאתרת את 'x' ו- 'y' נקודות הציון של כל לוקליזציה מאת התאם גאוסיאני של נקודת העוצמה להפיץ את הפונקציה (PSF). הערה: פתרון בעיות: אם קרינה פלואורסצנטית ירוק לא נצפית או עמום מדי באזור צומת עצב-שריר בתגובה לחשיפה 488 ננומטר לייזר, לעבור בקצרה על לייזרים photoconverting את והדמיה (405 ננומטר ו-561 nm), כמו זה עוזר לייצר יותר של האדום מינים של mEos2. ולאחר מכן לעבור בחזרה אל 488 ננומטר לייזר ולקחת תמונה TIRF.</li>
</ol>4. מולקולה בודדת לוקליזציה של הזחלים קבוע
<ol><li>כדי למדוד את הגודל nanocluster חלבון באמצעות כף, החלף בינוני חרקים של שניידר לאחר ניתוח עם מקבע - paraformaldehyde 4% מעורבבת עם פוספט buffered תמיסת מלח (PBS).</li>
	<li>דגירה הזחל למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>הסר הקרע פינס ולמקם הזחל קבוע mL 1.7 נקה צינור microcentrifuge snap-lock.</li>
	<li>לנתח ולפתור כמו רבים הזחלים אחרים לפי הצורך, ואז לשטוף אותם שלוש פעמים עם PBS.</li>
	<li>החלף את PBS בלוק מאגר (פתרון של PBS, 0.1% טריטון X-100 ו- 3% סרום עז נורמלי).</li>
	<li>לשטוף את הזחלים עם PBS שלוש פעמים ולאחר מכן דגירה עם נוגדן ראשוני הכרחי (מדולל בפתרון מאגר בלוק).</li>
	<li>דגירה ללון בבית 4 oC.</li>
	<li>לשטוף את הזחלים 3 פעמים עם PBS ולאחר מכן דגירה עם הנוגדן משניים הדרושים (מדולל בפתרון מאגר בלוק).</li>
	<li>לשטוף את הזחלים 3 פעמים עם PBS, לצרף הזחל חזרה על בסיס PDMS, ותמונה תיאר כאמור לצורך מעקב מולקולה בודדת.</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

פרוטוקול זה מתאר מולקולה בודדת מעקב של חלבונים מתויג mEos2 בצומת עצב-שריר של הזחל לחלל השלישי דרוזופילה . כדי למנוע ביטוי יתר של חלבון מהונדס, ביטוי Syntaxin-1A-mEos2 היה מונע על ידי יזם Syntaxin-1A אנדוגני. מחקרים של חלבונים סינפטיים ניידות בעיקר היה מוגבל במבחנה לחקירות של תאים בתרבית, נוירונים בקליפת המוח9,11,12,13. אם חלבונים אלה שהפגינו חתימות ניידות דומה-חיים אינו ידוע בעיקר. כדי להמחיש יחיד-חלבון ניידות ויוו, מגבלות כגון שקיפות אופטית, נגישות ועומק חדירה צריך להתגבר. לנתח ההכנה זחל והצגה של צמתי neuromuscular מוטבע על פני השטח של השריר, לנו למנוע את סוגיית אופטי שקיפות ונגישות. ניסיונות התמונה ניידות יחיד-המולקולה בתצורה רגילה של TIRF עלו בתוהו. עם זאת, השימוש תאורה עקיפה מעט מאפשר לייזר עירור מוגברת חודר לעומק. יתר על כן, סיכות minutien להשתמש כדי לשתק את הזחל עזר כדי למנוע כל השפעה שלילית אפשרי השימוש הרדמה על חלבון ניידות. זה אפשרי להשתמש מטרות הגדלה גבוהה יותר, כגון ה-100 x שמן טבילה מטרות, כדי להמחיש מולקולות יחיד בתוך vivo. עם זאת, ההגדלה מוגברת עשוי להגביר את occurance של נשתל בפוקוס. בנוסף, השתמשנו בעוצמה נמוכה יותר (~ 30%) 561 ננומטר לייזר בהצלחה את התמונה מולקולות יחיד-מסופי עצבים מוטוריים. בדיקות נוספות עשויים להידרש לשימוש עוצמת הלייזר נמוך יותר.
פרוטוקול זה מתאים להמחיש את הניידות של חלבונים סינפטיים תוך הקרבה של קרום פלזמה עצביים. באמצעות גישה זו, הניידות של החלבון מוקש - Syntaxin-1A ואת autophagosome מאוגדים חלבון Atg18a - כבר בהצלחה שבעורך vivo בתוך14,26. הניידות של חלבונים על נוירון מוטורי אקסונים ניתן גם חקר27. עם זאת, חקירת הניידות של חלבונים על מוח או בחוט הגחון עצב יכול להתברר כקשה להעריך עקב האות רקע המיוצר על ידי הרקמה הבסיסית; בנוסף, להמחיש חלבון ניידות על מבנה המוח באותו ידרוש fluorescently תיוג את מבנה המוח (כדי לוודא replicability), יהיה צורך להשתמש הדמיה כפולה-מצלמה.
השיטות הקיימות זמינים עבור סופר-רזולוציה מיקרוסקופיה ב דרוזופילה מוגבלות בעיקר עוברי הדמיה, ולא יותר פיתחו השלישי לחלל זחל38,39. הבעיה העיקרית עם פרוטוקולים אלה היא כי הם תשואה מספר נמוך של מסלולים באזור עם תמונה, ומכאן למנוע ניתוח מעמיק של ניידות הברית22,40. שלנו אין ויוו מולקולה בודדת מעקב פרוטוקול יש את היכולת לייצר מספר רב של מסלולים, ולכן ניתן להשתמש במודלים של בעלי חיים אחרים כגון Caenorhabiditis elegans דג זברה. אכן, כל שרשרת NMJ שנוצר מסלולים ~ 2,400 שהופך אותו מתאים לניתוח מצבים ניידים שונים של מעברים בין מדינות אלה,14,27. בנוסף, אין ויוו מולקולה בודדת הדמיה אסטרטגיות רבות מסתמכים על השימוש בהרדמה כדי לשתק את חיות20,22, אשר עלולה לשנות את הפונקציה הפיזיולוגיות תחת אשר הסתיימה ההדמיה. כאן אנחנו אופטימיזציה פרוטוקול "ללא הרדמה" לשתק את הזחלים באמצעות סיכות minutien.
שימוש פוטנציאלי של פרוטוקול זה ייתכן המדגימה את הניידות של חלבונים בשלושה ממדים. התפתחויות אחרונות סופר-רזולוציה מיקרוסקופיה לאפשר ניידות חלבון מטמיעים במבחנה ב- 'x', 'y' ו- 'z' מידות41,42. השיטה הנוכחית שלנו אינו חשבון לניידות של חלבונים בציר 'z'. עדיין העצב המוטוריים דרוזופילה מסוף הוא מבנה כדורי, בגישה בעתיד יקר יהיה לכמת חלבון ניידות ב- נפח תלת מימדי43. הדמיה ב z-המימד הוא ריאלי באמצעות עדשת אסטיגמטי. לחלופין, במצב TIRF44,45, z-הרזולוציה הוא גם גדל. עם זאת, בניסויים שלנו, השתמשנו תאורה עקיפה מעט להמחיש מולקולות יחיד של syntaxin1A-mEos2 ללא העדשה אסטיגמטי.
לסיכום, זמינות של שני הטרנסגניים דרוזופילה לטוס מלאי המבטאים חלבונים מתויג עם חלבון photoconvertible, PDMS בסיס לנתח הזחל מהונדס, וכן מיקרוסקופ TIRF מצויד עם האפשרות של שינוי זווית תאורה הם הכלים החשובים ביותר הדרוש כדי להמחיש חלבונים יחיד כפי שמתואר פרוטוקול זה.

תקשורת עצביים מסתמך על שחרור נוירוטרנסמיטר, אשר מתרחשת באמצעות היתוך גרעיני מוסדר של המכילים נוירוטרנסמיטר הסינפטיות עם קרום פלזמה1. זה תהליך הנקרא אקסוציטוזה2,3,4,5,6 הוא דינמי מאוד והוא יכול להיות למעלה או למטה-מוסדר על פי תנודות בשיעור של גירוי7. החלבונים המעורבים בתהליכים אלה כפופים תנועה בראונית ולהציג ולכן nanoscopic הארגון לשמר מגוון של איגוד פעולות לחזק אלה פונקציות פיזיולוגיים. קרום פלזמה חלבונים הם מאוד דינמי, המאפשר רוחבי השמנה של מולקולות אל תוך nanoclusters קרום פלזמה7,8,9,10,11, 12. ככזה, חוקרים את הניידות של חלבונים אלה מסייעת להבהיר שלהם למצב של פעולה8. חלבונים סינפטיים כגון מסיסים N-ethylmaleimide פקטור רגיש מצורף חלבון הקולטנים (מלכודות), לדוגמה Syntaxin-1A, ידועים כעת שהפגינו ניידות מהירה רוחבית, כמו גם לרוחב השמנה nanoclusters שיכול לשרת כמו מולקולרית מחסני ואתרי שלפוחית פיוז'ן9,13,14,15.
ההתפתחות האחרונה של חלבונים פלורסנט photoconvertible, כגון monomeric (ז)16,Eos17 קאךה18, אפשרה את הרזולוציה nanoscopic של קרום פלזמה עצביים חלבונים באמצעות גישות כאלה לוקליזציה מופעל צילום מיקרוסקופ (דקל), שחזור אופטי סטוכסטי מיקרוסקופ (סערה)14,15,19. התפתחויות אלה אפשרו חקירות לתוך הניידות ואת nanoclustering של חלבונים ביולוגי בתרבית תאים חיים, נוירונים. לאחרונה, מחקרים בוצעו להבהיר (ברזולוציות דומה גבוהה) הדינמיקה והארגון של חלבונים אלה ממברנה בתוך הנוירונים של אורגניזמים חיים שלמים כזה . מאסכאלאס, Caenorhabditis elegans, ו- דרוזופילה melanogaster14,20,21,22.
חוקרים את הדינמיקה והארגון של יישום חלבון ויוו דורשת לא רק שימוש הכלים שפותחו לאחרונה סופר-רזולוציה הדמיה (כגון דקל, סערה, photoconvertible fluorophores), אלא גם את היכולת להתגבר על מכשולים כאלה כמו נגישות של החלבון ואת עומק החדירה של הלייזר הדמיה. הדמיה חלבונים תאיים על חיים שלמים הוא מטבעו מאתגר כמו זה הדמיה חלבונים על מבנים מוטבע עמוק בתוך רקמות החיים של החיה ללא פגע, כגון ההיפוקמפוס עכבר ללא פגע. לפיכך, חלבונים או קרוב לפני השטח של הרקמה הם צילמו בקלות רבה יותר. קושי נוסף עם דימות in vivo הוא הבטחת הפארמצבטית מעבר בעלי חיים. כפי האנטומיה עלולות להיות שונות דוגמא אחת לאחרת, בחירת מבנה בקלות של שכפול בדגימות שונות בבעלי חיים שלמים גם להוכיח מאתגר. השימוש של מבנים סטריאוטיפית, כגון synapses, לעזור עם התגברות על קשיים אלה.
מחקרים שנעשו לאחרונה יש תמונה חלבון ניידות בבעלי חיים עם האפידרמיס שקוף אופטית כגון Caenorhabditis elegans22, בזמן חקירות אחרות יש תמונה ארגון החלבונים על פני השטח של איבר/רקמות, לדוגמה הדמיה אקטין בנוירונים בקליפת המוח דרך הגולגולת של העכבר חי21. במקרים מסוימים, הרדמה שימשו כדי לשמור את החיה משותק; עם זאת, הרדמה מסוים עשוי להשפיע לרעה החלבון עניין. לפיכך לבחון אמצעים חלופיים כדי לשמור על חיות משותק במהלך דימות ויוו כדי למזער את השגיאה.
אזהרה נוספת כדי סופר-רזולוציה הדמיה ויוו היא לייזרים המשמש כדי להאיר את החלבונים עניין עלול להשפיע לרעה את הרקמה שמסביב, ולכן שמירה על עוצמת עירור נמוך ככל האפשר מומלץ. תאורה של הרקמה שמסביב על ידי הלייזר גם נוטה להגביר את האות רקע. השימוש בעוצמה נמוכה עירור מסייעת להפחית את הרקע, לפרסמה להיות זה עלול להוביל לירידה התשואה פוטון חלבון פלואורסצנטי. רקע חיסור במהלך ניתוח יכול לשמש אלטרנטיבה אומר להפחית את האות רקע לפני ניתוח תמונות.
דרוזופילה מציג אורגניזם אידיאלי ויוו הדמיה כפי שהיא מספקת כלים גנטיים ומבוססת על חקירת פונקציה של חלבונים ספציפיים. הרצף הפעלת נגד הזרם (UAS)-מערכת Gal4 מאפשרת הבעה טמפורלית המרחבי של חלבונים, ולכן ניתן לתמרן עצבית23, כך התרמו-גנטית גירוי באמצעות דרוזופילה ארעית המשפחה תת פוטנציאלי קולטן A1 (dTRPA1)24 או באופטו-גנטית גירוי באמצעות far-red-העביר CsChrimson25 יכול להיות משולב עם הדמיה14. אנו היה להתגבר על הרבה סיבוכים של ביצוע ויוו מולקולה בודדת הדמיה במערכת זו, תאר איך מעקב יחיד-חלקיק יכול להתבצע בהזחלים לחלל השלישי melanogaster דרוזופילה .

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="682">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:267px;">PDMS (Sylgard 184 silicone elastomer kit)</td>
			<td style="width:163px;">Dow Corning Corporation</td>
			<td colspan="2" style="width:253px;">000000000001064291</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Glass-bottomed Culture Dish</td>
			<td>In Vitro Scientific</td>
			<td>D29-20-1.5-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Optical Stereo-microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZ51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Curved Tweezers (Style 5/45)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>0208-5AC-PO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Minutien Pins (0.1mm)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26002-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Schneider&#39;s Insect Medium</td>
			<td>Sigma, Life Sciences</td>
			<td>S0146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Vannas Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Fine Forceps (Dumont #5)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">ELYRA PS.1 Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>PS.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-515Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Paraformaldehyde (16%)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T-9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Normal Goat Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Maxyclear snaplock microcentrifuge Tube (1.7 mL)</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-175-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Zen Black acquisition software</td>
			<td>Carl Zeiss, 2012</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:267px;">Metamorph software</td>
			<td style="width:163px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:87px;">7.7.8</td>
			<td>PALM Tracer Plugin</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Fly strain</td>
			<td></td>
			<td colspan="2">w1118; HA-Sx1A-mEos2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo single-molecule tracking at the drosophila presynaptic motor nerve terminal

מספר גדל והולך של טכניקות במיקרוסקופ סופר רזולוציה מסייעים לחשוף את המנגנונים המפקחים על העולם הסלולרי ננו. מולקולה בודדת הדמיה הוא צובר תאוצה כפי שהיא מספקת גישה יוצאת דופן הפריט החזותי של מולקולות בודדות בתאים חיים. כאן, אנו מתארים את הטכניקה שפיתחנו כדי לבצע מעקב יחיד-חלקיקים לוקליזציה מופעל צילום מיקרוסקופ (sptPALM) בהזחלים דרוזופילה . סינפטית תקשורת מסתמך על חלבונים presynaptic מפתח שפועלים על ידי עגינה, הטרמה, קידום הפיוז'ן של המכילים נוירוטרנסמיטר שלפוחית עם קרום פלזמה. מגוון רחב של אינטראקציות חלבון-חלבון, חלבון-ליפיד בחוזקה מווסת תהליכים אלה ולהציג החלבונים presynaptic ולכן שינויים הניידות המשויכים כל אחד המאורעות מפתח. חוקרים כמה ניידות של חלבונים אלה להרכב שלהם תפקיד פיזיולוגי, חיה חיים שלמים חיוני להבנת מנגנון הפעולה המדויק שלהם. חילוץ חלבון ניידות עם רזולוציה גבוהה ב- vivo דורשת התגברות על מגבלות כגון שקיפות אופטית, נגישות, עומק החדירה. נתאר כמה חלבונים פלורסנט photoconvertible מתויג כדי החלבון presynaptic Syntaxin-1A ניתן דמיינו באמצעות תאורה עקיפה קלה, מעקב אחר בתחנה עצבים מוטוריים או לאורך האקסון של נוירון מוטורי השלישית של instar דרוזופילה זחל.

באמצעות פרוטוקול מהונדס, המפורטים לעיל, Syntaxin-1A-mEos2 Drosophilamelanogaster היו שנוצר (איור 1). הטרנסגניים השלישי instar דרוזופילה הזחלים היו גזור על הבסיס גלילי PDMS (איור 2 א-F). כדי להמחיש מולקולות יחיד של Syntaxin-1A, השתמשנו דקל על מיקרוסקופ TIRF עם תאורה לייזר מעט אלכסונית14.
מולקולות יחיד של Syntaxin-1A שהיו תחת מעקב על המסופים presynaptic עצבים מוטוריים על שריר 6 של המקטע השני בטן. ידי קרינה פלואורסצנטית הירוק של mEos2 יכול להתגלות כפי שמוצג בתמונה ברזולוציה נמוכה של Syntaxin-1A-mEos2 על סוג 1b עם העיתון ons כשהוא מתרגש באמצעות 488 ננומטר לייזר (איור 3 א). בניסויים הדמיה, כביש 405 ננומטר, 561 nm עירור לייזר במעמקי הדמיה היו 133.5 nm ו- 165.6 nm, בהתאמה. התמונה ירוק נרכשה כמו ממוצע של 16 מסגרות בודדות. הדימוי הירוק הזה נעשה שימוש כדי ליצור את האזור של ריבית המשמשת להגבלת ניתוח של localizations בסרט photoconverted אל המסופים עצבים מוטוריים presynaptic לבד.
הניתוח של סרטים sptPALM photoconverted רכשה שנוצר על עוצמת סופר-נפתרה, מקדם דיפוזיה, וממפה מסלול (איור 3 א). Syntaxin-1A-mEos2 ניידות היה עוד יותר לכמת על ידי ניתוח של העקירה ממוצע הריבועים (MSD) של מסלולים בודדים (איור 3B). השוואות סטטיסטי יכול להיעשות באמצעות השטח מתחת לעקומה MSD (איור 3B). ניתוח נוסף של ניידות מניב התפלגות מקדם דיפוזיה של Syntaxin-1A-mEos2, זה יכול להיות מוערך סטטיסטית על ידי השוואה של הנייד לאוכלוסיות משותק (איור 3C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56952/56952fig1.jpg"> איור 1 : יצירת מבנים מתויג mEos2. PFL44S-attB-MCS-w + וקטור הוא לליניארית עם BamHI ו- XbaI. קטעים חופפים תגובת שרשרת פולימראזית (PCR) קידוד החלבון עניין (פוי), mEos2, בהתאמה, יכול להיות משובטים, לדוגמה, ויוו רקומבינציה בתאים שמרים ura3 - או על ידי הרכבה גיבסון. הערה כדי ליצור את transgene Syntaxin-1A-mEos2, שיבטנו הבונה ולצדו יזם Syntaxin-1A אנדוגני של שליחות קטלנית רצפים. הבונה הנוצרת כתוצאה מכך יכול להיות מוזרק לתוך עוברי דרוזופילה כדי ליצור קו לטוס הטרנסגניים לבטא את החלבון עניין (פוי) דבוקה mEos2. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56952/56952fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56952/56952fig2.jpg"> איור 2 : דרוזופילה זחל לנתיחה, תאורה עקיפה. (א) הסכימה מציג ניתוח זחל דרוזופילה בוצעו על בסיס PDMS חצי-גלילי. זחל שפרוסה נערך על גבי PDMS ג'ל על ידי שימוש minutien סיכות. (בג) ההכנות זחל-PDMS הונח בתוך תבשיל שיש תת תרבות חרקים בינוני של שניידר. מיקרוסקופ TIRF בתצורה של תאורה עקיפה מעט שימש להציג באופן חזותי Syntaxin-1A-mEos2 המסופים עצבים מוטוריים. (D-F) בסיס PDMS חצי-גלילי עם זחל דרוזופילה גזור. הכנת זחל-PDMS הונח בתוך צלחת הדמיה מלאה בינוני של שניידר, הזחל צולמה על המיקרוסקופ דקל סופר רזולוציה. סולם בר, 10 מ מ. (איור זה שונה מ-14). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56952/56952fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56952/56952fig3.jpg"> איור 3 : אין ויוו מעקב Syntaxin-1A-mEos2-presynaptic עצבים מוטוריים מסוף. (א) A ברזולוציה נמוכה TIRF תמונה של Syntaxin-1A-mEos2 על 1b סוג המסוף מנוע עצב. ניתוח של photoconversion סרטים עם תמונה-הרץ 33 שנוצר בעוצמה סופר-נפתרה sptPALM מקדם דיפוזיה, מסלול מפות. מסלולים בודדים 5,309 היו רכישת הסרט יותר מ-16,000 מסגרות תמונה. סולם בר, 3 μm. (בג) ממוצע הריבועים תזוזה (MSD) של Syntaxin-1A-mEos2 סומן מהתחנות עצבים מוטוריים שונים 6; השטח מתחת לעקומה MSD (AUC) נעשה שימוש כדי לכמת את רמת ניידות. התפלגות מקדם דיפוזיה חושף אוכלוסיות Syntaxin-1A ניידים, משותק ניתן לכמת כמו יחסי אחד מהשני; ממוצע של מסלולים ~ 2,400 התקבלו לכל עצבים מוטוריים מסוף (n = 3 הזחלים). הנתונים שהוצגו רשע לשגיאה הסטנדרטית של ממוצע. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56952/56952fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal at JoVE.com

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

אין ויוו מעקב אחר בתחנת האוטובוסים Presynaptic עצבים מוטוריים דרוזופילה מולקולה בודדת

כאן אנחנו מדגימים כיצד מולקולה בודדת לוקליזציה מופעל צילום מיקרוסקופ יכול להתבצע על הטרמינל עצבים מוטוריים של חיים דרוזופילה melanogaster השלישי instar זחל.

An increasing number of super-resolution microscopy techniques are helping to uncover the mechanisms that govern the nanoscale cellular world. ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

בשנת vivo ויזואליזציה של שלפוחית ​​Synaptic בתוך האקסונים תסיסנית המגזרי הזחל

Elucidating the mechanisms of axonal transport has shown to be very important in determining how defects in long distance transport affect different ...

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Patch-clamp מדידות קיבול ו Ca 2 + הדמיה על מסופי עצב יחיד ב Slices רשתית

Visual stimuli are detected and conveyed over a wide dynamic range of light intensities and frequency changes by specialized neurons in the vertebrate ...

Acute Dissociation of Lamprey Reticulospinal Axons to Enable Recording from the Release Face Membrane of Individual Functional Presynaptic Terminals

החריפה דיסוציאציה של האקסונים Reticulospinal צמד ים כדי לאפשר הקלטה משחרור הפנים ממברנה של מסופי Presynaptic פונקציונליים פרט

Synaptic transmission is an extremely rapid process. Action potential driven influx of Ca2+&#160;into the presynaptic terminal, through voltage-gated ...

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

למה כימות Matters: אפיון פנוטיפים בבית<em&gt; תסיסנית</em&gt; זחל Neuromuscular צומת

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic ...

Optical Monitoring of Living Nerve Terminal Labeling in Hair Follicle Lanceolate Endings of the Ex Vivo Mouse Ear Skin

Optical Monitoring of Living Nerve Terminal Labeling in Hair Follicle Lanceolate Endings of the Ex Vivo Mouse Ear Skin

ניטור אופטי של תיוג מסוף העצב חיים זקיק השיער אזמלי Endings של<em&gt; Ex Vivo</em&gt; עור אוזן עכבר

A novel dissection and recording technique is described for optical monitoring staining and de-staining of lanceolate terminals surrounding hair follicles ...

Olfactory Behaviors Assayed by Computer Tracking Of Drosophila in a Four-quadrant Olfactometer

Olfactory Behaviors Assayed by Computer Tracking Of Drosophila in a Four-quadrant Olfactometer

התנהגויות חוש הריח assayed ידי מעקב ממוחשב של<em&gt; תסיסנית</em&gt; בתוך אולפקטומטר ארבעה-רביע

A key challenge in neurobiology is to understand how neural circuits function to guide appropriate animal behaviors. Drosophila melanogaster is an ...

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

In vivo ג&#39;ין העברה בתאי שוואן בעצב מכרסמים Sciatic ידי Electroporation

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

צעד-אחד פשוט פרוטוקול לנתיחה עבור כל הר הכנה למבוגרים<em&gt; תסיסנית</em&gt; Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

ויזואליזציה של דפוס היטל אקסונל של נוירונים מוטוריים עובריים ב<em&gt; תסיסנית</em

The establishment of functional neuromuscular circuits relies on precise connections between developing motor axons and target muscles. Motor neurons ...

3D Kinematic Analysis for the Functional Evaluation in the Rat Model of Sciatic Nerve Crush Injury

3D ניתוח קימטי עבור הערכה פונקציונלית במודל חולדה של פציעה העצבים הגיד מעיכה

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of ...