Name: in vivo single-molecule tracking at the drosophila presynaptic motor nerve terminal
Uploaded: 2018-01-14T14:00:00
Duration: 6 min 45 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal at JoVE.com

Vi takker Jean-Baptiste Sibarita og Daniel Choquet (IINS, CNRS/Universitetet i Bordeaux) for vennlig støtte med enkelt-molekylet analyse. Vi takke spesielt Nick Valmas og Jessica Mcgaw (QBI, Universitetet i Queensland) for deres hjelp med video innspillingen, voice-over, samt finne grafisk design. Dette arbeidet ble støttet av australske Research Council (AR) oppdagelsen prosjektet (DP170100125 F.A.M.), den australske forskningsråd (LIEF Grant LE0882864 F.A.M.), fremtiden fellesskap (FT100100725 til B.V.S.), australske forskningsråd (LIEF Grant LE130100078 til F.A.M.) og NHMRC prosjektstøtte (APP1103923 til B.V.S.). F.A.M. er NHMRC seniorstipendiat (ONT1060075).

1. prosjektert av transgene Drosophila uttrykke mEos2-merket proteiner
<ol><li>Velg proteinet skal merkes med mEos2 protein. For å øke suksessraten tenkelig, Velg proteiner med et transmembrane domene i neuronal plasma membranen14 (f.eksSyntaxin-1A), proteiner synaptic blemmer eller autophagosomes26,27 (f.eks Synaptobrevin-2), eller cytosolic proteiner med tett samspill med neuronal plasma membran proteiner (f.eksMunc18-1).</li>
	<li>Konstruere effekter av transgener koding mEos2-merket protein (figur 1). Utforme forover og bakover grunning for protein og mEos2. Merk: MEos2 koding sekvensen kan bli forsterket fra pmEos2-N1 plasmider, som er utformet for å fusjonere til C-terminus av protein av interesse. Kloning kan for eksempel utføres av i vivo rekombinasjon i Saccharomyces cerevisiae bruker pFL44S-attB-MCS-w + vektor14,28, vekselvis andre kloning metoder kan brukes som Gibson montering protokollen29.<ol>
<li>Linearize vektoren med BamHI og XbaI og co forvandle ura3 - gjærceller sammen med PCR fragmenter koding mEos2 og protein av interesse. Injisere Drosophila embryo med konstruere å generere en transgene flua linjen30.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bakre transgene fly kulturer på standard gjær og molasses middels eller noen andre passende erstatning i plast hetteglass. For å sikre rask og ganske stor synaptic boutons31, unngå overbefolkning fluer i hetteglass, og snu flyr til nye ampuller etter hver dag med egg-legging; Dette sikrer tredje skikkelsen Larvene er frisk matet og nå riktig størrelse når de begynne å vandre på mediet. Øke transgene fly ved romtemperatur (25 ° C). Merk: Større synaptic boutons tendens til å gi større mengde proteiner visualisert under bildebehandling.</li>
</ol>2. Disseksjon av tredje skikkelsen Larven
<ol><li>Foreta en sylindriske eller semicylindrical formet polydimethylsiloxane (PDMS) base ≤20 mm i diameter og ≤20 mm i høyden ved hjelp av en passende silikon-elastomer kit (figur 2A). Bland silikon med en silikon herding agent i forholdet 10:1.<ol>
<li>Rør blandingen grundig for 5 min. Hell blandingen i en form med dimsensions ovenfor. La det stivne i en ovn ved 100 ° C i 45 min. PDMS base vil tjene som grunnlag å gjennomføre disseksjon. Sikre PDMS basen passer inn i brønnen av en glassbunn kultur parabol.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Velg en vandrende tredje skikkelsen Larven medisinglass veggen. Bruk en optisk stereo-mikroskopet på 4,5 forstørrelse for å visualisere Larven plassert på PDMS sylindriske basen med dorsal side opp.</li>
	<li>Buet og vinklet pinsetter å stikke minutien pinner på hodet over munnen krokene, mellom de to utvide fremre voksne, og hale over anus, mellom de to bakre voksne. Legge til 40 µL av Schneiders insekt medium ved romtemperatur på immobilisert Larven. Merk: Hemolyph-lignende løsninger (HL3 eller HL6) kan også brukes i Schneiders løsning32,33.</li>
	<li>Gir tilgang via dorsal side av bukveggen kroppen av Larven ved bruk av en minutien pinne til incise i midtlinjen av veggen.</li>
	<li>Bruk vår saks til å klippe kroppen veggen åpne fra snitt poenget. Skjær langs midtlinjen i anterior-posterior retning34.</li>
	<li>Bruke fine tang og våren saks å disembowel Larven: fjerne de indre organene inkludert spyttkjertler, trachea og gut. Vask Larven to ganger med Schneiders insekt medium.</li>
	<li>Med fine tang, holde to kroppen veggen flaps, forsiktig strekke dem ut og holde to minutien pinner på hver side. Dette bør gi en hexagonformede forberedelse (figur 2A).</li>
	<li>Koble hjernen fra det ventrale nervesystemet med våren saks for å redusere muligheten for muskel bevegelse under bildebehandling; Dette fungerer også å holde forberedelse mot tenkelig parabolen. Bruke buede pinsett for å presse alle seks minutien pinner i en PDMS base. Merk: Bare en liten del av pinnene skal bygges i bukveggen.</li>
	<li>Bekrefte at larvene har overlevd disseksjon prosedyren, litt rote ventrale, skal dette lokke fram en peristaltiske sammentrekning av Larven bukveggen.</li>
</ol>3. litt skrå belysning Single-partikkel sporing mikroskopi
<ol><li>Invertere dissekert Larven-PDMS basen på en glassbunn kultur parabol. Fyll tenkelig parabolen med 2 mL romtemperatur Schneiders insekt medium (figur 2B).</li>
	<li>Finn motor neurons i andre og tredje segmenter med synapser på magemusklene 6 og 735 med 63 x / 1.2 NA vann nedsenking mål på fluorescerende totale interne refleksjon fluorescens (TIRF) mikroskop.</li>
	<li>Bruk okularene av mikroskopet for å finne dissekert Larven; identifisere muskel 6 ved bruk av lysende felt belysning.</li>
	<li>Bruke mikroskop oppkjøpet programvaren (se Tabell for materiale), i TIRF konfigurasjon; Skyv collimator kameravinkelen til 1° å øke penetrasjon dybden, ellers bevege av TIRF kritisk vinkel å oppnå skrå belysning.</li>
	<li>Slåpå 488 nm laser for å visualisere mEos2 i grønt. Bruk en lav laser makt (mindre enn 5% av 22,8 mW) å unngå bleking den grønne fluorescensen. Finn de nevromuskulær veikryssene (som ser ut som perler på en snor) og kjøpe en lav oppløsning TIRF bilde.</li>
	<li>Samtidig slå på 405 nm laser (photoconverts mEos2 fra grønt til rødt arter) og 561 nm laseren (bilde photoconverted røde mEos2) å lokalisere stochastically enkelt mEos2 fluorescerende proteiner. Merk: Bruk av lav 405 nm laser makt anbefales (0.005 0,9% av 4.78 mW) som dette gir en relativt konstant photoconversion hastighet under filmen oppkjøpet. Bruk mellom 50 og 75% av 561 nm laser (20,1 mW), da dette er tilstrekkelig til å erverve fluorescens fra røde mEos2 arter uten negativ innvirkning morfologi av muskelvev rundt nevromuskulær krysset.</li>
	<li>For hver nevromuskulær krysset kjede, erverve gangen serien består av 15.000 rammer eller mer på 33 Hz. as.czi lagringsformat for å bevare tilhørende metadataene for mulig referanse.</li>
	<li>Bruk ImageJ konvertere ".czi" filmfiler til "TIFF" filer.</li>
	<li>Analysere ervervet filmer med egnet single-molekylet sporing analytisk programvare11,14,36 som TrackMate på FIJI/ImageJ37 (se Tabell for materiale). Finner 'x' og 'y' koordinatene for hver lokalisering av Gaussian passer intensiteten punkt spredning funksjon (PSF). Merk: feilsøking: Hvis grønne fluorescens ikke er observert eller for svak i nevromuskulær krysset ved eksponering til 488 nm laser, kort slå på photoconverting og tenkelig lasere (405 nm og 561 nm), som dette bidrar til å produsere mer av røde arter av mEos2. Gå deretter tilbake til 488 nm laser og ta et TIRF bilde.</li>
</ol>4. enkel-molekylet lokalisering i fast larver
<ol><li>Å måle protein nanocluster størrelsen via PALM, erstatte Schneiders insekt medium etter disseksjon med et bindemiddel - 4% paraformaldehyde fortynnet i fosfat bufret saltvann (PBS).</li>
	<li>Inkuber Larven i 30 min ved romtemperatur.</li>
	<li>Fjern dissection pins og plassere fast Larven i en 1,7 mL fjerner snapin-lås microcentrifuge tube.</li>
	<li>Analysere og løse som mange andre Larvene etter behov, deretter vaske dem tre ganger med PBS.</li>
	<li>Erstatte PBS med blokk buffer (en løsning av PBS, 0,1% Triton X-100 og 3% normal geit serum).</li>
	<li>Vask Larvene med PBS tre ganger, deretter ruge med nødvendig primære antistoffer (utvannet i blokk buffer løsning).</li>
	<li>Ruge over natten ved 4 oC.</li>
	<li>Vask Larvene tre ganger med PBS, deretter ruge med nødvendige sekundære antistoffer (utvannet i blokk buffer løsning).</li>
	<li>Vask Larvene tre ganger med PBS, knytte Larven tilbake på PDMS base, og bildet som tidligere beskrevet for single-molekylet sporing.</li>
</ol>

Forfatterne ikke avsløre.

Denne protokollen beskriver single-molekylet sporing av mEos2-merket proteiner i Drosophila tredje skikkelsen Larven nevromuskulær krysset. For å unngå over-uttrykk av transgene protein, ble Syntaxin-1A-mEos2 uttrykket drevet av endogene Syntaxin-1A arrangøren. Studier av synaptic protein mobilitet er stort sett begrenset til i vitro undersøkelser av kultivert celler og kortikale nevroner9,11,12,13. Om disse proteinene viser lignende mobilitet signaturer i levende dyr er hovedsakelig ubekjent. For å visualisere single-protein mobilitet i vivo, har begrensninger som optisk oversikt, tilgjengelighet og gjennomtrenging dyp overvinnes. Ved å dissekere larver utarbeidelse og visualisere de nevromuskulære knutepunktene på overflaten av muskelen, unngå vi spørsmålet om optisk åpenhet og tilgjengelighet. Forsøk til bildet én-molekylet mobilitet i normale TIRF konfigurasjonen virket. Men gir bruk av litt skrå belysning økt eksitasjon laser gjennomtrengende dybde. Videre minutien pinnene til nakkens Larven hjalp for å unngå ethvert mulig virkning anestesi bruk på protein mobilitet. Det er mulig å bruke høyere forstørrelse mål, for eksempel 100 x olje nedsenking mål, for å visualisere enkelt molekyler i vivo. Økt forstørrelse kan imidlertid øke forekomst av driver ute av fokus. I tillegg har vi brukt en lavere intensitet (~ 30%) 561 nm laser vellykket til bildet én molekyler på motor nerve terminaler. Ytterligere testing kan være nødvendig å bruke lavere laser makt.
Denne protokollen er egnet til å visualisere mobilitet i synaptic proteiner i nærheten av neuronal plasma membranen. Bruker denne tilnærmingen, mobiliteten av SNARE protein - Syntaxin-1A og autophagosome bundet protein Atg18a - har vært vellykket fotografert i vivo14,26. Mobilitet av proteiner på motor neuron axons kan også være undersøkt27. Men kan undersøkelse av mobilitet av proteiner i hjernen eller ventrale være vanskelig å vurdere på grunn av høye signalet produsert av underliggende vev; i tillegg visualisere protein mobilitet på samme hjernen strukturen vil kreve fluorescently merking hjernen strukturen (for å sikre replicability), og bruk av dual-kamera bildebehandling ville være nødvendig.
Gjeldende metoder tilgjengelig for super-oppløsning mikroskopi i Drosophila er stort sett begrenset til tenkelig embryoer, snarere enn mer utviklet tredje skikkelsen Larven38,39. Hovedproblemet med disse protokollene er at de gir et lavt antall baner i området fotografert, og dermed hindre dybdeanalyse mobilitet stater22,40. Våre i vivo ett molekyl sporing protokollen har kapasitet til å generere et stort antall baner, og kan derfor brukes i andre dyr modeller som Caenorhabiditis elegans og sebrafisk. Faktisk generert hver NMJ kjeden ~ 2400 baner slik at det passer for å analysere ulike mobile tilstander og overganger mellom stater14,27. I tillegg er mange i vivo ett molekyl tenkelig strategier avhengig av bruk av bedøvelse å nakkens av dyr20,22, som kan endre fysiologiske funksjon som avbilding er gjort. Her optimalisert vi en "anestesi-gratis" protokollen å nakkens Larvene bruker minutien pinner.
En potensiell bruk av denne protokollen kan være for å visualisere mobilitet av proteiner i tre dimensjoner. Nylige fremskritt innen super-oppløsning mikroskopi tillate protein mobilitet visualisert i vitro i 'x', 'y', og 'z' dimensjoner41,42. Vår nåværende metoden høyde ikke for mobilitet av proteiner i 'z' aksen. Likevel Drosophila motor nerve terminal er en sfærisk struktur og en verdifull fremtidige tilnærming vil være å kvantifisere protein mobilitet i en tredimensjonal volum43. Imaging i z-dimensjonen er mulig med en astigmatic linse. Alternativt i TIRF modus44,45, er z-oppløsningen også økt. Men i vårt forsøk, har vi brukt litt skrå belysning for å visualisere enkelt molekyler av syntaxin1A-mEos2 uten astigmatic linsen.
I konklusjonen, tilgjengeligheten av både en transgene Drosophila fly lager uttrykke proteiner merket med en photoconvertible protein, en PDMS base å dissekere transgene Larven, samt TIRF mikroskop utstyrt for å endre den vinkel på belysning er viktigste verktøy for å visualisere enkelt proteiner som beskrevet i denne protokollen.

Neuronal kommunikasjon er avhengig av nevrotransmitter utgivelse, som oppstår gjennom regulert blanding av nevrotransmitter inneholder synaptic blemmer med plasma membranen1. Denne prosessen kalles exocytosis2,3,4,5,6 kan er svært dynamisk og opp - eller ned-regulert ifølge svingninger i prisen av stimulering7. Proteiner involvert i disse prosessene kan Brownsk bevegelse, og derfor vise nanoscopic organisasjonen kan opprettholde en rekke bindende handlinger som understøtter disse fysiologiske funksjoner. Plasma membran proteiner er svært dynamisk, slik at lateral fangst av molekylene i nanoclusters plasma membranen7,8,9,10,11, 12. Slik bidrar undersøker mobilitet av disse proteinene til å belyse modusen for handling8. Synaptiske proteiner som løselig N-ethylmaleimide følsom faktor vedlegg protein receptors (snarer), for eksempel Syntaxin-1A, er nå kjent som viser lateral rask mobilitet, samt lateral overlapping i nanoclusters som kan tjene som molekylær depoter og nettsteder for vesicle, fusion,9,,13,,14,,15.
Den siste utviklingen av photoconvertible fluorescerende proteiner, som monomerisk (m) Eos16,17 og Kaede18, har tillatt nanoscopic oppløsning neuronal plasma membran proteiner ved hjelp av tilnærminger slik Foto-aktivert lokalisering mikroskopi (PALM) og Stokastisk optisk rekonstruksjon mikroskopi (STORM)14,15,19. Denne utviklingen har aktivert etterforskning mobilitet og nanoclustering av biologiske proteiner i kulturperler lever celler og neurons. Nylig har studier vært gjennomført for å belyse (på lignende høy oppløsning) dynamikk og organiseringen av disse membran proteiner i nervecellene i live intakt organismer slik Mus musculus, Caenorhabditis elegans, og Drosophila melanogaster14,20,21,22.
Undersøker dynamikk og organisering av et protein i vivo krever ikke bare bruker de nylig utviklet super-oppløsning bildebehandling verktøyene (som PALM, STORM og photoconvertible fluorophores), men også evnen til å overvinne hindringer slik som tilgjengelighet av protein og gjennomtrenging dybden av tenkelig laser. Bildebehandling intracellulær proteiner i et intakt dyr er iboende utfordrende som er bildebehandling proteiner på strukturer dypt i levende vev av intakt dyret, som hippocampus en intakt mus. Derfor er proteiner på eller nær overflaten av vev lettere fotografert. En annen vanskelighet med imaging i vivo er å sikre reproduserbarhet over dyrene. Som anatomi kan variere fra ett utvalg til den andre, kan velge en struktur med enkel replikering i forskjellige intakt dyr prøver også være utfordrende. Bruk av stereotype strukturer, som synapser, hjelpe å overvinne noen av disse vanskelighetene.
Nyere studier har fotografert protein mobilitet i dyr med en optisk gjennomsiktig overhuden som Caenorhabditis elegans22, mens andre undersøkelser har fotografert organisasjon, protein på overflaten av en vev/orgel, for eksempel utgangen imaging i kortikale nevroner gjennom skallen fra en levende mus21. I noen tilfeller har bedøvelse blitt brukt til å holde dyr immobile; Imidlertid kan bestemte bedøvelse påvirke protein av interesse. Alternative måter å holde dyr immobile under i vivo imaging bør derfor utforskes for å redusere feil.
En annen påminnelse til super-oppløsning tenkelig i vivo er at lasere brukes til å belyse proteiner rundt kan påvirke de omkringliggende vev, og dermed holde eksitasjon intensiteten så lavt som mulig anbefales. Belysning av de omkringliggende vev av laser også en tendens til å øke bakgrunnen signalet. Bruk av lav eksitasjon intensitet bidrar til å redusere bakgrunnen, innvendingen blir det kan også føre til en nedgang i fluorescerende protein Foton avkastning. Bakgrunn subtraksjon under analyse kan brukes som et alternativ betyr å redusere bakgrunnen signalet før bildeanalyser.
Drosophila presenterer en ideell organisme for i vivo tenkelig som gir veletablerte genetisk verktøy for etterforskningen av bestemt protein-funksjonen. Oppstrøms aktivering sekvensen (UAS)-Gal4 gir timelige og romlig uttrykk av proteiner og kan derfor brukes til å manipulere neurotransmission23, slik at thermo-genetiske stimulering bruke Drosophila forbigående reseptor potensielle sub familie A1 (dTRPA1)24 eller opto-genetiske stimulering bruke far-red-skiftet CsChrimson25 kan kombineres med bildebehandling14. Vi har overvunnet mange av komplikasjoner til å utføre i vivo single-molekylet bildebehandling i dette systemet og nå beskrive hvordan single-partikkel sporing kan utføres i Drosophila melanogaster tredje skikkelsen larver.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="682">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:267px;">PDMS (Sylgard 184 silicone elastomer kit)</td>
			<td style="width:163px;">Dow Corning Corporation</td>
			<td colspan="2" style="width:253px;">000000000001064291</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Glass-bottomed Culture Dish</td>
			<td>In Vitro Scientific</td>
			<td>D29-20-1.5-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Optical Stereo-microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZ51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Curved Tweezers (Style 5/45)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>0208-5AC-PO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Minutien Pins (0.1mm)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26002-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Schneider&#39;s Insect Medium</td>
			<td>Sigma, Life Sciences</td>
			<td>S0146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Vannas Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Fine Forceps (Dumont #5)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">ELYRA PS.1 Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>PS.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-515Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Paraformaldehyde (16%)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T-9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Normal Goat Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Maxyclear snaplock microcentrifuge Tube (1.7 mL)</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-175-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Zen Black acquisition software</td>
			<td>Carl Zeiss, 2012</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:267px;">Metamorph software</td>
			<td style="width:163px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:87px;">7.7.8</td>
			<td>PALM Tracer Plugin</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Fly strain</td>
			<td></td>
			<td colspan="2">w1118; HA-Sx1A-mEos2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo single-molecule tracking at the drosophila presynaptic motor nerve terminal

Et økende antall super-oppløsning mikroskopi teknikker hjelper for å avdekke mekanismene som styrer nanoskala mobilnettet verden. Single-molekylet imaging frammarsj som det gir eksepsjonell tilgang til visualisering av molekyler i levende celler. Her beskriver vi en teknikk som vi utviklet for å utføre single-partikkel sporing Foto-aktivert lokalisering mikroskopi (sptPALM) i Drosophila larver. Synaptiske kommunikasjon er avhengig av nøkkel presynaptic proteiner som fungerer docking, grunning og fremme blanding av nevrotransmitter inneholder blemmer med plasma membranen. En rekke protein-protein og protein-lipid interaksjoner regulerer tett disse prosessene og presynaptic proteiner derfor utstilling endringer i mobilitet tilknyttet hver av disse viktige hendelser. Undersøker hvordan mobilitet av disse proteinene korrelerer med fysiologiske funksjoner i en intakt levende dyr er nødvendig for å forstå deres nøyaktige virkningsmekanismen. Utdrager protein mobilitet med høy oppløsning i vivo krever overvinne begrensninger som optisk oversikt, tilgjengelighet og gjennomtrenging dyp. Beskriver vi hvordan photoconvertible fluorescerende proteiner merket med presynaptic protein Syntaxin-1A kan visualisere via liten skrå belysning og spores på motor nerve terminal eller langs motoriske nervecellen axon av tredje skikkelsen Drosophila larve.

Ved hjelp av protokollen som er beskrevet ovenfor, Syntaxin-1A-mEos2 transgene Drosophilamelanogaster ble generert (figur 1). Transgene tredje skikkelsen Drosophila Larvene ble dissekert på PDMS sylindriske basen (figur 2A-F). For å visualisere enkelt molekyler av Syntaxin-1A, brukte vi PALM på TIRF mikroskop med litt skrå laser belysning14.
Enkelt molekyler av Syntaxin-1A ble sporet på presynaptic motor nerve terminalene på muskel 6 av andre abdominal segmentet. Den grønne fluorescensen av mEos2 kan registreres som vist ved lav oppløsning bildet av Syntaxin-1A-mEos2 på type 1b boutons når opphisset bruker 488 nm laser (figur 3A). I tenkelig eksperimentene, 405 nm og 561 nm eksitasjon laser tenkelig dypet var 133.5 nm og 165.6 nm, henholdsvis. Grønne bildet ble kjøpt som et gjennomsnitt av 16 enkeltbilder. Dette grønne bildet ble brukt til å opprette regionen rundt brukes til å begrense analyse av steder i photoconverted filmen til presynaptic motor nerve terminalene alene.
Analyse av ervervet photoconverted sptPALM filmer generert en super løst intensitet, diffusjon koeffisienten, og banen kart (figur 3A). Syntaxin-1A-mEos2 mobilitet ble ytterligere kvantifisert ved analyse av betyr kvadratisk forskyvning (MSD) av personlige baner (figur 3B). Statistiske sammenligninger kan gjøres ved hjelp av området under MSD kurven (figur 3B). Videre analyse av mobilitet gir diffusjon koeffisienten distribusjon av Syntaxin-1A-mEos2, og dette statistisk kan evalueres ved sammenligning av mobile til immobile befolkningen (Figur 3 c).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56952/56952fig1.jpg"> Figur 1 : Generere mEos2-merket konstruksjoner. PFL44S-attB-MCS-w + vektor er linearized med BamHI og XbaI. Overlappende polymerasekjedereaksjons (PCR) fragmenter koding protein av interesse (POI) og mEos2, henholdsvis kan bli klonet, for eksempel i vivo rekombinasjon i ura3 - gjærceller eller Gibson montering. Merk at for å generere Syntaxin-1A-mEos2 transgene, vi klonet Konstruer flankert av endogene Syntaxin-1A arrangøren og terminator sekvenser. Den resulterende konstruere kan senere injiseres i Drosophila embryo opprette en transgene flua linjen uttrykke protein av interesse (POI) del mEos2. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56952/56952fig1large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56952/56952fig2.jpg"> Figur 2 : Drosophila Larven disseksjon og skrå belysning. (A) skjema viser Drosophila Larven disseksjon på halv-sylindrisk PDMS base. En filetert Larven ble holdt på PDMS gel ved bruk av minutien pinner. (ABC) Larven-PDMS prep ble plassert i et glass bunn kultur parabol med Schneiders insekt medium. TIRF mikroskop i en litt skrå belysning konfigurasjon ble brukt til å visualisere Syntaxin-1A-mEos2 i motor nerve terminaler. (D-F) En halv-sylindrisk PDMS base med dissekert Drosophila larve. Larven-PDMS forberedelsene ble plassert i en tenkelig rett fylt med Schneider's medium, og Larven ble avbildet på super-oppløsning PALM mikroskopet. Skala bar, 10 mm. (dette tallet har blitt endret fra14). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56952/56952fig2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56952/56952fig3.jpg"> Figur 3 : I vivo sporing av Syntaxin-1A-mEos2 på presynaptic motor nerve terminal. (A) A lav TIRF bilde av Syntaxin-1A-mEos2 på en type 1b motor nerve terminal. Analyse av photoconversion filmer fotografert på 33 Hz generert sptPALM super løst intensitet, diffusjon koeffisient og bane kart. 5,309 personlige baner ble fotografert over 16.000 rammer film oppkjøpet. Skala bar, 3 μm. (ABC) Mean square forskyvning (MSD) av Syntaxin-1A-mEos2 ble tegnet fra 6 forskjellige motor nerve terminaler; området under MSD kurven (AUC) ble brukt om å kvantifisere nivået av mobilitet. Diffusjon koeffisienten fordelingen avslører mobil og immobile Syntaxin-1A populasjoner som kan kvantifiseres som prosenter av hverandre; gjennomsnittlig ~ 2400 baner ble oppnådd per motor nerve terminal (n = 3 Larvene). Data som mener standardfeil betyr. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56952/56952fig3large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal at JoVE.com

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

I Vivo Single-molekylet sporing på Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

Her vi illustrere hvordan ett molekyl Foto-aktivert lokalisering mikroskopi kan utføres på motor nerve terminalen til en live Drosophila melanogaster tredje skikkelsen larve.

An increasing number of super-resolution microscopy techniques are helping to uncover the mechanisms that govern the nanoscale cellular world. ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

Elucidating the mechanisms of axonal transport has shown to be very important in determining how defects in long distance transport affect different ...

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Patch-clamp Kapasitans Målinger og Ca 2 + Imaging ved Singel nerveterminaler i Retinal Slices

Visual stimuli are detected and conveyed over a wide dynamic range of light intensities and frequency changes by specialized neurons in the vertebrate ...

Acute Dissociation of Lamprey Reticulospinal Axons to Enable Recording from the Release Face Membrane of Individual Functional Presynaptic Terminals

Akutt dissosiasjon av niøye Reticulospinal Axoner å Aktiver Opptak fra Release Face Membran av enkelte funksjons presynaptiske terminaler

Synaptic transmission is an extremely rapid process. Action potential driven influx of Ca2+&#160;into the presynaptic terminal, through voltage-gated ...

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Hvorfor Kvantifisering Matters: Karakterisering av fenotyper på<em&gt; Drosophila</em&gt; Larve Nevromuskulær Junction

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic ...

Optical Monitoring of Living Nerve Terminal Labeling in Hair Follicle Lanceolate Endings of the Ex Vivo Mouse Ear Skin

Optical Monitoring of Living Nerve Terminal Labeling in Hair Follicle Lanceolate Endings of the Ex Vivo Mouse Ear Skin

Optisk overvåkingen av levende Nerve Terminal Merking i hårsekken lansettformede Endings av<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Mouse Ear Skin

A novel dissection and recording technique is described for optical monitoring staining and de-staining of lanceolate terminals surrounding hair follicles ...

Olfactory Behaviors Assayed by Computer Tracking Of Drosophila in a Four-quadrant Olfactometer

Olfactory Behaviors Assayed by Computer Tracking Of Drosophila in a Four-quadrant Olfactometer

Olfactory Behaviors analysert av Computer sporing av<em&gt; Drosophila</em&gt; I en fire-kvadranten olfactometer

A key challenge in neurobiology is to understand how neural circuits function to guide appropriate animal behaviors. Drosophila melanogaster is an ...

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

In vivo genoverføring til Schwann celler i gnagere isjiasnerven ved Electroporation

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

En enkel ett-trinns Dissection Protokoll for Whole-mount Utarbeidelse av Adult<em&gt; Drosophila</em&gt; Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

Visualisering av Axonal Projeksjonsmønsteret av Embryoniske Motor Neuroner i<em&gt; Drosophila</em

The establishment of functional neuromuscular circuits relies on precise connections between developing motor axons and target muscles. Motor neurons ...

3D Kinematic Analysis for the Functional Evaluation in the Rat Model of Sciatic Nerve Crush Injury

3D kinematisk analyse for funksjonell evaluering i rottemodellen av siattisk nerveknuseskade

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of ...