Name: in vivo single-molecule tracking at the drosophila presynaptic motor nerve terminal
Uploaded: 2018-01-14T14:00:00
Duration: 6 min 45 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal at JoVE.com

Vi tackar Jean-Baptiste Sibarita och Daniel Choquet (IINS, CNRS/University of Bordeaux) för deras vänliga stöd med singel-molekyl analysen. Vi tackar särskilt Nick Valmas och Jessica Mcgaw (QBI, University of Queensland) för deras hjälp med video inspelning, voice-over samt figur grafisk design. Detta arbete stöds av projektet australiensisk forskning rådet (AR) upptäckt (DP170100125 till Forsberg.), australiska forskningsrådet (LIEF Grant LE0882864 till Forsberg.), framtiden Fellowship (FT100100725 till B.V.S.), australiska forskningsrådet (LIEF Grant LE130100078 till Forsberg.) och NHMRC projektanslag (APP1103923 till B.V.S.). Forsberg är en NHMRC Senior Research Fellow (ONT1060075).

1. utformningen av transgena Drosophila uttrycker mEos2-märkta proteiner
<ol><li>Välj proteinet att taggas med mEos2 protein. För att öka tänkbar framgång, Välj proteiner med en transmembrana domän i nervcellernas plasmamembran14 (t.ex., Syntaxin-1A), proteiner på synaptic blåsor eller autophagosomes26,27 (t.ex. Synaptobrevin-2), eller cytosoliska proteiner med nära samverkan med nervcellernas plasmamembran proteiner (t.ex., Munc18-1).</li>
	<li>Konstruera transgener kodning mEos2-märkta proteinet (figur 1). Design framåt och bakåt primers för protein och mEos2. Obs: MEos2 kodning sekvensen kan amplifieras från pmEos2-N1 plasmiden, som syftar till att säkring till C-terminus av proteinet av intresse. Kloning kan till exempel utföras av i vivo rekombination i Saccharomyces cerevisiae med hjälp av pFL44S-attB-MCS-w + vektor14,28, alternativt andra kloning metoder skulle kunna användas såsom Gibson montering protokoll29.<ol>
<li>Linjär vektorn med BamHI och XbaI och samtidigt omvandla till ura3 - jästceller tillsammans med PCR-fragmenten kodning mEos2 och proteinet av intresse. Injicera Drosophila embryon med konstruktionen att generera en transgena linan30.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bak de transgena flyga kulturerna på vanlig jäst och melass medium eller några andra lämpliga substitut i plast flaskor. För att säkerställa sund och ganska stor synaptic knappar31, undvika överfulla flugor i injektionsflaskorna och vänd flugor till nya flaskor efter varje dag för äggläggningen; Detta säkerställer tredje instar larverna är välgödd och nå rätt storlek när de börjar vandra på medium. Höja den transgena flugan i rumstemperatur (25 ° C). Obs: Större synaptisk knappar tenderar att ge större mängd proteiner visualiseras under imaging.</li>
</ol>2. dissekering av tredje Instar larv
<ol><li>Göra en cylindrisk eller semicylindrical formade Polydimetylsiloxan (PDMS) bas ≤20 mm i diameter och ≤20 mm i höjd med hjälp av en lämplig silikon elastomer kit (figur 2A). Blanda silikonelastomer med en silikon härdning agent i förhållandet 10:1.<ol>
<li>Rör blandningen grundligt i 5 min. Häll i blandningen i en form med dimsensions som anges ovan. Låt det härda i en ugn vid 100 ° C i 45 min. PDMS basen kommer att tjäna som grund att utföra dissektion. Säkerställa PDMS basen passar in väl av en glasbotten kultur maträtt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Välj en vandrande tredje instar larv från injektionsflaskan väggen. Använd en optisk stereo-Mikroskop vid 4,5 förstoring för att visualisera larven placeras på PDMS cylindriska basen med ryggsidan upp.</li>
	<li>Använda böjda och vinklad pincett att sticka minutien pins på huvudet över munnen krokar, mellan de två utvidga främre externa, och på svansen över anus, mellan de två bakre trakeer. Tillsätt 40 µL av Schneiders insekt medium vid rumstemperatur till immobiliserade larven. Obs: Hemolyph-liknande lösningar (HL3 eller HL6) kan också användas i stället för Schneiders lösning32,33.</li>
	<li>Tillhandahåll åtkomst via den dorsala sidan av kroppen bukväggen för larven genom användning av en minutien fäst på incisionsfilm i mittlinjen på väggen.</li>
	<li>Användning våren sax att klippa kroppen väggen öppna ur snittet. Skär längs mittlinjen i de anterior-posterior riktning34.</li>
	<li>Använd fina pincett och våren sax till disembowel larven: ta bort de inre organen inklusive spottkörtlar, luftstrupen och tarmen. Tvätta larven två gånger med Schneiders insekt medium.</li>
	<li>Med fin pincett, håll två kroppen väggen viftar försiktigt sträcka ut dem och hålla två minutien stift på varje sida. Detta bör ge en hexagon-formade beredning (figur 2A).</li>
	<li>Koppla bort hjärnan från den ventrala nerv sladd använder våren sax för att minska risken för muskelrörelser under imaging; Detta tjänar också till att hålla preparatet platt mot imaging skålen. Använda böjda pincetten för att driva alla sex minutien stift till PDMS bas. Obs: Endast en liten del av stiften bör vara inbäddat i bukväggen.</li>
	<li>Att bekräfta att larven har överlevt förfarandet dissektion, något peta den ventrala nerv sladden, bör detta framkalla en peristaltiska sammandragning av larvaen bukväggen.</li>
</ol>3. något sned belysning singel-Particle Tracking mikroskopi
<ol><li>Invertera dissekerade larv-PDMS fast basen på en glasbotten kultur maträtt. Fyll imaging skålen med 2 mL av rumstemperatur Schneiders insekt medium (figur 2B).</li>
	<li>Leta upp motoriska nervceller i de andra och tredje segment med synapser på magmusklerna 6 och 735 använder 63 x / 1,2 NA nedsänkning i vatten mål på en fluorescerande totalreflexion fluorescens (Frida) Mikroskop.</li>
	<li>Använd okularen mikroskopets för att lokalisera dissekerade larv; identifiera muskel 6 genom användning av ljusa fält belysning.</li>
	<li>Använda programvaran Mikroskop förvärvet (se Tabell för material), i Frida konfiguration; Skjut kollimator kameravinkeln till 1° att öka genomträngningsdjupet, annars flytta ur Frida kritiska vinkeln att uppnå sned belysning.</li>
	<li>Slå 488 nm laser på att visualisera mEos2 i grönt. Använd en låg lasereffekt (mindre än 5% av 22,8 mW) att undvika blekning i grön fluorescens. Leta upp de neuromuskulära korsningar (som ser ut som pärlor på ett snöre) och skaffa sig en bild med låg upplösning i Frida.</li>
	<li>Samtidigt växla på 405 nm laser (photoconverts mEos2 från grön till röd arter) och 561 nm laser (bild den photoconverted röda mEos2) för att lokalisera stochastically enda mEos2 fluorescerande proteiner. Obs: Rekommenderas användning av 405 nm laser strömsnål (0,005 till 0,9% av 4.78 mW) som detta möjliggör en relativt konstant photoconversion takt under filmen förvärvet. Användning mellan 50 och 75% av 561 nm laser (20,1 mW), som är tillräckligt för att förvärva fluorescens från röda mEos2 arter utan att negativt påverka morfologi av muskelvävnaden som omger den neuromuskulära förbindelsen.</li>
	<li>För varje neuromuskulära förbindelsen kedja, förvärva en tid serien består av 15.000 ramar eller mer på 33 Hz. Spara as.czi format för att bevara den medföljande meta-data för möjlig referens.</li>
	<li>Använd ImageJ konvertera filmfiler '.czi' till '.tiff' filer.</li>
	<li>Analysera de förvärvade filmerna med lämplig singel-molekyl spårning analytisk programvara11,14,36 såsom TrackMate på FIJI/ImageJ37 (se Tabell för material). Lokaliserar den 'x' och 'y' koordinaterna för varje lokalisering av Gaussisk passformen av intensitet punkt sprida funktion (PSF). Obs: Felsökning: om grön fluorescens observeras inte eller är för mörk vid den neuromuskulära förbindelsen vid exponering för 488 nm laser, kort slå på photoconverting och imaging lasrar (405 nm och 561 nm), eftersom detta hjälper till att producera mer av röda arter av mEos2. Växla tillbaka till 488 nm laser och ta en Frida bild.</li>
</ol>4. singel-molekyl lokalisering i fasta larver
<ol><li>För att mäta storleken protein nanocluster via PALM, ersätta den Schneiders insekt medium efter dissektion med ett fixativ - 4% PARAFORMALDEHYD utspätt i fosfatbuffrad saltlösning (PBS).</li>
	<li>Inkubera larven i 30 min i rumstemperatur.</li>
	<li>Ta bort dissektion stift och placera fast larven i en 1,7 mL klar snap-lock mikrocentrifug rör.</li>
	<li>Dissekera och fixa som många andra larver som behövs, sedan tvätta dem tre gånger med PBS.</li>
	<li>Ersätta PBS med block buffert (en lösning av PBS, 0.1% Triton x-100 och 3% normala get serum).</li>
	<li>Tvätta larverna med PBS tre gånger, sedan Inkubera med den nödvändiga primär antikropp (utspädd i block buffertlösningen).</li>
	<li>Inkubera över natten vid 4 oC.</li>
	<li>Tvätta larvaena tre gånger med PBS, sedan Inkubera med den nödvändiga sekundär antikropp (utspädd i block buffertlösningen).</li>
	<li>Tvätta tre gånger med PBS larverna, bifoga larven rygg onto PDMS basen, och bilden som tidigare beskrivits för singel-molekyl spårning.</li>
</ol>

Författarna har något att avslöja.

Det här protokollet beskriver singel-molekyl spårning av mEos2-märkta proteiner vid den neuromuskulära förbindelsen för Drosophila tredje instar larven. För att undvika alltför uttryck av transgena proteinet, drevs Syntaxin-1A-mEos2 uttryck av endogena Syntaxin-1A arrangören. Studier av synaptic protein rörlighet har mestadels begränsats till in vitro- undersökningar av odlade celler och kortikala nervceller9,11,12,13. Huruvida dessa proteiner uppvisar liknande rörlighet signaturer i ett levande djur är till stor del okända. För att visualisera single-protein rörlighet i vivo, har begränsningar såsom optiskt djup på öppenhet, tillgänglighet och penetration att övervinna. Genom att dissekera larval beredning och visualisera de neuromuskulära korsningar inbäddade på ytan av muskeln, undvika vi frågan om optisk transparens och tillgänglighet. Försök att bild singel-molekyl rörlighet i normal Frida konfiguration visat sig framgångsrik. Dock tillåter användning av något sned belysning för ökad excitation laser tränger djup. Dessutom minutien stiften används för att immobilisera larven bidragit till att undvika möjliga negativa effekter av bedövningsmedel användning på protein rörlighet. Det är möjligt att använda högre förstoringsgrad, såsom 100 x olja nedsänkning mål, för att visualisera enstaka molekyler i vivo. Men kan ökad förstoring öka förekomsten av drivorna ur fokus. Dessutom har vi använt en lägre intensitet (~ 30%) 561 nm laser lyckat att bilden enstaka molekyler vid motor nerv terminaler. Ytterligare tester krävas att använda lägre lasereffekt.
Detta protokoll är lämplig att visualisera rörlighet synaptic proteiner inom närheten av neuronala plasmamembranet. Använder denna metod, rörlighet av proteinet SNARA - Syntaxin-1A och autophagosome bunden protein Atg18a - har varit framgångsrikt avbildad i vivo14,26. Rörlighet för proteiner på motorneuronen axoner kan också vara undersökt27. Utredning av proteiner i hjärnan eller ventrala nerv sladd rörlighet kan emellertid visa sig svårt att bedöma på grund av den höga bakgrund signal produceras av underliggande vävnad; Dessutom visualisera protein rörlighet på samma hjärnstruktur kommer att kräva fluorescently taggning hjärnans struktur (för att säkerställa replikerbarhet), och användningen av dual-kamera imaging skulle behövas.
Nuvarande metoder tillgängliga för super-resolution mikroskopi i Drosophila är mestadels begränsad till imaging embryon, snarare än mer utvecklade tredje instar larv38,39. Den viktigaste frågan med dessa protokoll är att de ger ett lågt antal banor i området avbildas, och därmed förhindra fördjupad analys av rörlighet har22,40. Vår i vivo enda molekyl spårning protokoll har kapacitet att generera ett stort antal banor, och kan därför användas i andra djurmodeller som Caenorhabiditis elegans och zebrafisk. Faktiskt genereras varje NMJ kedja ~ 2400 banor vilket gör den lämplig för att analysera de olika mobila staterna och övergångar mellan dessa stater14,27. Dessutom beroende många i vivo enda molekyl imaging strategier av användning av bedövningsmedel att immobilisera djur20,22, som kan påverka fysiologiska funktionen som bildtagning sker. Här optimerat vi en 'anestesi-fri' protokoll för att immobilisera larverna med minutien stift.
En möjlig användning av detta protokoll kan vara för att visualisera rörlighet av proteiner i tre dimensioner. Senaste framstegen inom super-resolution mikroskopi tillåta protein rörlighet vara visualiserade i vitro i 'x', 'y', och 'z' mått41,42. Vår nuvarande metoden tar inte hänsyn till rörligheten för proteiner i 'z'-axeln. Ännu Drosophila motoriska nerven terminal är en sfärisk struktur och en värdefull framtida strategi kommer att vara att kvantifiera protein rörlighet i en tredimensionell volym43. Bildbehandling i z-dimensionen är genomförbart använder en astigmatisk lins. Alternativt i Frida läge44,45ökas z-upplösningen också. Men i våra experiment, har vi använt något sned belysning för att visualisera enstaka molekyler av syntaxin1A-mEos2 utan astigmatisk objektivet.
Sammanfattningsvis, tillgänglighet i båda transgena Drosophila flyga lager uttrycker proteiner märkta med ett photoconvertible protein, en PDMS bas att dissekera transgena larven, samt Frida Mikroskop utrustat med möjligheten att ändra den vinkeln på belysningen är de viktigaste verktygen som behövs för att visualisera inre proteiner som beskrivs i detta protokoll.

Neuronal kommunikation är beroende av neurotransmitterfrigöraren, som uppstår genom reglerade fusion av signalsubstansen-innehållande synaptiska vesikler med plasmamembranet1. Denna process kallas exocytos2,3,4,5,6 är mycket dynamisk och kan upp - eller ner-reglerade enligt variationer i graden av stimulering7. Proteinerna som är inblandade i dessa processer är föremål för Brownsk rörelse, och därför visar halvledarkomponent organisation kan upprätthålla en rad bindande åtgärder som stärker dessa fysiologiska funktioner. Plasmamembranet proteiner är mycket dynamisk, vilket gör att laterala svällning av molekyler i nanoclusters på plasmamembranet7,8,9,10,11, 12. Som sådan, undersöker rörlighet av dessa proteiner bidrar till att belysa deras verkningssätt åtgärd8. Synaptic proteiner såsom de lösliga N-ethylmaleimide känslig faktor fastsättning protein receptorerna (snaror), till exempel Syntaxin-1A, är nu känt att uppvisar laterala snabb rörlighet samt laterala svällning inom nanoclusters som kan fungera som molekylära depåer och platser för vesikler fusion9,13,14,15.
Den senaste utvecklingen av photoconvertible fluorescerande proteiner, såsom monomer (m) Eos16,17 och Kaede18, har tillåtit halvledarkomponent resolutionen av nervcellernas plasmamembran proteiner med hjälp av metoder sådana som foto-aktiverat lokalisering mikroskopi (PALM) och stokastiska optiska återuppbyggnad mikroskopi (STORM)14,15,19. Denna utveckling har aktiverat utredningar av rörlighet och nanoclustering av biologiska proteiner i odlade levande celler och nervceller. Mer nyligen, studier har genomförts för att belysa (vid liknande höga upplösningar) dynamik och organisationen av dessa membranproteiner i nervceller i levande intakt organismer sådan Mus musculus, Caenorhabditis elegans, och Drosophila melanogaster14,20,21,22.
Undersöker dynamics och organisationen av ett protein i vivo kräver inte bara använda de nyutvecklade super-upplösning imaging verktyg (såsom PALM, STORM och photoconvertible fluorophores), men också förmågan att övervinna hinder sådan som hjälpmedel av proteinet och genomträngningsdjupet av imaging lasern. Imaging intracellulära proteiner hos intakta djur är till sin natur utmanande som imaging proteiner på strukturer inbäddad djupt i levande vävnader av intakta djur, såsom hippocampus av en intakt mus. Proteiner på eller nära ytan av vävnaden är därför lättare avbildas. En annan svårighet med imaging i vivo är att säkerställa reproducerbarhet över djuren. Som anatomi skiljer sig från ett prov till den andra, att välja en struktur med lätthet av replikering i olika intakta djur prover skulle också kunna vara utmanande. Användning av stereotypa strukturer, såsom synapser, hjälpa till med att övervinna några av dessa svårigheter.
Nyligen genomförda studier har avbildats protein rörlighet hos djur med en optiskt transparent epidermis såsom Caenorhabditis elegans22, medan andra undersökningar har avbildats protein organisation på ytan av en vävnad/organ, till exempel aktin imaging i kortikala nervceller genom skallen av en levande mus21. I vissa fall har anestetika använts för att hålla djuret orörliga; specifika bedövningsmedel kan dock inverka proteinet av intresse. Alternativa metoder för att hålla djur orörliga under i vivo imaging bör därför undersökas för att minimera fel.
En annan varning till super-upplösning imaging i vivo är att lasrar används för att belysa proteinerna av intresse negativt kan påverka den omgivande vävnaden, och därmed hålla excitation intensiteten så låg som möjligt rekommenderas. Belysning i den omgivande vävnaden av lasern tenderar också att öka bakgrunden signalen. Användning av låg excitation intensitet hjälper till att reducera bakgrunden, förbehållet att det också kan leda till en minskning av fluorescerande protein photon avkastning. Bakgrunden subtraktion under analysen kan användas som ett alternativ innebär att minska bakgrunden signalen före bildanalys.
Drosophila presenterar en idealisk organism för i vivo imaging eftersom det ger väl etablerade genetiska verktyg för utredning av specifika proteinfunktion. Uppströms aktiverande sekvensen (UAS)-Gal4 systemet medger tidsmässiga och rumsliga uttryck av proteiner och kan därför användas för att manipulera neurotransmission23, sådan att thermo-genetiska stimulering använda Drosophila övergående receptorn potentiella undergrupp A1 (dTRPA1)24 eller opto-genetiska stimulering använder far-red-skiftade CsChrimson25 kan kombineras med imaging14. Vi har övervunnit många av komplikationerna av utför i vivo singel-molekyl imaging i detta system och nu beskriva hur singel-particle tracking kan utföras i Drosophila melanogaster tredje instar larver.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="682">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:267px;">PDMS (Sylgard 184 silicone elastomer kit)</td>
			<td style="width:163px;">Dow Corning Corporation</td>
			<td colspan="2" style="width:253px;">000000000001064291</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Glass-bottomed Culture Dish</td>
			<td>In Vitro Scientific</td>
			<td>D29-20-1.5-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Optical Stereo-microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZ51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Curved Tweezers (Style 5/45)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>0208-5AC-PO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Minutien Pins (0.1mm)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26002-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Schneider&#39;s Insect Medium</td>
			<td>Sigma, Life Sciences</td>
			<td>S0146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Vannas Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Fine Forceps (Dumont #5)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">ELYRA PS.1 Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>PS.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-515Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Paraformaldehyde (16%)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T-9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Normal Goat Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Maxyclear snaplock microcentrifuge Tube (1.7 mL)</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-175-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Zen Black acquisition software</td>
			<td>Carl Zeiss, 2012</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:267px;">Metamorph software</td>
			<td style="width:163px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:87px;">7.7.8</td>
			<td>PALM Tracer Plugin</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Fly strain</td>
			<td></td>
			<td colspan="2">w1118; HA-Sx1A-mEos2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo single-molecule tracking at the drosophila presynaptic motor nerve terminal

Ett ökande antal super-resolution mikroskopi tekniker hjälper till att avslöja de mekanismer som reglerar nanoskala cellulära världen. Singel-molekyl imaging är fart eftersom det ger enastående tillgång till visualisering av enskilda molekyler i levande celler. Här, beskriver vi en teknik som vi utvecklat för att utföra enkel-particle tracking foto-aktiverat lokalisering mikroskopi (sptPALM) i Drosophila larver. Synaptiska kommunikation bygger på viktiga presynaptiska proteiner som agerar genom dockning, grundning och främja fusion av signalsubstansen-innehållande vesikler med plasmamembranet. En rad interaktioner mellan protein-protein och protein-lipid reglerar tätt dessa processer och de presynaptiska proteinerna därför uppvisar förändringar i rörlighet är associerad med var och en av dessa viktiga händelser. Undersöka hur rörligheten av dessa proteiner korrelerar med deras fysiologiska funktion i ett intakt levande djur är nödvändig för att förstå deras exakta verkningsmekanism. Utvinna protein rörlighet med hög upplösning i vivo kräver att övervinna begränsningar såsom optisk transparens, tillgänglighet och genomträngningsdjupet. Vi beskriver hur photoconvertible fluorescerande proteiner taggade till presynaptiska proteinet Syntaxin-1A kan visualiseras via liten sned belysning och spåras vid terminalen motor nerv eller längs motorneuronen axon tredje instar Drosophila larv.

Med hjälp av protokollet listade ovan, Syntaxin-1A-mEos2 transgena Drosophilamelanogaster var genereras (figur 1). Transgena tredje instar Drosophila larver var dissekeras på PDMS cylindriska basen (figur 2A-F). För att visualisera enstaka molekyler av Syntaxin-1A, använde vi PALM på Frida Mikroskop med något sned laser belysning14.
Enstaka molekyler av Syntaxin-1A spårades på presynaptiska motor nerv terminalerna på muskeln 6 av andra abdominal-segmentet. Den gröna fluorescensen av mEos2 kunde upptäckas som framgår av den lågupplösta bilden av Syntaxin-1A-mEos2 på typ 1b knappar när glada använder 488 nm laser (figur 3A). I imaging experiment, 405 nm och 561 nm excitation laser imaging djupet var 133,5 nm och 165,6 nm, respektive. Den gröna bilden förvärvades som ett genomsnitt av 16 enskilda bildrutor. Denna gröna bild användes för att skapa regionen av intresse som används för att begränsa analys av lokaliseringar i photoconverted filmen till presynaptiska motor nerv terminaler ensam.
Analysen av de förvärvade photoconverted sptPALM filmerna genereras en super löst intensitet, diffusion koefficient, och bollbana kartor (figur 3A). Syntaxin-1A-mEos2 rörlighet kvantifierades ytterligare analys av de enskilda banor (figur 3B) mean square deplacement (MSD). Statistiska jämförelser kan göras med hjälp av området under MSD-kurvan (figur 3B). Ytterligare analys av rörlighet ger diffusion koefficient fördelningen av Syntaxin-1A-mEos2, och detta statistiskt kan utvärderas genom jämförelse av mobila orörliga befolkningar (figur 3 c).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56952/56952fig1.jpg"> Figur 1 : Generera mEos2-märkta konstruktioner. PFL44S-attB-MCS-w + vektor är linearized med BamHI och XbaI. Överlappande polymeras-kedjereaktion (PCR) fragment kodning proteinet av intresse (POI) och mEos2, respektive kan klonas, exempelvis genom in-vivo rekombination i ura3 - jästceller eller Gibson församling. Observera att vi för att generera den Syntaxin-1A-mEos2 transgenens, klonade den bygga flankerad av de endogena Syntaxin-1A promotorn och terminatorsekvenser. Den resulterande konstruktionen kan därefter injiceras i Drosophila embryon för att skapa en transgena linan uttrycker proteinet av POI (INTRESSEPUNKT) smält till mEos2. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56952/56952fig1large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56952/56952fig2.jpg"> Figur 2 : Drosophila larv dissektion och sned belysning. (A) schemat visar Drosophila larv dissektion utförs på halv-cylindrisk PDMS base. En filead larv hölls på PDMS gel genom användning av minutien stift. (B-C) Larv-PDMS prep placerades inuti en glasbotten kultur maträtt som innehåller Schneiders insekt medium. Frida Mikroskop i en något sned belysning konfiguration användes för att visualisera Syntaxin-1A-mEos2 i motor nerv terminalerna. (D-F) En halv-cylindrisk PDMS bas med dissekerade Drosophila larv. Larv-PDMS preparatet placerades i en tänkbar skål fylld med Schneiders medium, och larven fotograferades på super-resolution PALM mikroskopet. Skalstapeln, 10 mm. (denna siffra har ändrats från14). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56952/56952fig2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56952/56952fig3.jpg"> Figur 3 : In vivo spårning av Syntaxin-1A-mEos2 på den presynaptiska nervändsluten på motor. (A) A lågupplöst Frida bild av Syntaxin-1A-mEos2 på en typ 1b motor nerv terminal. Analys av photoconversion filmer avbildas på 33 Hz genereras sptPALM Super löst intensitet, diffusion koefficient och bollbana kartor. 5,309 enskilda banor var avbildad över 16.000 ramar film förvärv. Skalstapeln, 3 μm. (B-C) Mean square förskjutning (MSD) av Syntaxin-1A-mEos2 var ritas från 6 olika motor nerv terminaler; under MSD kurvan (AUC) användes för att kvantifiera nivån av rörlighet. Diffusion koefficient fördelningen avslöjar mobila och orörliga Syntaxin-1A populationer som kan kvantifieras som nyckeltal av varandra; ett genomsnitt på ~ 2400 banor erhölls per motor nerv terminal (n = 3 larver). Data presenteras som standard medelfel av medelvärdet. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56952/56952fig3large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal at JoVE.com

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

In Vivo Singel-molekyl spårning i Drosophila presynaptiska Motor nerv terminalen

Här vi illustrera hur enda molekyl foto-aktiverat lokalisering mikroskopi kan utföras på den motor nerv terminalen av en levande Drosophila melanogaster tredje instar larv.

An increasing number of super-resolution microscopy techniques are helping to uncover the mechanisms that govern the nanoscale cellular world. ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

In vivo Visualisering av Synaptic Blåsor Inom Drosophila Larvernas segment Axoner

Elucidating the mechanisms of axonal transport has shown to be very important in determining how defects in long distance transport affect different ...

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Patch-clamp Mått kapacitans och Ca 2 + Imaging vid enstaka nervterminaler i näthinnan Slices

Visual stimuli are detected and conveyed over a wide dynamic range of light intensities and frequency changes by specialized neurons in the vertebrate ...

Acute Dissociation of Lamprey Reticulospinal Axons to Enable Recording from the Release Face Membrane of Individual Functional Presynaptic Terminals

Akut Dissociation av Lamprey Reticulospinal Axoner att Aktivera Inspelning från Release Face Membran av individuella funktionella Presynaptiska Terminals

Synaptic transmission is an extremely rapid process. Action potential driven influx of Ca2+&#160;into the presynaptic terminal, through voltage-gated ...

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Varför kvantifiering Matters: karakterisering av fenotyper vid<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvernas Neuromuskulära förbindelsen

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic ...

Optical Monitoring of Living Nerve Terminal Labeling in Hair Follicle Lanceolate Endings of the Ex Vivo Mouse Ear Skin

Optical Monitoring of Living Nerve Terminal Labeling in Hair Follicle Lanceolate Endings of the Ex Vivo Mouse Ear Skin

Optisk övervakning av Living nervändsluten Märkning i hårsäcken lanceolate Endings av<em&gt; Ex vivo</em&gt; Mus Ear Skin

A novel dissection and recording technique is described for optical monitoring staining and de-staining of lanceolate terminals surrounding hair follicles ...

Olfactory Behaviors Assayed by Computer Tracking Of Drosophila in a Four-quadrant Olfactometer

Olfactory Behaviors Assayed by Computer Tracking Of Drosophila in a Four-quadrant Olfactometer

Lukt beteenden analyserades med dator Spårning av<em&gt; Drosophila</em&gt; I en fyra-kvadranten olfaktometem

A key challenge in neurobiology is to understand how neural circuits function to guide appropriate animal behaviors. Drosophila melanogaster is an ...

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

Genöverföring in vivo till Schwann-celler i gnagare ischiasnerven genom elektroporering

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

En enkel steg Dissection protokoll för hel-mount Framställning av Adult<em&gt; Drosophila</em&gt; Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

Visualisering av Axonal Projektionsmönstret av Embryonic Motor Neurons in<em&gt; Drosophila</em

The establishment of functional neuromuscular circuits relies on precise connections between developing motor axons and target muscles. Motor neurons ...

3D Kinematic Analysis for the Functional Evaluation in the Rat Model of Sciatic Nerve Crush Injury

3D Kinematic Analys för funktionell utvärdering i Rat Modell av Sciatic Nerve Crush Skada

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of ...